鼠抗人p63蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途的制作方法

文档序号:15802955发布日期:2018-11-02 21:35阅读:304来源:国知局

本发明涉及免疫学领域,特别涉及一种鼠抗人p63蛋白的单克隆抗体,以及该抗体的免疫组化用途。

背景技术

p63是p53家族成员之一,其家族成员还包括p73和p53,虽然p63被发现得较晚,但进化分析显示p73和p53均为p63的进化产物。p63含有3个保守结构域:转录激活域(ta)、dna结合域(dbd)和寡聚化结合域(od)。p63在结构上与p53高度同源,两者具有相似的信号通路诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期等功能,同时又各自拥有完全不同的生理学功能。人源p63基因位于染色体3q27-29,包含15个外显子,并含有2个启动子。根据启动子(转录起始点)的不同,可编码产生两种具有不同活性的异构体:一种为全长型的亚型蛋白tap63(n端具有ta),通过反式激活p53靶基因的转录,诱导细胞凋亡和衰老,最终起到p53样抑癌作用;另一种是n端缺少ta的截断型的亚型蛋白δnp63,可抑制tap63和p53的转录活性,促进细胞增殖,肿瘤发生。研究表明两种异构体均具有抑制恶性肿瘤转移的作用,在人体组织中广泛表达,且选择性地表达于肺、皮肤、骨骼、肌肉、乳腺、胸腺、淋巴细胞、神经组织、消化系统和泌尿生殖系统等,尤其在增生的上皮细胞内多见。因此,p63作为上皮组织干细胞的分子生物学标记,研究其在上皮组织来源的恶性肿瘤中的表达对于恶性肿瘤的致病机理及治疗预后具有重要的科学意义和临床价值。

近年来,病理学家将p63在上皮肿瘤组织中进行大样本分析,发现p63是宫颈上皮细胞被感染的标志之一,说明其在宫颈癌的发生和发展过程中起重要作用,提示p63有望成为宫颈癌及癌前病变的生物学标记。部分学者发现p63可能是一个有价值的诊断肺鳞癌和判断鳞癌分化程度的标记物。目前,国内外研发的p63抗体较少,特异性和亲和力方面均有待提高,因此亟待研发新的性能优异的抗p63单克隆抗体,填补国内本行业的空白,降低治疗费用,减轻病人负担。本发明研制出一种特异性高、表现稳定且效价高的抗p63蛋白的特异性单克隆抗体,可用于恶性肿瘤发生、进展和预后中p63相关的病理研究,为临床治疗提供新思路,具有一定的医学基础研究价值。本发明采用免疫组化(ihc)方法,建立基于所述p63单克隆抗体的免疫组织化学技术,用于上皮性恶性肿瘤的辅助诊断、治疗方案选择和预后,恶性肿瘤主要包括扁平细胞癌、宫颈癌、宫颈鳞癌、肺鳞癌、子宫内膜腺癌、胃癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤等。



技术实现要素:

基于以上所述的现有技术现状,本发明的目的为提供一种特异性好、表现稳定且效价高的抗p63蛋白的单克隆抗体,并建立基于所述p63单克隆抗体的免疫组织化学技术。

为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:

本发明所述p63单克隆抗体的制备方法如下:

(1)重组表达载体的构建:根据人p63基因的orf全序列(uniprot-q9h3d4),订购基因合成获得p63基因免疫源目标序列(p63核苷酸序列和氨基酸序列分别见序列表),基因两侧分别引入限制性内切酶位点nhei和xhoi,插入表达载体pdb-his-gst和pdb-his-mbp(加拿大应用生物材料有限公司,appliedbiologicalmaterialsinc.),构建p63重组表达质粒(p63-pdb-gst和p63-pdb-mbp)。前者p63-pdb-gst用以免疫实验动物,后者p63-pdb-mbp用以elisa筛选阳性克隆。

(2)p63重组蛋白的表达与纯化:将p63-pdb-gst重组表达质粒转化bl21de3star感受态细胞,裂解细胞后离心取上清,nickel柱纯化,获得纯化的p63重组蛋白。

(3)单抗的筛选与制备:采用上述纯化的p63-pdb-gst重组蛋白免疫balb/c小鼠,取小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合,有限稀释法获得单克隆,使用p63-pdb-mbp预铺的96孔板采用elisa法筛选阳性杂交瘤细胞,获得能分泌抗p63特异性抗体的杂交瘤细胞株;制备小鼠腹水,通过proteina柱层析纯化p63单抗。分别通过westernblot(结果见图1)和免疫组化实验(结果见图2)验证该单抗的特异性和灵敏度。

同时,本发明提供一种上述单克隆抗体在制备用于检测p63蛋白的免疫组化工具中的应用。

所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸条。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于检测上皮性恶性肿瘤的免疫组化用途。p63作为上皮组织干细胞的分子生物学标记,研究提示可能是一个有价值的诊断宫颈癌和肺鳞癌的生物学标记。因此,检测p63在肿瘤细胞的表达,对于机体上皮性恶性肿瘤的辅助诊断、治疗方案选择和预后具有重要的指导作用。

以使用leica的免疫组化自动染色机bondmax为例,应用该p63单克隆抗体进行免疫组化染色的条件为:

(1)使用机器自带的ihcprotocolf,将过氧化物酶封闭步骤由使用一抗前移至dab显色前;

(2)抗体使用终浓度为0.5μg/ml,室温孵育30min;

(3)抗原修复使用ph9.0的抗原修复液(er2),100℃加热孵育30min。

使用其他ihc自动染色机或进行手工染色时,请参照上述条件进行。

本发明所述的特异性单抗,可与p63蛋白特异结合,同时建立了基于该单克隆抗体的免疫组织化学技术,可用于上皮性恶性肿瘤的辅助诊断、治疗方案选择和预后,恶性肿瘤主要包括扁平细胞癌、宫颈癌、宫颈鳞癌、肺鳞癌、子宫内膜腺癌、胃癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤等。

附图说明

图1为本发明单克隆抗体的westernblot结果:m泳道为marker,1泳道为p63基因转染的293thek细胞裂解液,2泳道为p63基因转染的cho-k1细胞裂解液,3泳道为未转染的阴性对照293thek细胞裂解液。其中a图为使用本发明p63单克隆抗体检测的结果,b图为使用β-actin抗体检测的阳性对照的结果。

图2为以本发明单克隆抗体为一抗,免疫组化法检测甲状腺癌组织中p63蛋白的表达染色图。

具体实施方式

本发明公开一种特异性好、表现稳定且效价高的抗p63蛋白的单克隆抗体,以及检测肿瘤细胞p63蛋白的免疫组化用途。本领域技术人员可参考本文内容进行适当改进以实现和应用本发明的技术,但是类似的替换和改动应视为包括在本发明。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1抗p63单克隆抗体的制备

一、p63重组表达质粒的构建

根据uniprot报道的p63基因(uniprot-q9h3d4),订购基因合成获得p63基因免疫源目标序列,并在序列两端分别引入酶切位点nhei和xhoi,进而分别克隆入表达载体pdb-his-gst和pdb-his-mbp质粒,建立p63-pdb-gst和p63-pdb-mbp重组表达质粒,分别用于免疫实验动物和elisa筛选阳性克隆。

二、p63重组蛋白的表达与纯化

1、转化bl21de3star感受态细胞

使用上述构建的p63-pdb-gst和p63-pdb-mbp质粒分别转化到bl21de3star感受态细胞,预培养获得250ml细菌液,进一步将预培养液加入6l含卡那霉素(kanamycin)的lb培养液中,37℃培养至od值达0.8,使用0.5mm的iptg诱导表达,培养4h。

2、裂解细胞

离心获得细胞沉淀后,以溶液a(20mm磷酸钠,ph8.0,500mm氯化钠溶液)重悬细胞,超声破碎1minx6次。3000g/min离心15min沉淀细胞碎片,收集上清用于下一步纯化。

3、nickel柱层析纯化

以孔径为0.45μm,直径为33mm的pvdf膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15ml管。加入10ml溶液a与样本混合准备过柱纯化。nickel树脂反复颠倒混匀后,取3ml加入柱中,用溶液a清洗并平衡3次,静置使树脂自然沉积。加入样品,收集首次流出液。用溶液a清洗柱子5次,加入5倍体积预先配置的洗脱液(溶液a中加入250mm咪唑)。静置1min后收集洗脱液。

4.透析

由步骤3洗脱的样本采用1×pbs溶液透析,分两次完成透析,共用4l透析液。

三、单抗的筛选与制备

1、动物免疫:上述经过纯化的p63-pdb-gst重组蛋白以完全弗氏佐剂乳化,采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄balb/c小鼠,免疫剂量为50μg/只,间隔两周后进行第二次免疫,以不完全弗氏佐剂乳化,免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以elisa法梯度稀释测定血清效价;根据结果确定是否加强免疫,选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合:骨髓瘤细胞采用balb/c来源的sp2/0,融合时处于对数生长期;取上述免疫的小鼠脾脏,制成淋巴细胞单细胞悬液;免疫小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合,滴加37℃的50%peg(ph8.0)1ml,加入不完全培养基及其余终止液,离心弃上清后加入hat培养基悬浮混匀,mc定容到50ml,分装到3.5cm培养皿中,放于湿盒中,置于37℃、5%co2恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆:融合7-10天内挑选细胞克隆,使用上述纯化的p63-pdb-mbp重组蛋白进行elisa测试,标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释,每次有限稀释后5-6天测定elisa值,挑取od280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释,直至elisa测定96孔板全板结果为阳性。

4、腹水单抗的制备与纯化:10-12周龄的雄性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷,一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经pbs洗涤重悬的单克隆细胞悬液,细胞用量为5×106/只,每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水,离心取上清,proteina柱层析法进行腹水纯化,纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在-20℃。

以本发明单克隆抗体为一抗,对经过p63基因转染的293thek细胞和cho-k1细胞系的蛋白裂解液进行杂交、显色,其结果如图1所示,由图可见:该抗体成功检测p63基因,并呈现单一条带。

实施例2以本发明单克隆抗体为一抗的免疫组化实验

1、分别取24种不同类型的癌组织取样制作组织芯片,使用leicarm2235型组织切片机进行切片,切片厚度为4μm;

2、使用leicabondmax免疫组化自动染色机对本发明抗体进行免疫组化染色测试,使用机器自带的脱蜡与水化条件,具体步骤为:60℃孵育30min,应用脱蜡溶液(leica)洗3遍。抗原修复采用抗原修复液2(er2,leica),100℃孵育30min。一抗使用本发明抗体,采用抗体稀释液(leica)稀释到终浓度为0.5μg/ml,150μl。抗体室温孵育30min。使用配套的二抗(leica)150μl,室温孵育8min。使用多聚物检测液(leica)150μl,室温孵育8min。使用内源性过氧化物酶封闭液150μl室温孵育5min。使用dab显色液(leica)150μl,室温孵育10min。苏木素复染,室温孵育5min;

3、脱水和透明:去离子水清洗1min,95%乙醇1min,100%乙醇2minx2次,二甲苯2minx3次,中性树胶封片;

4、镜检,结果:部分肿瘤及正常上皮组织显示细胞核阳性染色,包括宫颈癌等,部分样本显示阴性无p63染色。其中甲状腺癌染色如图2所示,可见明显细胞核染色。染色模式正确,信号较强,未见明显非特异染色。

实施例3本发明单克隆抗体的特异性检测

应用本发明抗体采用elisa检测无关抗原预铺的96孔板(her-2),结果为阴性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式,应理解,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些等价形式也应视为本发明的保护范围。

<110>南京基诺米医疗科技有限公司

<120>鼠抗人p63蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途

<210>1

<211>2043

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

origin

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