一种钠离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器的制作方法

本发明涉及生物传感器技术领域，具体地说，涉及一种钠离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器。

背景技术

钠是一种金属元素，化学符号是na，原子序数是11，原子量是22.9898，属第ia族，是碱金属元素的代表，质地柔软，能与水反应生成氢氧化钠，放出氢气，化学性质较活泼。钠元素以盐的形式广泛的分布于陆地和海洋中，钠也是人体肌肉组织和神经组织中的重要成分之一。人体中钠的摄取主要是通过食物食盐摄取，缺了它就会饮食无味，还觉得软弱无力；但若长期摄入过多，则很容易影响健康，诱发疾病，例如使尿液中的蛋白质含量升高，引起肾上腺和脑组织释放一种使细胞兴奋性增加的因子，导致动脉收缩，血压升高。血压升高是导致心血管疾病的主要原因，大约62％的中风和49％的冠状动脉心脏病的主要病因是高血压。

目前，国内外检测钠离子含量的方法很多，如离子色谱法、火焰原子发射光谱法、火焰原子收法、流动注射技术和离子选择性电极相结合的方法等。应用这些方法测定钠离子含量的研究成果也有相应的报导，但操作繁琐、耗时长，而且需要专业的人员进行操作。因此，研究出简单快速、成本低廉、可准确定量的检测方法十分必要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种钠离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器。

为了实现本发明目的，发明人根据钠离子的特异性核酶，设计通用隔断引物对其进行超快聚合酶链式反应(superpolymerasechainreaction,spcr)，结合富g序列在k⁺存在条件下形成具有类过氧化物酶活性的g四链体，构建了一种新型的基于隔断引物的钠离子切割型功能核酸比色传感器。

第一方面，本发明提供一种钠离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器，包括：(1)切割体系，(2)spcr扩增体系，(3)hcr体系，(4)包含abts显色液的检测体系。

所述检测体系用于对待测样品依次经由所述切割体系、spcr扩增体系和hcr体系进行反应后所得产物进行显色检测；

其中，所述切割体系包括底物链和酶链：

底物链：5′-ctctatctatra-ggaagtaccgccgc-3′

酶链：5′-gcggcggtaccaggtcaaaggtgggtgaggggacgccaagagtccccgcggttagatagag-3′

其中，ra表示核糖核酸；-表示钠离子切割位点；

所述spcr扩增体系包括：正向隔断引物、反向引物、模板：

正向隔断引物：5′-agacgaagcactggttgaaactcc-阻断物-ggagtttcaaccagtgcttcgtcttcatcgcaccgtcaaaggaacc-3′

反向引物：5′-ggaagtaccgccgcggaggga-3′

模板：5′-tcatcgcaccgtcaaaggaacctcagtatcagtgctatacgtcgatcagtagccccgaatttcgccatcttcctccctccgcggcggtacttcc-3′

所述hcr体系包括2条探针：

探针1：5′-agggcgggtgggtggagtttcaaccagtgcttcgtctccccagacgaagcactggttgatgggt-3′

探针2：5′-tgggtagacgaagcactggttgaaactcctcaaccagtgcttcgtctggggtgggtagggcggg-3′。

其中，所述正向隔断引物中的隔断物为聚六乙二醇。

所述dna聚合酶为extaqdna聚合酶，所述缓冲液为10×extaqbuffer，二者与所述dntp均购自赛默飞科技(thermoscientificlifetechnologies)。

本发明所述的检测体系包括：酶活缓冲液，氯高铁血红素溶液。

其中，所述酶活缓冲液为：100mmtris、120mmnacl、10mmmgcl2、100mmkcl，ph8.4。

所述氯高铁血红素溶液为20mm的氯高铁血红素原液与上述酶活缓冲液按照2μl：1ml的比例混合后的氯高铁血红素稀释溶液。

本发明还提供前述传感器在检测钠离子方面中的应用，所述检测可表现为定性检测或定量检测。

第二方面，本发明提供了一种利用前述传感器对钠离子进行定性检测的方法，包括如下步骤：

s1、向所述切割体系中加入待测样品，进行切割反应；

s2、将s1所得切割产物加入所述spcr扩增体系中进行超快聚合酶链式反应，得spcr产物；

s3、将所述spcr产物加入所述hcr体系中进行hcr反应，得hcr产物；

s4、利用所述检测体系对所述hcr产物进行检测。

s1具体如下：将底物链与酶链按等摩尔比例混合，用缓冲液稀释至浓度1μm-2μm，85℃-95℃加热15min，然后降温至25-37℃，得到核酶液；向35μl所述核酶液中加入待测样品溶液，形成40μl体系，于36-38℃孵育4-6min，然后加入4-6μl终止液，得到切割产物。

进一步地，所述检测体系包括酶活缓冲液和氯高铁血红素稀释溶液，将酶活缓冲液、氯高铁血红素稀释溶液和hcr产物按体积比为8:1:1混匀(总体积为100μl)，在35-38℃条件下反应20-40min，加入与前述混合物等体积的abts显色液，混匀，35-38℃避光孵育，肉眼进行监测。

第三方面，本发明提供了一种利用前述传感器对钠离子进行定量检测的方法，包括如下步骤：

si、制作标准曲线：

利用已知浓度的钠离子溶液，构建具有不同钠离子浓度的切割体系，spcr扩增、hcr反应与检测步骤与前述定性检测的步骤相同；

以钠离子浓度为横坐标，以od415值为纵坐标，绘制标准曲线；

sii、按照前述定性检测方法对待测样品进行检测，将测得的od415值代入标准曲线，计算得到待测样品中钠离子的含量，实现对钠离子的定量检测。

本发明提供一种基于生物传感器技术检测钠离子的方法，首先设计钠离子特异性核酶，包括底物链和酶链，将底物链与酶链进行杂交形成具有特异性钠离子切割活性的核酶，当钠离子存在的条件下发生切割反应，切割下来的核酸片段作为反向引物(即目标引发分子)，与正向隔断引物一起对模板进行pcr扩增反应，所得pcr产物的一端带有一段单链核酸序列；所述pcr产物在k⁺存在条件下，形成g四链体，催化h2o2和abts显色，进而完成对钠离子的快速可视化检测；或者

通过pcr产物促发hcr反应，使得hcr产物在k⁺存在条件下形成g四链体，催化h2o2和abts显色，进而完成对钠离子的快速可视化检测。

本发明中，显色液可用tmb替代。

所述底物链和酶链的碱基序列如下：

底物链：5′-ctctatctatra-ggaagtaccgccgc-3′

酶链：5′-gcggcggtaccaggtcaaaggtgggtgaggggacgccaagagtccccgcggttagatagag-3′

其中，ra表示核糖核酸；-表示钠离子切割位点；

所述正向隔断引物的5′端具有发夹结构，两段反向互补碱基序列之间至少设有一阻断物，所述阻断物可阻断pcr延伸。

优选地，所述正向隔断引物的发夹结构上具有富g碱基序列。当所述正向隔断引物的发夹结构上设计有富g碱基序列时，则无需借助hcr反应，即可实现对钠离子的快速可视化检测。如，所述正向隔断引物为：

5′-gtgggtagggcgggttgg-阻断物-ccaacccgccctacccactcatcgcaccgtcaaaggaacc-3′

前述的方法，hcr的反应体系中至少含有一条带发夹结构的探针，所述发夹结构的碱基组成与所述正向隔断引物发夹结构的碱基序列基本相同，使得所述pcr产物能够促发hcr反应。

优选地，所述底物链的3′端添加有一段可增加所述反向引物与模板结合tm值的碱基序列，使得pcr退火温度控制在50-60℃。

优选地，所述阻断物为聚六乙二醇。

前述的方法，钠离子检测中所用的底物链、酶链、正向隔断引物、反向引物、模板和2条探针的碱基序列如下(seqidno:1-7)：

底物链：5′-ctctatctatra-ggaagtaccgccgcggaggga-3′

酶链：5′-gcggcggtaccaggtcaaaggtgggtgaggggacgccaagagtccccgcggttagatagag-3′

正向隔断引物：5′-agacgaagcactggttgaaactcc-聚六乙二醇-ggagtttcaaccagtgcttcgtcttcatcgcaccgtcaaaggaacc-3′

反向引物：5′-ggaagtaccgccgcggaggga-3′

模板：5′-tcatcgcaccgtcaaaggaacctcagtatcagtgctatacgtcgatcagtagccccgaatttcgccatcttcctccctccgcggcggtacttcc-3′

探针1：5′-agggcgggtgggtggagtttcaaccagtgcttcgtctccccagacgaagcactggttgatgggt-3′

探针2：5′-tgggtagacgaagcactggttgaaactcctcaaccagtgcttcgtctggggtgggtagggcggg-3′

其中，ra表示核糖核酸；-表示钠离子切割位点。

本发明还提供与上述方法配套的检测试剂盒，所述试剂盒至少包括以下成分：底物链、酶链、正向隔断引物、模板、探针1和探针2等。

本发明试剂盒的检测分析原理：首先将底物链与酶链进行杂交形成具有特异性钠离子切割活性的核酶，当钠离子存在的条件下发生切割反应，切割下来的核酸片段可以与模板结合进行pcr延伸，由于引物的隔断作用阻碍了聚合酶的延伸，使得pcr产物是带有促发hcr的特定序列，hcr产物在适宜的缓冲条件下(缓冲液中含有k⁺)形成g四链体，催化h2o2和abts显色，进而完成对钠离子的快速可视化检测。

具体检测方法如下：

1)核酶的构建：将底物链与酶链按等摩尔比例混合，用缓冲液稀释至浓度1-2μm，85-95℃加热15min，然后缓慢降至25-37℃(大约耗时45min)，即得核酶液；

2)切割反应：向35μl上述核酶液中加入待测样品溶液，形成40μl体系，于36-38℃孵育6min，然后加入4-6μl终止液，得到切割产物；

3)超速pcr反应：配制由正向隔断引物、切割产物、模板、dna聚合酶、dntp、反应缓冲液和ddh2o组成的pcr反应体系，设置如下反应程序：90-95℃2s，55-60℃3s，30-40个循环，进行pcr反应，得到pcr产物；

4)hcr反应：构建由探针1、探针2、pcr产物和自组装缓冲液组成的hcr反应体系，于37℃反应30-60min，得到hcr产物；

5)显色反应：将80μl酶活缓冲液、10μl氯高铁血红素溶液与10μlhcr产物混合，于37℃反应30min，使hcr产物结合氯高铁血红素形成具有类过氧化物酶活性的g四链体结构，加入100μlabts显色液，混匀，37℃避光孵育5-10min，根据加入显色液前后溶液颜色的变化来判断待测样品中是否含有钠离子以及钠离子浓度的高低。可通过肉眼直接观察溶液颜色的变化，或利用酶标仪测定溶液的od值变化。

其中，步骤1)所述缓冲液的配方为：50mmmes,ph6.0，25mmlicl。

步骤2)所述终止液的配方为：0.2medta，2mnacl,0.5mtris。

步骤4)所述自组装缓冲液的配方为：8mmna2hpo4,2.5mmnah2po4,0.15mnacl,2mmmgcl2,ph7.4。

步骤5)所述酶活缓冲液的配方为：100mmtris、120mmnacl、10mmmgcl2、100mmkcl，ph8.4。

步骤5)所述氯高铁血红素溶液的配制方法为：用dmso配制浓度为20mm的氯高铁血红素原液，将2μl氯高铁血红素原液与1ml所述酶活缓冲液混合，即得。

优选地，步骤3)中pcr反应体系如下：

步骤4)中hcr反应体系的构建方法如下：

①将探针1、探针2分别用水溶解至100μm，于90-95℃加热5min，然后缓慢降至室温备用；

②将pcr产物加入终浓度为2-3μm的探针1和探针2的混合液中，并加入自组装缓冲液至总体积50μl。

配制一系列浓度的钠离子标准溶液，按照上述方法进行检测。步骤5)利用酶标仪测定溶液od415值来判断显色情况，并根据溶液颜色变化绘制显色的标准曲线：y＝0.005x-0.031，r²＝0.992，从而可实现对钠离子的定量检测。

本方法的钠离子检测限是20-200nm。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供了一种切割型快速检测钠离子的系统及方法，通过巧妙地设计引物、模板及探针，使得在钠离子存在下可对模板进行超快扩增，将耗时3小时左右的传统pcr过程缩减到10分钟，显著减少了pcr反应的用时。进一步结合g四链体的类过氧化物酶活性进行显色，解决了传统pcr产物难于可视化检测的难题，实现了对钠离子的快速、可视化检测。

不仅如此，本发明所提供的系统与方法对钠离子具有高特异、高灵敏的特点，检测结果更加客观、准确。

本发明通过建立一种隔断快速扩增钠离子切割型功能核酸比色传感器，用于钠离子的快速可视化检测。根据钠离子的特异性核酶，设计隔断引物对其进行超快聚合酶链式反应，结合富g序列在k⁺存在条件下形成具有类过氧化物酶活性的g四链体，构建了一种新型的基于通用隔断引物的钠切割型功能核酸比色传感器，并提供了一种快速、可视的钠离子检测新方法。使样品的检测时间大大缩短，检出限达nm级，而且本发明成功解决了pcr产物的可视化问题，对解决现场实时快速检测具有重要的现实意义。

(一)本方法首次构建了隔断引物，对模板进行超快扩增，将耗时3小时左右的传统pcr过程缩减到10分钟，显著减少了pcr反应的用时。

(二)引物的隔断作用阻碍了聚合酶的延伸，获得单链核酸序列。可以促发hcr反应，使得产物在适宜的条件下(缓冲液中含有k⁺)形成具有类过氧化物酶活性的g四链体。

(三)pcr产物或hcr产物与abts发生颜色变化，解决了传统pcr产物难于可视化检测的难题。

(四)本方法可实现钠离子的大批量、快速检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中钠离子核酶制备并切割验证的结果；其中，泳道1：核酶-na；泳道2-4：切割体系。

图2为本发明实施例1中超速pcr仪的外观结构。

图3为本发明实施例1中超速pcr扩增产物的胶图；其中，泳道1：dnamarker2000；泳道2-3：钠离子超速pcr产物。

图4为本发明实施例1中根据不同浓度钠离子及溶液颜色变化绘制显色的标准曲线。

图5为本发明实施例2中生物传感器特异性检测结果。

图6为本发明实施例4中hcr反应时间优化实验结果；其中，m：dnamarker2000；1:阴性；2：2μmhairpin1；3：2μmhairpin2；4：2μmhairpin1+2μmhairpin2；5-6：30min；7-8：1h；9-10：1.5h；11-12：2h。

图7为本发明实施例5中发夹探针序列优化实验结果；其中，m：dnamarker2000；1-4是组3；5-8是组2；9-12是组1；第1组点样顺序从左至右依次为：500nmhairpin1；500nmhairpin2；500nmhairpin1+500nmhairpin2；500nmhairpin1+500nmhairpin2+促发子。第2组点样顺序从左至右依次为：500nmhairpin3；500nmhairpin4；500nmhairpin2+500nmhairpin3；500nmhairpin2+500nmhairpin3+促发子。第3组点样顺序从左至右依次为：500nmhairpin4；500nmhairpin5；500nmhairpin4+500nmhairpin5；500nmhairpin4+500nmhairpin5+促发子。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中，abts显色液的配方为：1mldnazyme底物缓冲液，柠檬酸0.933g，蒸馏水100ml，5μlabts底物溶液，1μl30％h2o2。

dnazyme底物缓冲液：即为ph3.6的柠檬酸盐缓冲液，配方为：na2hpo4.12h2o1.843g，柠檬酸0.933g，蒸馏水100ml。

abts底物溶液：取20mg2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐粉末(购自sigma公司)溶于1mldmso，即得。

实施例1钠离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器的建立

1、实验材料

sybrgold核酸染料、核酸分子量标准ultra-lowrangednaladder、dntp、extaqdna聚合酶、10×taqbuffer、氯高铁血红素、氯化钠、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐(abts)、h2o2、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、mes、licl、tris、乙二胺四乙酸二钠，四甲基联苯胺，尿素，均购自赛默飞科技(thermoscientificlifetechnologies)。实验用水均来自milli-q纯水系统。

序列设计如下(seqidno:1-7)：

注：核酶切割目标产物和扩增模板3’端序列互补；

核酶底物链末端所添加的加粗碱基序列是为了增加与模板结合tm值；切割位点用“-”表示；

17ev1核酶底物链-na和核酶酶链-na共同组成钠离子的特异性核酶(核酶-na)。

2、核酶的构建及切割反应体系的验证

将4μl核酶底物链-na(10μm母液)与4μl核酶酶链-na(10μm母液)用缓冲液(终浓度为50mmmes,ph6.0，25mmlicl)稀释至40μl，95℃加热15min，然后缓慢降至37℃，大约耗时45min。

加入5μl氯化钠溶液标准样品(1μm母液)，形成40μl体系，于37℃下孵育6分钟，在40μl体系中加入5μl终止液(浓度为0.2medta，2mnacl,0.5mtris)，混匀后4℃保存。用20％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，得到钠离子核酶切割后的小片段，证明钠离子核酶的制备与切割成功(图1)。

3、超速pcr装置的搭建以及超速pcr反应体系的建立与验证

超速pcr装置的主要结构如图2所示，其具体的结构、连接方式和工作原理、工作过程包括：超速pcr装置的温度变化经由一个95℃的高温水浴锅和一个58℃的中温水浴锅来实现。采用lightcycler型号的毛细管(20μl，04929292001，roche)作为pcr样品室。通过快速离心的方式，样品会分别聚集到各个毛细管一端；离心完成后带有样品的毛细管被固定在一个专用的塑料支架上。

钠离子超速pcr体系如下：

在实际检测中，切割产物是指上述切割反应体系中，用待测样品替换标样。

在冰上配制10μl反应体系，迅速置于超速pcr反应装置中进行温度控制。超速pcr反应程序：95℃2s，58℃3s，36个循环，总计3min。

完成超速pcr反应过程，使用2％琼脂糖凝胶电泳验证超速pcr反应体系的扩增效果，反应条件：120v0.5h，拍照系统：molecularimagergeldocxr(bio-rad)。

实验结果表明，在切割产物存在时可以使模板在短时间内进行扩增(图3)。

4、pcr产物自组装

发夹探针hairpin1，hairpin2分别用超纯水溶解至100μm，于95℃加热5min，然后缓慢降至室温，备用；按照超速pcr反应体系和反应程序完成超速pcr反应，将超速pcr反应产物加入终浓度为2μm的hairpin1和hairpin2混合液中,并加入自组装缓冲液(8mmna2hpo4,2.5mmnah2po4,0.15mnacl,2mmmgcl2,ph7.4)，使得每个反应体系的总体积为50μl，37℃，30min，进行hcr反应。

5、显色模块的建立与验证

80μl酶活缓冲液(100mmtris、120mmnacl、10mmmgcl2、100mmkcl，ph8.4)，10μl氯高铁血红素溶液与10μlhcr产物，混匀后37℃反应30min，使hcr产物结合氯高铁血红素形成具有类过氧化物酶活性的g四链体结构，加入100μlabts显色液，混匀，37℃避光孵育10min，酶标仪测定od415。

所述氯高铁血红素溶液的配制方法为：用dmso配制浓度为20mm的氯高铁血红素原液，将2μl氯高铁血红素原液与1ml所述酶活缓冲液混合，即得。

6、钠离子超灵敏、可视化的快速检测

根据上述优化体系，分别加入不同浓度的20、60、90、150、200nm的na⁺的切割产物进行超快pcr，将pcr进行自组装，在适宜的缓冲条件下进行显色，根据颜色变化绘制显色的标准曲线(图4)。

na⁺检测范围是20-200nm(可在此范围内实现定量检测)，最低检出限是3.6nm。

实施例2传感器的的特异性考察

按照实施例1构建的生物传感器，分别将100nmna⁺、10μm的ag⁺、mg²⁺、zn²⁺、cd²⁺、hg²⁺、cr³⁺加入到体系中进行检测，结果表明，所建立的na⁺生物传感器具有较好的特异性(图5)。

实施例3加标实验

取高纯水用实施例1构建的生物传感器进行检测，na⁺无检出，对其进行加标实验，连续测定多次所得结果见表1。

表1na⁺加标回收实验结果

实施例4hcr反应时间的优化

按照实施例1构建的生物传感器，将探针1、探针2分别用水溶解至100μm，于95℃加热5min，然后缓慢降至室温备用；将pcr产物加入终浓度为2μm的探针1和探针2的混合液中，并加入自组装缓冲液至总体积50μl。hcr反应时间分别是30min、1h、1.5h、2h。结果见图6，由图6可以看出，30min内就可以形成足够的长双链，因此确定反应时间为30min。

实施例5hcr反应中发夹探针序列的优化

按照实施例1构建的生物传感器，设计如下发夹探针组合实验组(表2)。所用促发子的碱基序列如下：5′-agacgaagcactggttgaaactcc-3′。

表2

结果见图7，由图7可以看出，实验组1促发hcr的效果最好，因此本发明选择将发夹探针组合hairpin1+hairpin2作为hcr促发序列。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种钠离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器

<130>khp181111301.7

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ctctatctataggaagtaccgccgcggaggga32

<210>2

<211>61

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcggcggtaccaggtcaaaggtgggtgaggggacgccaagagtccccgcggttagataga60

g61

<210>3

<211>70

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

agacgaagcactggttgaaactccggagtttcaaccagtgcttcgtcttcatcgcaccgt60

caaaggaacc70

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ggaagtaccgccgcggaggga21

<210>5

<211>94

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tcatcgcaccgtcaaaggaacctcagtatcagtgctatacgtcgatcagtagccccgaat60

ttcgccatcttcctccctccgcggcggtacttcc94

<210>6

<211>64

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

agggcgggtgggtggagtttcaaccagtgcttcgtctccccagacgaagcactggttgat60

gggt64

<210>7

<211>64

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

tgggtagacgaagcactggttgaaactcctcaaccagtgcttcgtctggggtgggtaggg60

cggg64