本发明属于植物病毒接种技术领域，尤其涉及一种花生条纹病毒的接种方法。
背景技术：
目前，花生条纹病毒在我国长江以北花生产区普遍发生，在病毒类病害中，花生条纹病毒对我国花生产业的影响最为严重，为花生生产的重要防控对象。花生条纹病毒高效接种是花生条纹病毒种质培育和抗病机制研究的重要基础，是实现花生条纹病毒高效防控的关键。
机械摩擦接种是目前常用的花生条纹病毒的接种方法，这种方法一般采用接种时先在花生叶片上喷洒金刚砂完成。但是，机械摩擦接种需要较多的感病毒材料，且金刚砂的用量不好控制。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种简单、高效的花生条纹病毒接种方法，以少量的感病毒材料即可完成高效的接种，实现花生条纹病毒高效防控，为花生条纹病毒种质培育和抗病机制研究提供重要基础。
为了达到上述目的，本发明提供了一种花生条纹病毒接种方法，包括以下步骤：
取被花生条纹病毒侵染的病毒叶片，依次加入磷酸盐缓冲液、金刚砂，研磨至匀浆；
取上述匀浆置于待接种的已长出两个羽状复叶的花生叶片上，轻轻涂抹数次，清水冲洗。
作为优选，所述磷酸盐缓冲液的ph值为7.2-7.4。
作为优选，所述被花生条纹病毒侵染的病毒叶片的保存温度为-80～-60℃。
作为优选，所述1g花生病毒叶片中加入30～50ml磷酸盐缓冲液。
作为优选，所述花生病毒叶片与金刚砂的质量比为1:1～4:1。
作为优选，所述匀浆的用量为40～60μl，所述涂抹数次为2～3次。
与现有技术相比，本发明提供了一种简单、高效的花生条纹病毒接种方法，该方法省略了接种前在植株上喷洒金刚砂的步骤，而是将金刚砂同病毒叶片及磷酸盐缓冲液一起配制成匀浆，以少量的病毒叶片即可完成高效的接种。该方法提高花生条纹病毒的接种速度和接种效率，有利于快速高效的鉴定花生对条纹病毒的抗性，加快抗病育种选育和病毒致病机理研究。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种花生条纹病毒的接种方法，包括以下步骤：
s1：取被花生条纹病毒侵染的病毒叶片，依次加入磷酸盐缓冲液、金刚砂，研磨至匀浆。
在该步骤中，被花生条纹病毒侵染的病毒叶片通过以下方式采集：
用打孔器采集被花生条纹病毒侵染的花生新鲜叶片，得到圆形、直径为0.9cm的病毒叶片。
该步骤采用磷酸盐缓冲液的原因在于磷酸盐缓冲液具有盐平衡、可调整的适宜ph缓冲作用，优选ph值为7.2-7.4；金刚砂的加入主要为了在摩擦过程中制造伤口，使病毒能够有侵染途径，另外，在配制匀浆的过程中加入金刚砂，有利于使病毒叶片研磨的更加均匀，使寄生在病毒叶片细胞中的病毒能够更加充分地释放出来。
s2：取上述匀浆置于待接种的已长出两个羽状复叶的花生叶片上，轻轻涂抹数次，清水冲洗。
在该步骤中，选用长出两个羽状复叶的花生叶片作为接种对象的原因在于该时期的花生处于幼苗期，接种效率高。
在一优选的实施例中，所述被花生条纹病毒侵染的病毒叶片的保存温度为-80～-60℃。本实施例中，具体限定了病毒叶片的保存温度，这该温度范围内，有利于病毒叶片中病毒的存活。可以理解的是，该温度还可以是-75℃、-70℃、-65℃或上述范围内的任意点值。
在一优选的实施例中，所述1g花生病毒叶片中加入30～50ml磷酸盐缓冲液。本实施例中，具体限定了花生病毒叶片与磷酸盐缓冲液的加入比例，可以理解的是，磷酸盐缓冲液的量还可以是35ml、40ml、45ml或上述范围内的任意点值。
在一优选的实施例中，所述花生病毒叶片与金刚砂的质量比为1:1～4:1。本实施例中，具体限定了花生病毒叶片与金刚砂的质量比，这样有利于控制金刚砂的用量，且在摩擦的过程中制造足够适量的伤口，提高接种效率。可以理解的是，花生病毒叶片与金刚砂的质量比还可以是2:1、3:1或上述范围内的任意点值比。
在一优选的实施例中，所述匀浆的用量为40～60μl，所述涂抹数次为2～3次。在本实施例中，具体限定了匀浆的用量及涂抹次数，这样有利于控制匀浆的用量，提高接种效率。可以理解的是，匀浆的用量还可以是45μl、50μl、55μl或上述范围内的任意点值。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的花生条纹病毒的接种方法，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1
用打孔器采集被花生条纹病毒侵染的新鲜花生叶片，得到圆形、直径为0.9cm的病毒叶片，置于1.5ml离心管，-70℃保存；
播种花生，待长出两个羽状复叶后接种；
取0.02g病毒叶片，依次加入800μlph为7.2的磷酸盐缓冲液、0.01g金刚砂，用7.5cm研磨棒将感病花生叶片研磨至匀浆。其中，病毒叶片与磷酸盐缓冲液的加入比例为1g病毒叶片加入40ml磷酸盐缓冲液，病毒叶片与金刚砂的加入比例为2:1；
取50μl匀浆置于待接种的花生叶片上，沿一个方向轻轻涂抹3次，喷清水冲洗。
实施例2
花生条纹病毒的接种方法同实施例1相同，不同之处在于，磷酸盐缓冲溶液的ph值为7.3，病毒叶片与金刚砂的加入比例为1:1。
实施例3
花生条纹病毒的接种方法同实施例1相同，不同之处在于，磷酸盐缓冲溶液的ph值为7.4，病毒叶片与金刚砂的加入比例为3:1。
实施例4
花生条纹病毒的接种方法同实施例1相同，不同之处在于，病毒叶片的保存温度为-80℃，匀浆的用量为40μl。
实施例5
花生条纹病毒的接种方法同实施例1相同，不同之处在于，病毒叶片的保存温度为-60℃，涂抹次数为2次。
实施例6
花生条纹病毒的接种方法同实施例1相同，不同之处在于，病毒叶片与金刚砂的加入比例为4:1，匀浆用量为60μl。
实施例7
花生条纹病毒的接种方法同实施例1相同，不同之处在于，病毒叶片与磷酸盐缓冲液的加入比例为1g病毒叶片加入30ml磷酸盐缓冲液，涂抹次数为3次。
实施例8
花生条纹病毒的接种方法同实施例1相同，不同之处在于，病毒叶片与磷酸盐缓冲液的加入比例为1g病毒叶片加入50ml磷酸盐缓冲液。
对比例1
用打孔器采集被花生条纹病毒侵染的新鲜花生叶片，得到圆形、直径为0.9cm的病毒叶片，置于1.5ml离心管，-70℃保存；
播种花生，待长出两个羽状复叶后接种；
取0.02g病毒叶片，加入800μlph为7.2的磷酸盐缓冲液，用7.5cm研磨棒将感病花生叶片研磨至匀浆。其中，病毒叶片与磷酸盐缓冲液的加入比例为1g病毒叶片加入40ml磷酸盐缓冲液；
取金刚砂，将其喷洒在待接种的花生叶片上，取100μl匀浆置于待接种的花生叶片上，沿一个方向轻轻涂抹3次，喷清水冲洗。
性能测试
按照本发明实施例1-8以及对比例1的接种方法分别接种10株花生，相关接种效果数据见表1。
由表1数据可知，实施例1-8采用本发明的花生条纹病毒接种方法接种的花生发病率比对比例1采用传统接种方法接种的花生发病率高，且本发明省略了接种前在植株上喷洒金刚砂的步骤，而是将金刚砂同病毒叶片及磷酸盐缓冲液一起配制成匀浆，以少量的病毒叶片即可完成高效的接种，从而可快速高效的鉴定花生对条纹病毒的抗性。