本发明属于生物技术领域，具体涉及一种gii.6型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。
背景技术：
诺如病毒是全球急性胃肠炎的重要非细菌性病原，可感染各年龄段人群。诺如病毒感染属于自限性疾病，一般72小时内患者就会自愈，然而对于婴幼儿、老人及免疫缺陷人群会具有脱水性死亡的危险。此外，诺如病毒极易引起疫情暴发，在学校、医院、养老院、大型轮船等半封闭环境，24内就会感染其中所有易感人群。据报道，该病毒每年造成约2.3亿人次感染，在发达国家每年需花费数十亿美元用于相关治疗，而在发展中国家尤为严重，至少导致20万例5岁以下儿童的死亡。诺如病毒对公共卫生安全造成了极大的威胁，但至目前为止，还没有有效的抗病毒药物及治疗手段。
作为rna病毒，诺如病毒具有丰富的遗传多样性，根据其衣壳蛋白vp1的氨基酸序列，可以被分为六个基因组(genogroup)gi-gvi，其中gi、gii和gvi可以感染人类。同一基因组内的诺如病毒还可以进一步分成不同的基因型，例如gi包括了至少9种基因型，gii包括了22种基因型。gii.4型诺如病毒是全球的主要流行基因型，约80％的诺如病毒感染是由该型别毒株引起的。然而，其他基因型也在病毒监测过程中被发现，例如gii.2型、gii.3型、gii.6型等，并且还会导致疫情的暴发。然而这些非主要流行基因型仍较少关注，因此，加强不同基因型诺如病毒的信息收集工作具有重要意义。
gii.6型诺如病毒在我国临床监测中往往以低感染率被检出，包括广州、北京、上海、重庆、天津、杭州等地，2008-2009年度在日本该病毒被发现是造成急性胃肠炎的第二大基因型。然而目前关于gii.6型诺如病毒的主要衣壳蛋白vp1及基因组等遗传信息却仍非常有限。目前最早的gii.6毒株是发现于1974年塞内加尔，其后在美国、英国、日本等地均有报道。有学者对gii.6型毒株ueno7k和445的受体结合能力展开研究，发现它能够结合包括h、a、b抗原在内的所有分泌型血型抗原，在其衣壳蛋白上的t362、r363、a364、h365、d391、g452、g453等受体结合位点呈现出明显的保守性，表明具有感染广大宿主人群的致病潜力。我们前期工作中针对gii.6型诺如病毒的进化研究发现，该型别病毒与主要流行基因型gii.4存在明显的进化差异，前者并未体现出明显的事件相关进化特征。病毒遗传信息的积累是深入研究病毒致病及进化机制的重要基础，因此开展病毒基因组扩增与测序方法具有重要意义。
近年来，尽管人源诺如病毒体外培养方面的研究有了突破性进展，但是合适的复制体系仍然缺乏；尤其是诺如病毒极易变异，因此，持续监测病毒流行水平及变异情况仍是认识病毒的重要基础。基因组信息的获得为诺如病毒研究提供了重要的基础数据。诺如病毒基因组长约7.5-7.8kb，包括3个开放阅读框。我们前期工作中针对gii.4型、gii.17型诺如病毒以及gii.p12/gii.3重组型诺如病毒建立的“4+1+1”扩增策略具有操作简单、周期短、成本低以及灵敏度高的特点，因此，根据这种新颖的扩增策略，我们研发了一种针对gii.6型诺如病毒的基因组扩增引物和扩增方法，为积累我国gii.6型诺如病毒基因组资源提供了一个有力的研究工具。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种gii.6型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。
具体地，本发明提供的gii.6型诺如病毒基因组的扩增引物，包括六对扩增引物和两条基因组末端的测序引物：
引物对1：ii-1f：5'-gtgaatgaagatggcgtctaac-3'；
ii.6-1r：5'-cccctgtargcrtccca-3'；
引物对2：ii.6-2f：5'-tcatcctcrccrgacatcgt-3'；
ii.6-2r：5'-tcctcttcacagaagtcctc-3'；
引物对3：ii.6-3f：5'-cacacagcyttctccagyaa-3'；
ii.6-3r：5'-cttgcyttcatrctrtccat-3'；
引物对4：ii.6-4f：5'-gaagargcyaaaaagacagt-3'；
g2skr：5'-ccrccngcatrhccrttrtacat-3'；
引物对5：ii-5f：5'-ggagggcgatcgcaatc-3'；
ii-5r：5'-ccrgcraagaaagctccagccat-3'；
引物对6：ii.6-6f：5'-tcacygtggchaattctgg-3'；
ii.6-6r：5'-cctaatcamtcttttcac-3'；
测序引物：ii.6-seq1r：5'-aattcaccatcccacatctc-3'；
ii.6-seq6f：5'-tttgtcacaccaccatcg-3'。
r代表a/g，h代表a/c/t，n代表碱基a/c/t/g，y代表c/t，m代表a/c。
本发明还提供一种gii.6型诺如病毒基因组的扩增方法，具体为：分别以上述的引物对ii-1f/ii.6-1r、ii.6-2f/ii.6-2r、ii.6-3f/ii.6-3r、ii.6-4f/g2skr、ii-5f/ii-5r、ii.6-6f/ii.6-6r作为扩增引物的上下游引物，以gii.6型诺如病毒的rna为模板进行rt-pcr扩增，分别得到扩增产物，然后采用以上每对扩增引物和测序引物ii.6-seq1r、ii.6-seq6f分别对相对应的扩增产物进行核酸序列测序，再通过拼接比对，获得gii.6型诺如病毒基因组全长序列。
进一步地，所述的rt-pcr，其反应体系为：含有2×one-steprt-pcrmixture10μl，10μmol/l上游引物和10μmol/l下游引物各0.6μl，mlv/rnasin/hs-taq酶混合液0.8μl，rna模板2μl，其余由双蒸水补足至20μl；反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃75s，共30次循环后，最后72℃延伸7min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明针对常见的gii.6型诺如病毒基因型，采用覆盖整个基因组的“4+1+1”的分段扩增策略，通过应用于实际检出样本的扩增、测序及序列拼接，从而获得gii.6型诺如病毒基因组序列。利用本发明提供的引物对gii.6型诺如病毒进行扩增和测序的方法具有操作简单、周期短、成本低以及灵敏度高等特点，可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病毒检测需求的机构以及相应的科研领域。
附图说明：
图1为gii.6型诺如病毒基因组扩增策略与相应引物的设计位置。
图2为适用于gii.6型诺如病毒基因组扩增用引物的rt-pcr退火温度优化，电泳顺序为m，1-24，其中m为dnaladder，1-4、5-8、9-12、13-16、17-20、21-24分别为基因组扩增引物ii-1f/ii.6-1r、ii.6-2f/ii.6-2r、ii.6-3f/ii.6-3r、ii.6-4f/g2skr、ii-5f/ii-5r、ii.6-6f/ii.6-6r在不同退火温度(依次为45℃、50℃、55℃、60℃)下扩增产物的电泳结果。
图3为适用于gii.6型诺如病毒基因组扩增的rt-pcr引物浓度优化，图a-图f分别为引物ii-1f/ii.6-1r、ii.6-2f/ii.6-2r、ii.6-3f/ii.6-3r、ii.6-4f/g2skr、ii-5f/ii-5r、ii.6-6f/ii.6-6r的优化结果，电泳顺序为m，1-9，其中m为dnaladder，1-3为0.2μl引物分别扩增以rna原液、rna原液稀释10倍、rna原液稀释100倍为模板的电泳结果，4-6为0.6μl引物分别扩增以rna原液、rna原液稀释10倍、rna原液稀释100倍为模板的电泳结果，7-9为1.0μl引物分别扩增以rna原液、rna原液稀释10倍、rna原液稀释100倍为模板的电泳结果。
图4为gii.6型诺如病毒基因组扩增用引物的rt-pcr灵敏度评价，电泳顺序为m，1-35，其中m为dnaladder，1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35分别为基因组扩增引物ii-1f/ii.2-1r、ii.6-2f/ii.6-2r、ii.6-3f/ii.6-3r、ii.6-4f/g2skr、ii-5f/ii.5r、ii.6-6f/ii.6-6r和检测引物g2skf/g2skr在病毒rna不同稀释度(依次为101-105倍稀释)下扩增产物的电泳结果。
图5为实际样本中gii.6型诺如病毒基因组的扩增效果，电泳顺序为m，1-6，其中m为dnaladder，1-6为实际样本l524进行扩增基因组6个片段的电泳结果。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1gii.6型诺如病毒基因组的扩增策略及相应引物的设计
gii.6型诺如病毒基因组大小约7.5kb，包括三个orf，其中orf1长约5.1kb，orf2长约1.6kb，orf3长约0.8kb。以一代桑格脱氧核苷酸测序法为基础，设定每个扩增片段大小范围为1.3kb-1.6kb，其中orf1分为4个片段，orf2和orf3均为1个片段。此外，为获得基因组5'和3'端完整序列，分别在基因组两端设计扩增长度在100-800bp的片段，相应引物分别命名为ii.6-seq1r和ii.6-seq6f。具体基因组分段策略及相应引物位置可见图1。
在以上限制条件下，采用oligo软件设计相应的引物，具体引物信息见表1。其中，引物核苷酸序列中的r代表a/g，h代表a/c/t，n代表碱基a/c/t/g，y代表c/t，m代表a/c。
表1：gii.6型诺如病毒基因组扩增引物及测序引物信息
a引物位置参考的gii.6型诺如病毒代表序列genbank登录号为ab039778。
实施例2适用于gii.6型诺如病毒基因组扩增用引物的rt-pcr退火温度优化
(1)病毒样本处理及核酸提取：通过pbs溶液(depc处理)稀释收集的待处理样品(gii.6型诺如病毒阳性样本l524)至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μl，并通过rna提取试剂盒抽提样本中病毒rna共60μl。
(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：ii-1f/ii.6-1r、ii.6-2f/ii.6-2r、ii.6-3f/ii.6-3r、ii.6-4f/g2skr、ii-5f/ii-5r、ii.6-6f/ii.6-6r，每次rt-pcr反应选择一对引物。采用20μl的一步法rt-pcr反应体系，含有2×one-steprt-pcrmixture10μl，10μmol/l上游引物和10μmol/l下游引物各0.6μl，mlv/rnasin/hs-taq酶混合液0.8μl，样本rna模版2μl，其余由ddh2o补足。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，45-60℃30s，72℃75s，共30次循环后，最后72℃延伸7min。
退火温度分别选择为45℃、50℃、55℃、60℃。
(3)电泳：取扩增产物5μl，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05％goldview核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对ii-1f/ii.6-1r、ii.6-2f/ii.6-2r、ii.6-3f/ii.6-3r、ii.6-4f/g2skr、ii-5f/ii-5r、ii.6-6f/ii.6-6r的顺序，gii.6型诺如病毒基因组扩增条带依次为1629bp、1466bp、1529bp、1569bp、1701bp、927bp。电泳结果如图2，结果表明，六对基因组扩增引物具有较宽的退火温度范围，为减少在实际样本中的非特异扩增，最终选择55℃为应用退火温度。
实施例3适用于gii.6型诺如病毒基因组扩增的rt-pcr引物浓度优化
(1)病毒样本处理及核酸提取：通过pbs溶液(depc处理)稀释收集的待处理样品(gii.6型诺如病毒阳性样本l524)至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μl，通过rna提取试剂盒抽提样本中病毒rna共60μl，并采用无核酸酶的ddh2o进行10×梯度的稀释处理，分别选取rna原液(原液的浓度是104rtpcru)、rna原液稀释10倍和rna原液稀释100倍作为扩增模板。需要注意的是，本发明诺如病毒的含量采用了rtpcru单位来定义，即为采用检测引物g2skf/g2skr，通过标准的rt-pcr方法对10×梯度稀释的病毒液进行检测，则稀释至到恰能检出时的病毒浓度为一个rtpcru。
(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：ii-1f/ii.6-1r、ii.6-2f/ii.6-2r、ii.6-3f/ii.6-3r、ii.6-4f/g2skr、ii-5f/ii-5r、ii.6-6f/ii.6-6r，每次rt-pcr反应选择一对引物。采用20μl的一步法rt-pcr反应体系，含有2×one-steprt-pcrmixture10μl，10μmol/l上游引物和10μmol/l下游引物分别按不同条件加入0.2μl、0.6μl、1.0μl，mlv/rnasin/hs-taq酶混合液0.8μl，不同稀释度样本rna模版2μl，其余由ddh2o补足。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃75s，共30次循环后，最后72℃延伸7min。
(3)电泳：取扩增产物5μl，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05‰goldview核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对ii-1f/ii.6-1r、ii.6-2f/ii.6-2r、ii.6-3f/ii.6-3r、ii.6-4f/g2skr、ii-5f/ii-5r、ii.6-6f/ii.6-6r的顺序，gii.6型诺如病毒基因组扩增条带依次为1629bp、1466bp、1529bp、1569bp、1701bp、927bp。电泳结果如图3，结果表明，不同引物对对引物浓度的要求不一致，但最优条件均为或包括0.6μl，因此，最终选择0.6μl为扩增体系中引物添加量。
实施例4gii.6型诺如病毒基因组扩增用引物的rt-pcr灵敏度评价
(1)病毒样本处理及核酸提取：通过pbs溶液(depc处理)稀释收集的待处理样品(gii.6型诺如病毒阳性样本l524)至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μl，并通过rna提取试剂盒抽提样本中病毒rna共60μl，并采用无核酸酶的ddh2o进行10×梯度的适当稀释(依次为101-105倍稀释)处理。
(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/g2skr、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r，每次rt-pcr反应选择一对引物。采用20μl的一步法rt-pcr反应体系，含有2×one-steprt-pcrmixture10μl，10μmol/l上游引物和10μmol/l下游引物各0.6μl，mlv/rnasin/hs-taq酶混合液0.8μl，样本rna模版2μl，其余由ddh2o补足。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃75s，共30次循环后，最后72℃延伸7min。
以检测引物g2skf/g2skr(g2skf：5'-cntgggagggcgatcgcaa-3'；g2skr：5'-ccrccngcatrhccrttrtacat-3')为对照，按照上述体系和反应条件进行。
(3)电泳：取扩增产物5μl，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05％goldview核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果，所述诺如病毒的含量采用检测引物的rtpcru单位来定义，即为采用常用检测引物g2skf/g2skr对进行10×梯度稀释的病毒rna进行检测，则稀释至恰能检出时的病毒浓度为一个rtpcru。按引物对ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/g2skr、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r的顺序，gii.6型诺如病毒基因组扩增条带依次为1629bp、1466bp、1529bp、1569bp、1701bp、927bp，电泳结果如图4，结果显示：片段3和片段6扩增引物ii.6-3f/ii.6-3r、ii.6-6f/ii.6-6r的灵敏度达到10rtpcru，其他片段扩增引物的灵敏度达到1rtpcru，与检测引物g2skf/g2skr对比，仅片段3和片段6扩增引物ii.6-3f/ii.6-3r、ii.6-6f/ii.6-6r的灵敏度低于一个数量级，其他引物均可达到检测引物的灵敏度。
实施例5实际检出样本中gii.6型诺如病毒基因组的扩增效果
(1)病毒样本处理及核酸提取：取gii.6型诺如病毒阳性样本l524，通过pbs溶液(depc处理)稀释待处理样品至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μl，并通过rna提取试剂盒抽提样本中病毒rna共60μl。
(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/g2skr、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r，每次rt-pcr反应选择一对引物。采用20μl的一步法rt-pcr反应体系，含有2×one-steprt-pcrmixture10μl，10μmol/l上游引物和10μmol/l下游引物各0.6μl，mlv/rnasin/hs-taq酶混合液0.8μl，样本rna模版2μl，其余由ddh2o补足。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃75s，共30次循环后，最后72℃延伸7min。
(3)电泳：取扩增产物5μl，采用1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05‰goldview核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/g2skr、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r的顺序，gii.6型诺如病毒基因组扩增条带依次为1629bp、1466bp、1529bp、1569bp、1701bp、927bp大小附近范围内，电泳结果如图5，结果表明，采用上述扩增引物对样本l524进行扩增均获得成功。
(4)核酸测序与基因组拼接比对：分别采用以上六对扩增引物以及两条测序引物ii.6-seq1r、ii.6-seq6f对相对应扩增出的l524样本的扩增产物测序并拼接，最终获得基因组序列长度为7519bp，其基因组核苷酸序列如seqidno.1所示，将该基因组序列提交进行blast分析，结果表明，与l524样本基因组覆盖度(99％)和相似度(96％)均最高的样本为kj407072/hs245/2010/usa，此外还存在12条基因组的覆盖度为99％及相似度大于90％，分别为km198531/30116/2009/vnm、km198530/20486/2010/vnm、km198549/30473/2010/vnm、ln854568/groningen/nl/2014、kx158282/14-56、kx158281/14-55、ky424344/gii.6/bethesdad21/2012/us、ky424343/bethesdad14/2012/us、ky424342/bethesdad7/2012/us、ky424341/bethesdad1/2012/us、ku935739/0907-26、kx268709/maryland/2014/usa。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
广东环凯微生物科技有限公司
<120>一种gii.6型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>7519
<212>dna
<213>诺如病毒gii.6l524(norovirusgii.6l524)
<400>1
gtgaatgaagatggcgtctaacgacgctaccactgcctttggcagccaaaactctgtcan60
tgacagtaccaacaccaccccttctaataaagaagaggttggtgcattctccaacatcaa120
agttggttttaagaagatactgggtgccgttcccaagggggccaaagcacccagtagtga180
tcagcaacaccccacagttaagatcggggccaaaacgttaacagttccccctgagccccc240
aaatggtgaagacatcgtgcagtttgatgcgaagtcggaaactgtgcgtgggctaccaga300
cttgacaacggtgcagaatgaacacgaaaacacaccatacactgtccccccattgagtga360
aagggagcacagaccagctcctgagccgcttcctggcacaatactggagatgtgggatgg420
tgaattctaccattactccatatacgtcagcggtggcaaagctctaggggttcacaagcc480
cccagcagcgataagcctcgcgacgatagaactcacacccatatctctttattggaggcc540
cgtttacacccccaactatctggtctgtccagacacgttgaaaggcctcgctggtgaaaa600
gttcccctacacggccttcagcaacaactgttacaacttctgttgctgggtacttgagct660
caatgacacatggcttagcaggagaagcatcaccaggaccagcggcttcttcaaaccata720
tcagtcttggaataggaaaccccttccaaccgttgacgatggaaagatcaagaaggtggc780
caacgcaattctctgcgcacttggatcactgttttcaaaaccaattaaagatctattggg840
caaatttaaaccattgaacctgctgcacctgctcgcatcatgtgactggacgtttgcggg900
catagtagagacagttatcctaatggcggaacttttcaacatcttttggacaccgccaga960
tgtttccagcttcatagcctccctgataggtgattttgaactgcaagggcctgaggacct1020
ggctgtggagcttgtccccgtggtcatgggtggcataggaatggttctcggcttcactgc1080
tgagaagataggccgcatgctgtcgtccgctgcatcaacactgcgggcatgcaaagattt1140
ggggaattacgcccttgacatattgaaactggttatgaagtggttcttcccaaagaaaga1200
agagaaagccgagatggaaaccctgagggcgatcgaggatgccgtcctggacatggaagc1260
tataggaaacaaccatctcacagccctcctcaaggacaaggatagcctcgcggctttcat1320
gaagaccctggatctagaagaagagaaggcaaggaagctgtccaccaagtcatcctcgcc1380
agacattgtcggcactattaatgccatactggccagaatagctgctgccaggtccctctt1440
acacaaggctaaagaagaaatgtttagcaggatcagacccgtggttgtcatgatctcggg1500
tagacctggcattggcaaaacccacatggcaagacacttggctaagagtatcgccaacac1560
catgagcggcgaccagagagtagggctcgtcccacgcaacggggtcgatcactgggacgc1620
ctacaggggagagagggtggtcttatgggatgattatggcatgggtaaccctgtcaaaga1680
tgctctaacactgcaagagttggctgacacctgcccagtaaccctaaactgtgataggat1740
tgaaaacaaggggaagatgttcgacagtgatgtcatcataatcacgaccaatttagtcaa1800
cccagcgcccctcgattatgtaaatttcgaggcgtgctccagaagggtcgactttctggt1860
ctatgcagagtcaccagaaattgagaaggttaagagagacttccccggccaacctgacat1920
gtggaaggaccattttaagccagacttttcccacataaaactgactctagccccacaggg1980
tggatttgacaagaatggcaataccccgcatggtaaaggcaccatgcgatccctaaccca2040
ggggtccctgaccgcaagggtcgcaggtcttgttcatgagaggagagacgagtttcagct2100
ccagggaaacgaccttcaaacatacaactttgacaccaatagggtctccgcatttaggaa2160
actggccgcagacaacaagtatgggatcatggagacaatgagagtgggcacggcgctcaa2220
gagtgtcaagaccttggaggatctgaaagttgctctgagggatgtgaagttcaatgagtg2280
tgagatcatttacaagagctccaaataccgagtctcttccaatggtaaaggttctgtctc2340
tattgacaaagtcgaggaccaagcatcccagactgcaaacgaagtgggtgcggcaatcct2400
tagactcaggcaggcaagatccagatactatgtcagctgcttccaagatcttgtctatac2460
tctaatacaggtcgccggagcatcattcgttgtcaacaggatctctaaaaggttctgctg2520
ggagagatgggtcaaaccaaccgagacccaggaaacgagtgaacccgaaaaggaggtggc2580
ccagggtagatgggagattgaacccaaggacacagaaccagaaggtaagaagggtaagaa2640
caagaaaggaagaggtaagaaacacacagctttctccagcaaaggtctgagtgatgagga2700
gtatgacgagtacaagagantcagagaggagaggaacggaaaatactccattgaggaata2760
cctgcaagaccgggatcgctactatgaggaagtggcagtcgcccgggcgacagaggagga2820
cttctgtgaggaggaggaggccaagataagacaaagaattttccgccccacaaagaaaca2880
gaggaaggaagaaagaggggtgcttggcttggtcactggctcagacatcaggaagaggag2940
accagacgattttcaaccgaagggcaatccgtgggcagacgacaccaggagtgtggacta3000
caacgagagacttgatttcgaggctcccccgagtgtctggtcaagaatagtcccattggg3060
cactggctggggcttctgggtctcatccaacctcctgatcacaacaacacacgtcctgcc3120
taaaggaattaaggaactttttggagttgatatcaaacagattcaaattcataagtctgg3180
agagttctgcaggtttagattcccaagaccaatcagatcagatgtcacagggctcgtgtt3240
ggaggaaggtgctccagaaggcactgtctgctccatactcataaagagacctacaggtga3300
gatgatccccctggcagtgaggatgggcacgcatgcatccatgaaaatacagggtaggac3360
cgtcggtggccagatgggaatgctcctcacaggggcaaacgcgaagaacatggatcttgg3420
caccggtcctggtgactgcggttgcccttacatctacaaacgtggcaatgacatagttgt3480
cgcgggtgtccacaccgcagcagcccggggaggcaacactgtcatatgtgccactcaagg3540
gcaagatggggaggcagtccttgagggaggtgagaaccttggcacttactgcggtgcccc3600
aattctgggtccaggcaaggcgcccaagcttagcacgaagaccaagttctggcgttcgtc3660
accagatgctttgccgccaggcacttatgagcctgcctacttggggggtaaggaccccag3720
agtggaaaaaggaccatccctacagcaagtcatgagggaccagctaaaacctttcacaga3780
acccaggggcaagccacctagacctgcagtcttagaagaagccaaaaagacagtgatgaa3840
tgttctagaacaaaccattgaccctgctaagccatggacctattcccaagcatgtgcctc3900
actggacaaaaccacttccagtggtagcccccaccatgtcaggaaaaacgaccattggaa3960
tggggaatccttcactggtccccttgcagaccaagcatccaaagccaacctcatgtacga4020
acaggccaaacatgtgcagcccgtgtacacggccgcactcaaagatgagttagtcaaaac4080
tgacaagatctacaaaaagataaagaaaaggctcttatgggggtcggatcttggtacaat4140
gattaggtgcgccagggcttttggcggtctaatggacagcatgaaggcaagttgcataac4200
cctcccatgtagggtaggaatgaacatgaatgaagatggacccatcatatttgacaaaca4260
ctctaaatacaggtaccattatgatgctgactattccaggtgggactcaacccagcagag4320
gagcattctctcggccgctatggaagtgatggtgcggttctctgccgaaccagagctggc4380
acaagtggttgcggaggatctcctggcacccagccaactagatgttggcgattttgtcat4440
ctcagtccaggagggtctgccatcgggggtcccatgcacatcacaatggaactcaatagc4500
acattggatcctaaccttgagtgcaatggcagaagtgtcgggtctctcaccagatgttgt4560
tcaagcccactcctgtttctcattctacggtgatgatgagatcgtcagtactgacatcaa4620
ccttgatcccatgaagttgacacagaaactcagagagtatggtctggtccccactcgacc4680
tgataaaaccgagggtcccctcgtaataactgaagacctcaccggcctaacgttcctgcg4740
taggtcaattgcacgggacccagccgggtggtttggaaaactggaccaagactcaatcct4800
cagacagttgtactggacaaggggccccaatcatgagaacccatacgagagcatggtccc4860
tcactcccagcgggccacacagctcatggcccttctcggtgaggcttcactgcatggccc4920
ccagttttacaagaaggttagcaagatggtcatcaatgaaattaaaagtggtggtctgga4980
attctatgtgcccagacaagaggccatgttcagatggatgagattctctgacctcagcac5040
atgggagggcgatcgcaatcttgctcccgagggtgtgaatgaagatggcgtcgantgacg5100
ctgctccatcgaatgatggtgctgccaacctcgtaccagaggccaacaatgaggttatgg5160
cacttgaaccggtggtgggagccgcaatcgcagctcctgtcgtcggccaacaaaacataa5220
ttgacccctggattaaagaaaattttgtccaagcaccacagggcgagttcaccgtctcac5280
cgaggaactcacctggtgagatgctattaaaccttgaattgggcccagaactcaaccctt5340
acctaagtcacctgtcccgcatgtataacgggtatgctggtggcatgcaggttcaggtgg5400
tcctagctgggaatgcgttcacagctgggaaaatcatctttgccgccgtgccaccacatt5460
ttcccgtagagaacatcagtgcagctcaaataaccatgtgcccccatgtgattgttgatg5520
tgagacaacttgaaccagtacttctgccccttcctgacataaggaataggttctttcatt5580
acaatcaggagaacaccccccggatgagacttgtggctatgctttatacccccctgaggg5640
ccaactctggtgaagatgtgtttactgtttcttgtagggttttgacccgtcctgcccctg5700
attttgaattcactttcttggtgccaccaactgttgaatcaaagactaaacccttcacgc5760
tgcccatattaactcttggtgagctatctaattctagattcccagccccaatagatatgt5820
tgtatactgacccaaatgaggcaattgtggtccaaccacaaaatggtaggtgtacccttg5880
atggtactctgcaaggcaccacacaactggtccccacccaaatttgtgctttcaggggca5940
cactaattgcccaaacatcaagatcttcagactcaaccgactcagcccctcggaggagag6000
accacccactccatgtgcaattaaagaaccttgatggcacgcagtacgacccaactgatg6060
aagtgccagcagctcttggtgccattgacttcaaggggactgtctttggggtggccagcc6120
agagagatgtgtcagggaatcaagtgggagcaactcgagctcatgaagtgcacatcgaca6180
caaccgatcccaggtacacaccaaaactgggatccatcctcatgcactcagagtcggaag6240
actttgacaatggacagccgatccgcttcgcacccataggaatgggtgacaacgactggc6300
accagtgggatctacctgactactctggacatctaaccctgaacatgaaccttgccccag6360
cagtcgctcccgcttttcccggtgagaggattcttttcttcaggtcaatagtcccgtctg6420
ctggtggctatgggtctggacaaatagattgcctcataccacaggagtggattcagcact6480
tctaccaggaagctgcaccatcccaatctgccgtggcactcattaggtatgtcaaccctg6540
acacaggcagaaacatctttgaggctaaattgcacagggaaggtttyttcacygtggcaa6600
attctggtaacaaccccattgttgtcccccctaatgggtattttagatttgaggcttggg6660
tgaatcaattytacactttaacccccatgggaactggtcaggggcgtaggaggaatcaat6720
aatggctagtgcttttcttgcaggtcttgctggcgacgtcataacaaatggcgttggatc6780
tctaataaatgctggagctaatgcaattaatcagaaagttgaatttgattttaataaaca6840
gcttcaaatggcatcatttaaacatgataaagagatgttgcaatcacaagtgttggcaac6900
caagcagctgcagcaggagatgatgaacataaggcagggggtgttgaccgctggcggctt6960
ctcccccgcggatgctgctagaggggccgtcaatgcccctatgacaaagattctggactg7020
gaatggcaccaggcattgggcaccaaacagcatgaaaaccacaagttattcaggacaatt7080
ttctagcagccctgttcacaagtctcccgctccttctcagcatactgctttgccaaagag7140
taaattgyataatgattctgctagtgtatatagcttcccttcctctgtttcttcacaatc7200
aacccattcaacaatgctgtcagcaggaaccgggtcttccaggtccatctccacatccac7260
agcgacccccaccttgtctagaaccagtgactgggttaggggacagaatgagaggctcag7320
cccgtttatggatggtgctctccaaactgcctttgtcacacctccatcgagcagagcttc7380
atcaaatggtacggtctcaaccgttcccaaagctgttttggactcctggacccctatgtt7440
taacacacataggcagcctctcttcgcccatctacgtaggcgaggggagtcacaaattta7500
gtgaaaagagtgattagga7519