一种提高维吉尼亚霉素产量的发酵生产方法与流程

本发明涉及发酵工程领域，具体涉及一种提高维吉尼亚霉素产量的发酵生产方法。

背景技术

维吉尼亚霉素(virginiamycin)属于多肽类抗生素，其分子结构中有内酯环，是从链霉菌属细菌发酵产物中提取而来。维吉尼亚霉素在结构上由m(约占70％)和s(约占30％)两个因子构成，两者的结构和抗菌范围均不相同。m因子是一种巨环内酯，分子式为c28h35n3o7，s因子是一种环状多肽，分子式为c43h49n7o10。s和m混合，使其抗菌活性增强，而且不容易产生抗药性，主要对革兰氏阳性菌有显著的抑菌作用。美国smithlklinr药厂研发了维吉尼亚霉素产品stafac(速大肥)，它由70％的m因子和30％的s因子构成。由于维吉尼亚霉素在动物肠道内不易被吸收，残留量小，毒性小，有较好的生物降解性，而且维吉尼亚霉素结构非常稳定，在室温下保存3年其作用效果不发生变化，在饲料生产过程中仍十分稳定，因此，维吉尼亚霉素被誉为最有前景的抗生素之一。然而，目前维吉尼亚霉素发酵生产的产品效价较低，直接制约了维吉尼亚霉素的应用推广。

目前报道的提高维吉尼亚发酵产量的方法主要包括培养基的优化、添加前体物质或其它真菌的菌粉等，然而其对于维吉尼亚霉素发酵产量的提高效果十分有限，且存在原料成本高、发酵工艺复杂等问题，因此，优化维吉尼亚霉素的发酵生产方法对于提高菌株的发酵生产性能、降低生产成本具有重要意义。

技术实现要素：

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种提高维吉尼亚霉素产量的发酵生产方法。

本发明提供一种提高维吉尼亚霉素产量的方法，采用微生物分级发酵生产维吉尼亚霉素，所述分级发酵为在发酵的中后期将第一级发酵的菌体转接至第二级发酵的培养基中继续进行发酵。

在抗生素等次级代谢产物的合成过程中，微生物对于营养物质、温度和ph环境等外界条件的要求会随着不同的生长代谢阶段发生变化。此外，随着发酵的不断进行，发酵培养体系中可能会积累一些已知或未知的有毒代谢产物，影响的微生物生长代谢。本发明经过大量的对比和优化试验发现，采用分级发酵进行维吉尼亚霉素的发酵生产，根据不同发酵阶段微生物对于环境条件的需求不同，调整各阶段的发酵条件，通过发酵分级解除可能的有毒代谢产物的积累对微生物生长代谢的不利影响，能够显著提高维吉尼亚霉素的产量。

现有技术中常用的抗生素发酵生产方法主要包括连续补料和分批补料发酵。连续补料发酵中微生物对营养物质的利用率比较低、对加料设备的精确性要求比较高、且产物利用率和转化率都比较低；分批补料发酵随着发酵时间的延长发酵体积逐渐增大，导致发酵指标计算的准确性有偏差；而本发明提供的分级发酵方法可以克服连续补料发酵和分批补料发酵的缺点，在保证发酵结果准确性的基础上，提高发酵原料的利用率，且发酵过程中发酵参数趋于恒定，便于自动化控制。

本领域技术人员应当理解，所述分级发酵的第一级发酵和第二级发酵的分界点为转接发酵菌体的时间点，即发酵中后期，对于发酵中后期时间点的判断，发酵中后期的时间点可能由于选择的具体菌株不同、种子生长状态和接种量的不同而改变，本领域技术人员可以利用常规技术手段，根据具体的发酵培养周期和在发酵过程中监测的菌体生长、碳源和氮源的消耗等菌体生长代谢状态指标进行判断。

在本申请的具体实施方式中，选择维吉尼亚链霉菌(streptomycesvirginiae)作为维吉尼亚霉素的生产菌株，接种量为15％、发酵周期为72小时，发酵中后期为48小时～72小时，优选的发酵分级时间为48小时～64小时。

所述第一级发酵和第二级发酵的培养基可以选择相同的发酵培养基，也可以选择不同的发酵培养基。

优选地，所述分级发酵的第二级发酵的培养基较第一级发酵的培养基具有提高的维吉尼亚霉素合成前体物质的含量和/或降低的碳氮源的含量；更优选地，所述维吉尼亚霉素合成前体物质为丙酸钠和/或苏氨酸。

具体地，所述第一级发酵的培养基包括可溶性淀粉20～25g/l，豆粕4.5～5.5g/l，酵母浸膏2.5～3.5g/l，葡萄糖10～20g/l，亚麻油3～5g/l，磷酸氢二钾0.4～0.5g/l，硫酸亚铁0.03～0.05g/l，硫酸铵0.5～1.3g/l，碳酸钙3～4g/l。

优选地，所述第一级发酵的培养基由以下成分加水配制而成：可溶性淀粉20～25g/l，豆粕4.5～5.5g/l，酵母浸膏2.5～3.5g/l，葡萄糖10～20g/l，亚麻油3～5g/l，磷酸氢二钾0.4～0.5g/l，硫酸亚铁0.03～0.05g/l，硫酸铵0.5～1.3g/l，碳酸钙3～4g/l。

所述第二级发酵的培养基包括可溶性淀粉15～16g/l，豆粕2.5～3.5g/l，酵母浸膏0.5～2.5g/l，葡萄糖5～10g/l，亚麻油3～5g/l，磷酸氢二钾0.3～0.5g/l，硫酸亚铁0.02～0.05g/l，硫酸铵0.5～1.3g/l，碳酸钙3～4g/l，苏氨酸0～0.7g/l，丙酸钠0～0.6g/l。

优选地，所述第二级发酵的培养基由以下成分加水配制而成：可溶性淀粉15～16g/l，豆粕2.5～3.5g/l，酵母浸膏0.5～2.5g/l，葡萄糖5～10g/l，亚麻油3～5g/l，磷酸氢二钾0.3～0.5g/l，硫酸亚铁0.02～0.05g/l，硫酸铵0.5～1.3g/l，碳酸钙3～4g/l，苏氨酸0～0.7g/l，丙酸钠0～0.6g/l。

进一步地，所述第二级发酵具有较第一级发酵降低的ph，优选地，第二级发酵的ph较第一级发酵的ph降低了0.4～0.8。

具体地，所述第一级发酵的ph控制在7.0～7.2；

所述第二级发酵的ph控制在6.4～6.6。

本发明提供的微生物分级发酵生产维吉尼亚霉素的方法中所述微生物为链霉菌属微生物，优选为维吉尼亚链霉菌(streptomycesvirginiae)。

本发明提供的提高维吉尼亚霉素产量的方法具体包括如下步骤：

(1)斜面培养：将所述微生物接种至斜面培养基；

(2)种子培养：将步骤(1)获得的斜面培养物接种至种子培养基中；

(3)第一级发酵培养：将步骤(2)获得的种子培养液接种至所述第一级发酵的培养基中，28～32℃培养48～64小时，在发酵过程中ph控制在7.0～7.2；

(4)第二级发酵培养：在第一级发酵的48～64小时，将步骤(3)获得的第一级发酵的菌体转接至所述第二级发酵的培养基中，28～32℃继续发酵直至结束，在发酵过程中ph控制在6.4～6.6；

其中，所述分级发酵为采用离心收集菌体的方式将第一级发酵菌体转入第二级发酵培养基中进行发酵。

优选地，所述方法包括如下步骤：

(1)挑取生长饱满健壮的维吉尼亚链霉菌孢子接种到斜面培养基上，28～30℃恒温静置培养8～10天，于4℃冰箱放置5-10天，所述斜面培养基为酵母膏34g/l，麦芽浸膏8～10g/l，葡萄糖3～4g/l，琼脂15～20g/l；

(2)用适量的无菌水冲洗斜面成熟的孢子，将孢子悬浮液接种至种子培养基中，转速200～220rpm，30～32℃恒温培养24～28小时，所述种子培养基的组成为豆粕14～15g/l，花生粕18～22g/l，葡萄糖28～32g/l，酵母浸膏4.8～5g/l，可溶性淀粉15～20g/l，碳酸钙2～3g/l；

(3)将步骤(2)获得的种子培养液以15％的接种量接种至第一级发酵培养基中，转速200～220rpm，30～32℃发酵，发酵ph控制在7.0～7.2；

(4)在发酵48小时～64小时时将步骤(3)中的第一级发酵的菌体进行离心收集后，转接至第二级发酵培养基中，转速200～220rpm，30℃～32℃发酵直至发酵结束，发酵ph控制在6.4～6.6。

本发明的有益效果在于：

(1)采用本发明提供的分级发酵方法，维吉尼亚霉素的发酵产量最高提高了32.49％；

(2)本发明提供的分级发酵方法，原料成本低廉，工艺简单易行，易于发酵过程控制，有效降低了维吉尼亚霉素的发酵生产成本；

(3)本发明提供的分级发酵方法克服了连续补料发酵和分批补料发酵的缺点，提高了营养物质的利用率，进而提高了底物转化率，降低了生产成本。

附图说明

图1为实施例1中维吉尼亚链霉菌的菌体浓度随时间变化曲线，其中pmv(packedmycelialvolume)代表菌丝生长量。

图2为实施例1中维吉尼亚霉素的发酵生产曲线图，箭头指示为发酵分级的时间。

图3为实施例2中维吉尼亚霉素的发酵生产曲线图，箭头指示为发酵分级的时间。

图4为实施例3中维吉尼亚霉素的发酵生产曲线图，箭头指示为发酵分级的时间。

图5为实施例4中维吉尼亚霉素的发酵生产曲线图，箭头指示为发酵分级的时间。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例和对比例的实验结果均为三次平行重复实验的平均值。

实施例1

(1)维吉尼亚链霉菌的斜面培养：

在无菌条件下，用接种针挑取维吉尼亚链霉菌(streptomycesvirginiae)mtcc4.1996(购自印度3bbiotech公司)的生长饱满的健壮孢子接种到已经备好的斜面培养基上，30℃恒温静置培养8～10天，于4℃冰箱放置5～10天，备用。

斜面培养基为酵母膏4g/l，麦芽浸膏10g/l，葡萄糖4g/l，琼脂20g/l。

(2)种子培养：依据种子培养基配方，按比例配制25ml种子培养基，加入到250ml三角瓶中，80～90℃恒温水浴20～30分钟，冷却后调ph7.0～7.2，115℃灭菌30分钟，冷却后待用。

用1ml的无菌生理盐水冲洗斜面成熟的孢子，将1ml孢子悬浮液接入已经备好的种子培养基中，转速200～220rpm，30～32℃恒温培养24小时。

种子培养基的组成为豆粕15g/l，花生粕22g/l，葡萄糖32g/l，酵母浸膏5g/l，可溶性淀粉20g/l，碳酸钙3g/l。

(3)第一级发酵培养：依据发酵培养基配方，按比例配制30ml发酵培养基，加入到250ml三角瓶中，80～90℃恒温水浴20～30分钟，冷却后调ph7.0～7.2，115℃灭菌30分钟，冷却后待用。

将步骤(2)中获得的种子液以10％～15％的接种量转接入发酵培养基中，转速200～220rpm，30～32℃恒温培养。发酵过程中随时检测菌体生长情况并用显微镜镜检观察菌体形态。

(4)第二级发酵培养：发酵32小时时将第一级发酵培养的全部发酵液取出并进行离心(4℃，3000rpm，10min)，弃上清，用新鲜配制的第二阶段发酵培养基重悬菌体至原发酵体积，转速200～220rpm，30～32℃恒温培养，直至72小时发酵结束。发酵过程中随时检测菌体生长情况并用显微镜镜检观察菌体形态。

所用第一阶段和第二阶段发酵培养基相同，配方如下：可溶性淀粉20g/l，豆粕4.5g/l，酵母浸膏2.5g/l，葡萄糖10g/l，亚麻油3g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸亚铁0.05g/l，硫酸铵0.5g/l，碳酸钙3g/l。

(5)维吉尼亚霉素提取：发酵结束后，取2ml发酵液，3000rpm、10min离心弃上清，加入等体积的乙酸乙酯，在涡旋振荡器涡旋10min后弃上清，然后加入等体积的乙腈，涡旋混合10min后取上清，待测样。

(6)维吉尼亚霉素的检测：采用高效液相色谱仪检测发酵效价单位，岛津液相色谱系统，色谱柱为ods-3c18色谱柱(250.0mm*4.6mm)；检测波长：230nm；流动相：二元高压梯度洗脱，流动相a(0.01m磷酸)；流动相b(乙腈)；0～0.2min，流动相a94％，流动相b6％；0.2～35min，流动相a15％，流动相b85％；35～45min，流动相a94％，流动相b6％；45min结束；流速：1.0ml/min。

发酵过程中，菌丝的生长量变化如图1所示，结果显示，菌丝生长量(pmv，ackedmycelialvolume)为39.33，维吉尼亚霉素产量为1893mg/l(如图2所示)。

实施例2

除步骤(4)外，其它步骤的实验操作和条件如实施例1所述，步骤(4)为：发酵48小时时将第一级发酵培养的全部发酵液取出并进行离心(4℃，3000rpm，10min)，弃上清，用新鲜配制的第二阶段发酵培养基重悬菌体至原发酵体积，转速200～220rpm，30～32℃恒温培养，直至72小时发酵结束。发酵过程中随时检测菌体生长情况并用显微镜镜检观察菌体形态。

结果显示，菌丝生长量为45.87，维吉尼亚霉素产量为2188mg/l(如图3所示)。

实施例3

除步骤(4)外，其它步骤的实验操作和条件如实施例1所述，步骤(4)为：发酵56小时时将第一级发酵培养的全部发酵液取出并进行离心(4℃，3000rpm，10min)，弃上清，用新鲜配制的第二阶段发酵培养基重悬菌体至原发酵体积，转速200～220rpm，30～32℃恒温培养，直至72小时发酵结束。发酵过程中随时检测菌体生长情况并用显微镜镜检观察菌体形态。

结果显示，菌丝生长量为44.15，维吉尼亚霉素产量为2034mg/l(如图4所示)。

实施例4

除步骤(4)外，其它步骤的实验操作和条件如实施例1所述，步骤(4)为：发酵64小时时将第一级发酵培养的全部发酵液取出并进行离心(4℃，3000rpm，10min)，弃上清，用新鲜配制的第二阶段发酵培养基重悬菌体至原发酵体积，转转速200～220rpm，30～32℃恒温培养，直至72小时发酵结束。发酵过程中随时检测菌体生长情况并用显微镜镜检观察菌体形态。

结果显示，菌丝生长量为45.36，维吉尼亚霉素产量为2092mg/l(如图5所示)。

对比例1

对比例1为不进行发酵分级，即步骤(3)直接培养至发酵结束，不进行步骤(4)，其它步骤的实验操作和条件如实施例1所述。

结果显示，菌丝生长量为37.12，维吉尼亚霉素产量为1710mg/l。

比较实施例1～4和对比例1可知，进行分级发酵可以显著提高维吉尼亚霉素的发酵产量，不同的发酵分级时间影响维吉尼亚霉素的发酵产量，在发酵中后期进行发酵分级对于维吉尼亚霉素产量的提高作用优于在发酵前期进行分级，其中，在48小时进行分级维吉尼亚霉素的产量较不分级提高了27.95％。

实施例5

除第二级发酵的培养基与实施例2不同外，其它步骤的实验操作和条件如实施例2所述。第二级发酵的培养基如下：可溶性淀粉20g/l，豆粕4.5g/l，酵母浸膏2.5g/l，葡萄糖10g/l，亚麻油2g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸亚铁0.05g/l，硫酸铵0.5g/l，碳酸钙3g/l。

结果显示，菌丝生长量为39.82，维吉尼亚霉素产量为2112mg/l。

实施例6

除第二级发酵的培养基与实施例2不同外，其它步骤的实验操作和条件如实施例2所述。第二级发酵的培养基如下：可溶性淀粉15g/l，豆粕3.5g/l，酵母浸膏2.5g/l，葡萄糖10g/l，亚麻油3g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸亚铁0.05g/l，硫酸铵0.5g/l，碳酸钙3g/l。

结果显示，菌丝生长量为40.54，维吉尼亚霉素产量为2102mg/l。

实施例7

除第二级发酵的培养基与实施例2不同外，其它步骤的实验操作和条件如实施例2所述。第二级发酵的培养基如下：可溶性淀粉20g/l，豆粕4.5g/l，酵母浸膏2.5g/l，葡萄糖10g/l，亚麻油3g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸亚铁0.05g/l，硫酸铵0.5g/l，碳酸钙3g/l，丙酸钠0.6g/l。

结果显示，菌丝生长量为43.78，维吉尼亚霉素产量为2306mg/l。

实施例8

除第二级发酵的培养基与实施例2不同外，其它步骤的实验操作和条件如实施例2所述。第二级发酵的培养基如下：可溶性淀粉20g/l，豆粕4.5g/l，酵母浸膏2.5g/l，葡萄糖10g/l，亚麻油3g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸亚铁0.05g/l，硫酸铵0.5g/l，碳酸钙3g/l，丙酸钠0.6g/l，苏氨酸0.7g/l。

结果显示，菌丝生长量为45.07，维吉尼亚霉素产量为2333mg/l。

实施例9

除第二级发酵的培养基与实施例2不同外，其它步骤的实验操作和条件如实施例2所述。第二级发酵的培养基如下：可溶性淀粉15g/l，豆粕3.5g/l，酵母浸膏2.5g/l，葡萄糖10g/l，亚麻油3g/l，磷酸氢二钾0.5g/l，硫酸亚铁0.05g/l，硫酸铵0.5g/l，碳酸钙3g/l，丙酸钠0.6g/l，苏氨酸0.7g/l。

结果显示，菌丝生长量为41.67，维吉尼亚霉素产量为2359mg/l。

将实施例5～9与未调整第二级发酵培养基的实施例2相比，结果表明，在第二级发酵培养基中添加维吉尼亚霉素合成的前体物质丙酸钠和苏氨酸可以显著提高维吉尼亚霉素的产量，同时降低碳氮源的含量，可以进一步提高维吉尼亚霉素的产量。其中，单独添加丙酸钠，维吉尼亚霉素产量提高了5.38％，联合添加丙酸钠和苏氨酸，维吉尼亚霉素产量提高了6.63％，进一步降低碳氮源的含量，维吉尼亚霉素产量提高了7.84％。

实施例10

除第二级发酵的发酵温度与实施例9不同外，其它步骤的实验操作和条件如实施例9所述。本实施例中第二级发酵的发酵温度为28℃。

结果显示，维吉尼亚霉素产量为2158mg/l。

实施例11

除第二级发酵的发酵ph控制与实施例9不同外，其它步骤的实验操作和条件如实施例9所述。本实施例中第二级发酵的发酵ph控制为6.6。

结果显示，维吉尼亚霉素产量为2508mg/l。

实施例12

除第二级发酵的发酵ph控制与实施例9不同外，其它步骤的实验操作和条件如实施例9所述。本实施例中第二级发酵的发酵ph控制为7.2。

结果显示，维吉尼亚霉素产量为1982mg/l。

将实施例10～12与实施例9进行比较，结果表明，第二级发酵采用与第一级发酵温度相同，但调整为偏酸性的ph有利于维吉尼亚霉素的产量的提高，第二级发酵的ph控制在6.6时，维吉尼亚霉素产量较ph控制在7.0时提高了6.35％。

综上所述，比较实施例12和对比例1，结果表明，通过发酵分级时间、发酵培养基和培养条件得优化，维吉尼亚霉素的产量提高了32.49％。

实施例13

在10l发酵罐中进行放大发酵试验，分别配制7l第一级和第二级发酵培养基，按照接种量10％～15％将种子培养液转接至第一级发酵培养基中，30℃恒温培养，罐压控制在0.04～0.06mpa，通气量0.5～0.6vvm，转速200～600rpm，do控制在30％～40％，用氨水调节控制ph7.0。在48小时离心收集第一级发酵的菌体转接至第二级发酵培养基中，进行第二级发酵，30℃恒温培养，罐压控制在0.04～0.06mpa，通气量0.5～0.6vvm，转速200～600rpm，do控制在30％～40％，用氨水调节控制ph6.6。发酵过程中随时取样监测菌体生长情况，直至发酵结束。其它实验操作步骤和培养基及培养条件如实施例12所述。结果显示，10l发酵罐的维吉尼亚霉素的产量为3003mg/l。

对比例2

对比例2与实施例13的区别仅在于不进行发酵分级，其它步骤的实验操作和条件如实施例13所述。

结果显示，维吉尼亚霉素产量为2548mg/l。

结果表明，发酵罐放大发酵试验中，采用优化的分级时间、培养基和条件，维吉尼亚霉素的发酵产量较不分级发酵提高了17.86％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。