一株具有抗菌活性的链霉菌及其应用的制作方法

本发明涉及微生物菌种及其应用领域，具体地说，本发明涉及一株从野老鹤草根组织内部筛选得到的链霉菌及其应用研究的技术领域。

背景技术

放线菌（actinomycetes）广泛存在于不同的自然生态环境中，大部分放线菌都能产生抗生素、氨基酸、维生素、有机酸、酶及酶抑制剂等生物活性化合物，具有广泛的实际用途和巨大的经济效益。迄今为止，人们从放线菌中发现了近万种抗生素，其中大部分的抗生素都是由链霉菌产生的。但随着越来越多的人类致病菌对抗生素耐药性的出现，寻找安全、高效、低毒天然的新型生物活性化合物势在必行。然而，长期以来对土壤放线菌的开发，从中发现新结构化合物的可能性大大降低。因此，寻找新来源是提高开发效率的关键。

植物内生菌（endophyte）是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织和器官内部或细胞间隙的真菌或细菌。它是植物微生态系统中的组成部分,在不同健康植物的根、茎、叶及果实中均生活着微生物的正常菌群。它们的代谢活动及产物可促进宿主植物适应外界各种（生物、非生物）环境压力,维持生态系平衡。迄今的研究表明,植物内生菌可与植物结瘤固氮,产生生长素促进宿主生长,产生抗生素增加植物的抗病性,产生次生代谢活性物质使植物具有抗逆、抗虫、除草功能。从而,植物内生菌的诸多功能性状成为人们实际利用的新的生物资源,近年来成为微生物资源研究的热点之一。

近年来，从植物组织中发现了一些新的内生放线菌（endophyticactinomycete），产生新的生物活性代谢物或产生具有新特性的酶；对植物内生放线菌与植物宿主及其他微生物之间的关系研究有新的发现，其在植物病害防治中的作用已引起重视。从药物开发的角度看，新的放线菌菌株往往具有基因新颖性，预示着其可能存在的新活性，随着大量内生放线菌新种的不断发现，从中寻找新型生物活性化合物逐渐显现出巨大潜力，近年来已从内生放线菌中分离到多种新活性或者新结构的化合物。

野老鹤草作为一种传统的中草药，经常被报道具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒等生物活性物质，研究该草药根组织内的微生物群落具有潜在的经济价值和完善微生物资源库的目的。

技术实现要素：

本发明提供一株从野老鹤草根组织分离得到的链霉菌，该菌具有氧化酶、过氧化氢酶、抗菌、抗肿瘤、抗糖尿病以及酯酶(c4)等酶活活性，同时与链霉菌属中已有效发表菌种的16srrna基因序列相似度最高，且最高相似度为98.1%，这可明显区别于已公开报道的其它有效菌种。

本发明提供一株植物内生链霉菌streptomycessp.a301。

本发明以含有放线菌酮（50mg/l）和萘啶酮酸（25mg/l）的培养基为筛选条件，先对野老鹤草的根组织进行表面清洗、消毒、灭菌处理，再将根组织切片置于培养基上进行培养、分离及纯化，经多级筛选获得一株链霉菌，即streptomycessp.a301。

本发明通过提取细菌基因组dna，经pcr扩增其16srrna基因后送样测序，测序结果表明其序列全长为1551bp（genbank登录号：mf100124）。将序列上传至ezbiocloud进行在线比对分析，将与其相似性度较高的相关模式菌株的16srrna基因序列从ezbiocloud数据库调出，并利用软件mega5.2来构建系统发育树。系统发育树表明streptomycessp.a301与链霉菌属的所有模式菌聚集在一起且单独呈一支，且与之相邻分支上亲缘性最近的2株模式菌streptomycescinereorubersubsp.fructofermentansnbrc15396^t和streptomycesturgidiscabiesatcc700248^t的16srrna基因序列相似度都为98.1%。

选择同源关系最近的2株模式菌streptomycescinereorubersubsp.fructofermentansnbrc15396^t和streptomycesturgidiscabiesatcc700248^t作为参考菌株，按照《放线菌系统学》和《常见细菌系统鉴定手册》对链霉菌streptomycessp.a301进行多相分类的研究，主要包括形态学特征、生长特性、生理生化特征、极性脂组成、细胞壁肽聚糖类型、呼吸醌醌型、脂肪酸成分以及dna(g+c)含量等分类指标，同时分别采用标准的方法来测试其酶活特性及碳氮源利用情况。结合表型、生理生化、化学分类及dna-dna杂交等数据分析可知streptomycessp.a301为链霉菌属的一个新种。

通过实施本发明的具体技术指标，可达到以下预期效果。

本发明的链霉菌streptomycessp.a301为革兰氏阳性菌，能产生大量的气生菌丝，菌丝表面光滑，气生菌丝还能分化成弯曲或直链的孢子链，孢子呈椭球形。nacl浓度的生长范围为0-5%，生长温度范围为10-37℃（最佳生长温度为28℃），ph生长范围为6.0-11.0（最佳生长ph为7.0）。该菌株能在发酵培养基中产生具有抗肿瘤、抗糖尿病的活性化合物，同时该菌株还具有氧化酶、蛋白酶、过氧化氢酶、类脂酯酶(c4)等酶活性，可广泛地应用于各类生物工程酶制剂生产领域。

附图说明：图1是菌株streptomycessp.a301于扫描电子显微镜10000倍下所观察的形状特征照片。

下面举实施例说明本发明，但是本发明并不限于下述实施例。

具体实施方法

实施例一：链霉菌streptomycessp.a301的筛选和分离

样品采自四川省峨眉山的野老鹤草根组织。用试管刷清理根茎组织表面的土壤及灰尘；剪除过多须根、根茎上的苞片、坏死组织及多余的组织，在造成尽量少的切面要求下切成大小合适的材料，便于后续消毒；用75%酒精棉球快速擦拭组织表面，并用酒精灯焰快速烤干组织表面残留乙醇；自然风干1天左右后用于分离；在无菌条件下，将表面消毒后的外植体用手术刀将其切成1cm×1cm的小段或薄片，用无菌镊子夹取接种于分离培养基上，每个培养皿均匀接种8-10个植物样本。接种后置于28℃培养2-6周。培养中随时注意观察并记录出菌及染菌情况，约1周后将平板倒置以保持水分。在固体培养基进行划线纯化，于相同条件下培养，挑选出单菌落再次纯化，重复多次，最后挑取单菌落转接至isp3斜面培养基，置于4℃短期保藏，同时取新鲜培养物加入灭菌的20%(w/v)甘油，置于-80℃作长期保藏。将纯化后编号为a301的单菌落进行多相分类鉴定。所用培养基配方如下：

富集及筛选培养基：分别称取0.25g酵母粉、0.5gk2hpo4、0.5mg核黄素、0.5mg硫胺素、0.25mg生物素、0.5mg烟酸、0.5mg泛酸钙、0.5mg肌醇、0.5mgvb6、0.5mg对氨基苯甲酸，加入1000ml蒸馏水，调节ph至7.0，再加入15g琼脂粉搅拌加热溶解后，分装，置于121℃下高压蒸汽灭菌20min。纯化及基础培养基：分别称取20g燕麦粉、1ml微量盐溶液，加入1000ml蒸馏水搅拌至溶解，调节ph至7.0，再加入15g琼脂粉搅拌加热溶解后，分装，置于121℃下高压蒸汽灭菌20min。微量盐溶液：0.1gfeso4·7h2o、0.1gmncl2·4h2o、0.1gznso4·7h2o、100ml蒸馏水、ph7.2。

菌种描述

该细菌为革兰氏阳性细菌，在isp3固体培养基上于28℃培养7d后，菌落表面呈皱褶状略有凸起，边缘杂乱，表面有白色的孢子产生，能产生大量无规则的气生菌丝，菌丝无横隔，不断裂。在10000倍扫描电镜下观察，菌丝能够分化成弯曲和直链的孢子链，孢子呈椭球形。氧化酶和过氧化氢酶均为阳性。nacl的耐受范围为0-5%，生长温度范围为10-37℃（最佳生长温度为28℃），ph生长范围为6.0-11.0（最佳生长ph为7.0）。明胶液化、淀粉水解、牛奶的凝固与胨化实验均为阳性，但mr实验及v-p实验均为阴性。同时，可水解吐温20、降解尿素和产生h2s，不能水解纤维素、吐温60和80。细胞壁肽聚糖类型为ll-二氨基庚二酸。全细胞水解产物包括半乳糖和核糖，细胞膜主要的甲基萘醌为mk-9(h6)和mk-9(h8)。全细胞的极性脂由双磷脂酰甘油(dpg)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰肌醇(pi)、两种未知结构的磷脂(pl)、两种未知结构的氨磷脂(apl)、三种未知结构的脂质(l)组成，其主要脂肪酸为c15:0,c16:0,anteiso-c15:0和iso-c16:0。基因组dna(g+c)含量为70.5mol%。

实施例二：链霉菌streptomycessp.a301的生长特性

分别配制nacl浓度为0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%和10%(w/v)的isp2固体培养基（4g酵母浸粉、10g麦芽浸粉、4g葡萄糖、15g琼脂、1000ml水、ph7.0），每个梯度设置三个平行，将新鲜菌种定量接种于每个平板中，置于28℃培养14天，取出观察其长势，从而确定其nacl浓度的耐受范围及最佳生长浓度；同理，分别用缓冲体系（ph4.0-5.0:0.1m柠檬酸/0.1m柠檬酸钠;ph6.0-8.0:0.1m磷酸二氢钾/0.1m氢氧化钠;ph9.0-10.0:0.1m碳酸氢钠/0.1m碳酸钠;ph11.0:0.05m磷酸氢二钠/0.1m氢氧化钠）配制成ph值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的isp2液体培养基，接种培养后分析其ph耐受范围及最佳生长ph；结合本实验现有条件以及综合考虑测定结果的可靠性及准确性，在测定实验菌株温度生长范围过程中，配制isp2固体培养基，将菌种接种于每个平板上，分别置于5℃、10℃、20℃、25℃、28℃、37℃、40℃和45℃下，培养14天后，观察其长势。结果表明，该链霉菌streptomycessp.a301的nacl耐受范围为0-5%，生长温度范围为10-37℃（最佳生长温度为28℃），ph生长范围为6.0-11.0（最佳生长ph为7.0）。

实施例三：链霉菌streptomycessp.a301的酶学特性

酶学特性实验初步测试了菌株产脂酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、硝酸还原酶及脲酶的能力。其中：1)以吐温20、吐温60和吐温80测定脂酶产生；2)采用明胶液化和牛奶凝固胨化实验测定蛋白酶产生；3)采用淀粉水解测定淀粉酶产生；4)纤维素分解测定纤维素酶产生；5)硝酸盐还原实验测定还原酶产生；6)利用尿素测定脲酶的产生。经检测，streptomycessp.a301具有氧化酶、过氧化氢酶、蛋白酶、脂酶、脲酶等酶活特性。

实施例五：链霉菌streptomycessp.a301的应用

配制isp2+1%tween20/tween60/tween80的培养基平板，划线接种后倒置于28℃培养一周，注意每天观察，若生长的菌落周围现模糊的晕圈即为阳性；反之，如没有显示晕圈，则为阴性。试验结果显示，该链霉菌streptomycessp.a301可在含有tween20的酯酶试验培养基上产生水解晕圈，表明其在酯酶相关生产领域具有广泛开发应用前景。

实施例四：链霉菌streptomycessp.a301的系统发育分析

采用酶解法提取streptomycessp.a301的基因组dna，pcr扩增其16srrna基因，经电泳检测合格后送样至上海生物工程有限公司完成测序，再将获得16srrna基因序列提交至ncbi的genbank，同时将其16srrna基因序列上传至ezbiocloud进行在线比对分析。将16srrna基因序列和与其同源性关系较近的相关模式菌株的16srrna基因序列从数据库中调出，然后利用clustalw进行多序列比对，并通过软件mega5.2以邻近连接法（neighbor-joiningmethod,nj）和最大似然法（maximumlikelihoodmethod,ml）来构建系统发育树。pcr所使用的引物、反应体系和条件详细如下：细菌通用引物27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3',1492r:5'-tacggctaccttgttacgactt-3'；50μl反应体系：2μldna模板，5μl引物27f，5μl引物1492r，1.5μldntps，31μlddh2o，0.5μltaqdnapolymerase，5μltaqbuffer；反应条件设定为：94℃预变性3min，95℃变性30s，52℃退火30s；72℃延伸1min45s，循环35次，最后在72℃保温10min。

实施例六：链霉菌streptomycessp.a301的基因组分析

配制isp2液体培养基，接菌摇床培养7天，收集菌体，抽提细菌的总dna。将dna样品送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行基因组测序，得到细菌的全基因组，并将基因组提交到genbank得到的保藏号为pjme00000000。对全基因组进行分析发现，基因组长度为10196496bp，含有8936个功能基因，gc含量为70.5mol%。此外，经antismash网站预测该基因组含有31个基因簇，其主要的次级代谢产物包括萜烯、吲哚-乳酸菌肽、丁内酯、嗜铁素、四氢嘧啶、细菌素、黑色素、聚酮合成酶、非核糖体多肽等，表明该菌在抗感染、抗真菌、抑菌等相关领域具有广泛开发应用前景。

实施例七：链霉菌streptomycessp.a301的抗菌活性

培养基制备采用水-琼脂作为下层，预先制备，每皿约10-15ml；以pda培养基作为上层，将其灭菌后，冷却至约45℃，再将配制好的烟曲霉菌悬液以适量混入pda培养基中，倒入预制的培养皿中，每皿约10-15ml；待培养基凝固后，用涂布器将streptomycessp.a301孢子悬液均匀的接种，每个样品设3个重复；平板随后置于28℃培养3天、7天，观察有无抑菌圈产生并记录其平均直径和菌的生长状况。经检测，链霉菌streptomycessp.a301对烟曲霉有抗性，能够正常生长，表明该菌在抗菌等相关领域具有开发应用前景。

序列表

<120>一株具有抗菌活性的链霉菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1551

<212>dna

<213>链霉菌a301(streptomycessp.a301)

<400>1

ccgtcgacgagctcagagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaaca60

catgcaagtcgaacgatgaacccgcttcggtgggggattagtggcgaacgggtgagtaac120

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