一株甲基杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一株甲基杆菌及其应用。
背景技术：
玉米是世界第二大作物，我国是世界第二大玉米生产国，年产玉米6750多万吨。玉米是我国需求量最大且应用领域广泛的主要粮食作物之一。在农业生产中，化肥和农药的大量施用造成了土壤退化、农作物质量与产量下降、生态环境恶化等问题，威胁我国食品及环境安全。因此利用微生物的生理性质，提供生产作物生长所需要的养分，或者提高土壤的颗粒性，或者抵抗环境中的病虫害，在安全优质农产品生产和生态环境保护中的地位不断提高。一碳有机化合物(one–carbonorganiccompounds)广泛存在于自然界中，甲基营养菌(methylotrophy)，是一类能够利用非c-c键低碳化合物(如甲烷、甲醇、甲醛类等)的微生物。由于这类细菌多为杆状，因此也称为甲基杆菌(methylotrophicbacteria)。甲基杆菌属的细菌大多数呈粉红色，它们通常被称作ppfm细菌(pink-pigmentedfacultativelymethylotrophicbacteria)。ppfm细菌通常寄生在植物根、茎、叶表上，尤以叶表最为丰富，ppfm以植物分泌的一碳化合物(如甲醇)为碳源，并产生植物激素如生长素(iaa)、细胞分裂素(ck)，并对植物氮代谢、种子发芽、光合作用、植物营养等有着正向作用。多数农作物在种子萌发和早期幼苗阶段对环境胁迫最为敏感。刚发芽的植物根接触肥料的速度，对于植物摄取肥料中存在的营养物的能力以及植物在前三周的初始发育和生长的成功性具有重要意义。采用种子包衣技术可使各种添加成分直接、均匀地分布在种子周围，而不必大量的分散在苗床里，使得肥料及农化产品的使用量大幅减少，减少农资成本的消耗，并且能使种子在储藏的过程中得到更多的保护，不容易丧失活力，特别对容易丧失活力的种子更具有重要作用。目前种子包衣剂绝大部份使用化学制剂，使用起来会造成化学残留，污染突然和水源，而生物种衣剂十分稀少。技术实现要素：发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明的第一个目的在于公开一株甲基杆菌。本发明的第二个目的在于公开一株甲基杆菌的应用。技术方案：一株甲基杆菌，分类命名为扭脱甲基杆菌(methylobacteriumextorquens)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15777，保藏日期为2018年5月21日。上述的甲基杆菌在制备微生物肥料中的应用。进一步地，添加该甲基杆菌制成微生物种子包衣剂。更进一步地，所述微生物种子包衣剂的的制备方法为：将甲基杆菌、水、噻虫嗪三者混合均匀，即得。更进一步地，该微生物种子包衣剂中活菌的数量≥106cfu/ml。更进一步地，甲基杆菌、水、噻虫嗪的质量比为(20～25)：(10～20)：(40～60)。更进一步地，甲基杆菌、水、噻虫嗪的质量比为25:20:55。有益效果：本发明公开的一株甲基杆菌及其应用具有以下有益效果：提供用于改良玉米种子至苗期生长过程中促进苗期生长的微生物种子包衣剂，该微生物种子包衣剂通过添加扭脱甲基杆菌成分，通过低毒、高效、环境友好的特点，减少玉米种植过程中的化肥及农药使用，进而实现高产；采用微生物种子包衣技术可使各种添加成分直接、高效且均匀地分布在种子周围，而不必的分散在苗床中，并且能使种子在储藏的过程中得到更多的保护，不容易丧失活力，特别对容易丧失活力的种子更具有重要作用。附图说明图1为本发明的甲基杆菌的平板培养图。图2为本发明的甲基杆菌的菌体形态图。图3为本发明的甲基杆菌的系统进化树图图4为玉米苗期第20d，实验组(右)与对照组植株(左)、空白种衣剂包衣(中)的生长对比图。具体实施方式：下面对本发明的具体实施方式详细说明。一、甲基杆菌菌株的分离与筛选样本自广西省崇左市大新县那岭乡的农田地里采集到的地瓜叶片。秤取1g地瓜叶片，加入到灭过菌的100ml浓度为0.1％的吐温水中，持掌上型破碎机将叶片打碎，取叶子液体梯度稀释至10-2、10-3浓度，然后涂布于ams固体无机盐培养基中，于28℃恒温培养箱中倒置培养5d，5d后挑粉红色单菌落，继续接种于ams固体无机盐培养基上，于28℃恒温培养箱中倒置培养5d，然后观察菌落型态，并用光学显微镜观察菌体型态(1000x)。ams固体无机盐培养基的配方为：无水磷酸氢二钾700mg、无水磷酸二氢钾540mg、七水合硫酸镁1g、无水氯化铵500mg、脱水氯化钙200mg、七水合硫酸铁4mg、七水合硫酸锌100μg、四水合氯化锰30μg、无水硼酸300μg、六水合氯化钴200μg、脱水氯化铜10μg、六水合氯化镍20μg、脱水钼酸钠60μg、琼脂15g，补水至1l，高温灭菌后加入0.22μm滤膜过滤后的甲醇5ml。菌落型态如图1所示。该菌株的菌落呈不透明的粉红色，形状为圆形，向上突起，边缘整齐，干燥。菌体型态如图2所示。该菌株的菌体无芽孢，无鞭毛，卵圆形。菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》进行。经鉴定，该菌株为甲基杆菌属，其主要生物学活性为g-，接触酶阳性，不能水解淀粉。随后，对该菌株的序列进行了16s序列片段(扩增引物与測序引物为27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'与1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3')测定，测定结果见序列表seqidno.1；序列16srrna序列同源性分析、系统发育分析，通过blast同源比对，我们确定该菌株最近的种属为甲基杆菌属。并经过甲基功能性基因mxaf基因(methanoldehydrogenasealphasubunit)片段(扩增引物与測序引物为：mxaf-f(f1003)5'-gcggcaccaactggggctggt-3'与mxaf-r(r1561)5'-gggcagcatgaagggctccc-3')测定，测定结果见序列表seqidno.2。经maxf序列同源性分析、系统发育分析得此甲基杆菌为扭脱甲基杆菌(methylobacteriumextorquens)。从genbank数据库中获得了甲基杆菌属的序列，并结合ncbi数据库的标准模式菌序列，利用mega5.0软件，采用邻接法(neighbor-joiningmethod)，进行了聚类分析和系统进化树构建，构建的系统进化树见图3。至此判定该菌株为扭脱甲基杆菌(methylobacteriumextorquens)；菌株记为甲基杆菌mn29385。随后，将甲基杆菌mn29385送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)进行保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年5月21日，保藏编号：cgmccno.15777。二、制备微生物肥料我们将甲基杆菌mn29385制成微生物种子包衣剂。该微生物种子包衣剂的制备过程具体如下：1、将甲基杆菌mn29385的原种接在培养皿上活化，然后再接种于试管斜面上备用；2、将试管中的菌种接种于装有100mlagps培养基的250ml摇瓶中，28℃恒温震荡培养至对数期；3、使用分光亮度仪测定摇瓶中菌液的浓度，当菌液的浓度达到108cfu/ml时，按照水10～20％、甲基桿菌的菌液20～25％、噻虫嗪40～60％的质量比混合，优选为水20％、甲基桿菌的菌液25％、噻虫嗪55％，然后用振荡仪振荡至物质溶解，即得到微生物种子包衣剂，经检测，该微生物种子包衣剂中活菌的数量大于106cfu/ml。agps培养基的配方为：无水磷酸氢二钾700mg、无水磷酸二氢钾540mg、七水合硫酸镁1g、无水氯化铵500mg、脱水氯化钙200mg、七水合硫酸铁4mg、七水合硫酸锌100μg、四水合氯化锰30μg、无水硼酸300μg、六水合氯化钴200μg、脱水氯化铜10μg、六水合氯化镍20μg、脱水钼酸钠60μg、甘油10g、蛋白胨10g，补水至1l，高温灭菌。三、进行玉米种植实验玉米种子使用：郑单958。土壤：碳土与珍珠岩按照2：1的体积比混合而成，灭菌后使用。选择大小差不多的玉米种子，将前面制备得到的微生物种子包衣剂以1:50～1:80的重量比例与玉米种子混和，使菌株均匀吸附于玉米种子上，晾干，得到包衣玉米种子，待用。取10颗包衣玉米种子于装有10ml无菌水的离心管中，振荡2～3min，使玉米种子上的菌株脱落于无菌水中，然后再稀释至10-2、10-3，将稀释液在ams平板上涂布计数，计算每颗种子的包衣菌数。实验组：将甲基杆菌种衣剂包衣玉米种子种植于10cm直径的小塑料盆中，每盆三颗种子，共30株，温室实验三次重复，采用随机区组排列，在玉米苗期第20d测定植株的平均株高、平均茎长、茎粗、平均鲜重。空白种衣剂包衣：将35％噻虫嗪种衣剂包衣的玉米种子种植于10cm直径的小塑料盆中，每盆三颗种子，共30株，温室实验三次重复，采用随机区组排列，在玉米苗期第20d测定植株的平均株高、平均茎长、茎粗、平均鲜重。对照组：将未包衣的玉米种子种植于10cm直径的小塑料盆中，每盆三颗种子，共30株，温室实验三次重复，采用随机区组排列，在玉米苗期第20d测定植株的平均株高、平均茎长、茎粗、平均鲜重。四、试验结果玉米苗期第20d，实验组(mn29385)、空白种衣剂包衣与对照组植株的生长情况见图4。玉米苗期第20d，实验组(mn29385)、空白种衣剂包衣与对照组植株的平均株高(cm)、平均茎长(cm)、茎粗(cm)、平均鲜重(g)具体如下：处理株高(cm)茎长(cm)茎粗(cm)鲜重(g)对照组33.75±2.419.47±0412.9±0.182.43±0.21空白种衣剂包衣33.16±2.849.78±0.383.01±0.122.41±0.19实验组37.42±2.6710.52±0.633.33±0.162.96±0.25由上表可知，玉米种子经过本发明的微生物种子包衣剂包衣后，无论是株高、茎长、茎粗，还是鲜重都明显优于对照组。五、结论本发明的甲基杆菌mn29385可明显促进植株生长，加强苗期健康，具有明显的增产潜力，且可与市面上昆虫防治种衣剂结合，在微生物种子包衣
技术领域：
具有高度应用弹性与价值。上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属
技术领域：
普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。序列表<110>广州菌落生物科技有限公司<120>一株甲基杆菌及其应用<130>1<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1299<212>dna<213>扭脱甲基杆菌(methylobacteriumextorquens)<400>1gtcagtggcagacgggtgagtaacacgtgggaacgtacccttcggttcggaataactcag60ggaaacttgagctaataccggatacgcccttttggggaaaggtttactgccgaaggatcg120gcccgcgtctgattagcttgttggtggggtaacggcctaccaaggcgacgatcagtagct180ggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggagg240cagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtgagtga300tgaaggccttagggttgtaaagctcttttgtccgggacgataatgacggtaccggaagaa360taagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggggctagcgttgctc420ggaatcactgggcgtaaagggcgcgtaggcggccgattaagtcgggggtgaaagcctgtg480gctcaaccacagaattgccttcgatactggttggcttgagaccggaagaggacagcggaa540ctgcgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcgcaagaacaccagtggcgaaggcggct600gtctggtccggttctgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagatacc660ctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgccagccgttggcctgcttgcaggtcagtggc720gccgctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaagg780aattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcaga840accttaccatcccttgacatggcatgttacctcgagagatcggggatcctcttcggaggc900gtgcacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcc960cgcaacgagcgcaacccacgtccttagttgccatcattcagttgggcactctagggagac1020tgccggtgataagccgcgaggaaggtgtggatgacgtcaagtcctcatggcccttacggg1080atgggctacacacgtgctacaatggcggtgacagtgggacgcgaagccgcgaggtggagc1140aaatccccaaaaaccgtctcagttcggattgcactctgcaactcgggtgcatgaaggcgg1200aatcgctagtaatcgtggatcagcacgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacaca1260ccgcccgtcacaccatgggagttggtcttacccgacggc1299<210>2<211>454<212>dna<213>扭脱甲基杆菌(methylobacteriumextorquens)<400>2tcacgcttcggatcgtacgagtcgtgaccctggttgtggtaacccatcgccgaggggcag60atgtccttggcgaggtggtccatccgggtgccgtattcgggatcgcgcaccggctggccc120gtcttgagatccaccgacttgaacacgttgaccgtgtcgtcgagcttgttcgccgagacg180agcgcgccgtcggtccggtcgagcgtgtagacgatgccgttgcggtccgggtgggtcagc240agcttgcgggccttgccgtccttgtccttctgctcggagagcatcatgacgttgacgccg300gcatagtcccactcgtcgtgcggggtcttctggtagccgaacttggcttcacccgtatcg360gcatcgcggccgaagatcgtcatcgtccacttgttgtcgcccggacgcatggtctcgttc420cacggcgccgggttgccggtgccgaagtagatca454当前第1页12