一种纤维素降解菌复合系的制作方法

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种纤维素降解菌复合系。

背景技术

农业有机废弃物是我国环境保护领域研究的重点和热点之一，利用堆肥技术将农业有机废弃物有效利用起来，是实现农业有机固体废物无害化、资源化的重要手段，也是保护农业生态环境、减少农业有机废弃物不当使用造成环境污染和资源浪费的重要措施。微生物在堆肥中的作用至关重要，很多研究都发现微生物能促进和优化堆肥过程，增加全氮、有效磷及速效钾等养分含量，提高堆肥品质等。微生物的研究和开发一直是堆肥领域的一大热点。

然而，微生物菌剂在实际使用时，由于受到周围环境中生物与非生物因素的影响，微生物的适应性和竞争力在复杂环境中往往会发生变化，例如堆肥中高温使降解菌失活，微生物在低温和碱性条件下降解纤维素的功能受影响等。为了增强微生物在堆肥中的作用效果，很多学者和专家研制复合微生物菌剂，但是，固体有机物堆肥发酵过程是一个极其复杂的微生物作用过程，温度和ph都是影响微生物生长的重要因素，现有技术中尚未培育出具有高稳定性、高降解率的纤维素降解菌复合系，而纤维素降解菌复合系的组合是需要进行筛选的，随意的组合不一定有利于菌株的生长，也可能直接抑制其生长，对组合菌的功能会起到不利的作用，也不便于复合菌的混合发酵培养。

技术实现要素：

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种纤维素降解菌复合系，在选用菌种的同时调整菌种配比，得到兼顾稳定性与高降解率的纤维素降解菌复合系。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种纤维素降解菌复合系，包括链格孢菌、链霉菌、厄氏菌和短梗霉菌，其配比为1：1：1：1。

上述的纤维素降解菌复合系的制备方法，包括以下步骤：

(1)复合菌系的提取：采集腐殖土、湖泊底泥、厕所周边粪土，以及牛粪，从中分离到链格孢菌、链霉菌、厄氏菌和短梗霉菌后，低温保存；

(2)将所述四种菌株接种到羧甲基纤维素钠液体发酵培养基中进行培养，在温度t、转速n的摇床上振荡培养，直至羧甲基纤维素钠液体发酵培养基中的液体不再粘稠。

优选地，步骤(2)中所述羧甲基纤维素钠液体发酵培养基为：蛋白胨3g，硫酸铵2g，酵母膏0.5g，kh2po44g，cacl2·2h2o0.3g，mgso4·7h2o0.3g，tween-800.2ml，cmc20g，蒸馏水1000ml混合溶液，混合均匀后，在121℃下灭菌20min，即得羧甲基纤维素钠液体发酵培养基。

优选地，步骤(2)中所述温度t为28℃。

优选地，步骤(2)中所述转速n为120r/min。

上述的纤维素降解菌复合系的应用，将所述纤维素降解菌复合系处理农业高纤维有机废弃物。

(三)有益效果

本发明提供了一种纤维素降解菌复合系，具有以下有益效果：

首先，现有技术中存在众多具有纤维素降解能力的菌株，本发明通过在现有技术中，进一步选用链格孢菌、链霉菌、厄氏菌和短梗霉菌制备为纤维素降解菌复合系，复合系的协同作用相比于单菌株对纤维素的降解作用，复合系的降解作用表现得更为高效，作用效率至少是其单菌株作用的2.33倍，同时限定其配比为1：1：1：1，消除复合微生物各菌株之间存在的拮抗作用，能有效的提高菌剂的纤维素降解效率，具有最佳的纤维素降解功能。

其次，堆肥过程中，ph值一般在5.5-8.5之间变化，一般是先降低再升高，温度变化则是先升温，再降温，高温期一般为50-60℃，本发明提供的纤维素降解菌复合系，在35℃-55℃温度范围内和ph6-ph10酸碱范围内表现出很高的纤维素酶活功能稳定性，并能正常分解纤维素。

附图说明

图1为本发明滤纸崩解试验的实验结果；

图2为本发明不同比例搭配的cm17对相同条件下同体积质量滤纸的72小时崩解效应实验的实验结果；

图3-7为本发明25组纤维素降解菌复合系(cm1-cm25)酶活测定实验的实验结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种纤维素降解菌复合系，包括链格孢菌、链霉菌、厄氏菌和短梗霉菌，其配比为1：1：1：1。

上述纤维素降解菌复合系的制备方法，包括以下步骤：

(1)复合菌系的提取：采集昆明西郊玉鞍山腐殖土、昆明滇池底泥、厕所周边粪土，以及大理牛粪，从中分离到链格孢菌、链霉菌、厄氏菌和短梗霉菌后，低温保存；

(2)培养基的制备：将蛋白胨3g，硫酸铵2g，酵母膏0.5g，kh2po44g，cacl2·2h2o0.3g，mgso4·7h2o0.3g，tween-800.2ml，cmc20g，蒸馏水1000ml，混合均匀后，在125℃下灭菌15min，即得羧甲基纤维素钠液体发酵培养基。

(3)将所述四种菌株接种到羧甲基纤维素钠液体发酵培养基中进行培养，在25℃、130r/min的摇床上振荡培养，直至羧甲基纤维素钠液体发酵培养基中的液体不再粘稠。

上述纤维素降解菌复合系的应用，将所述纤维素降解菌复合系处理农业高纤维有机废弃物。

实施例2：

一种纤维素降解菌复合系，包括链格孢菌、链霉菌、厄氏菌和短梗霉菌，其配比为1：1：1：1。

上述纤维素降解菌复合系的制备方法，包括以下步骤：

(1)复合菌系的提取：采集昆明西郊玉鞍山腐殖土、昆明滇池底泥、厕所周边粪土，以及大理牛粪，从中分离到链格孢菌、链霉菌、厄氏菌和短梗霉菌后，低温保存；

(2)培养基的制备：将蛋白胨3g，硫酸铵2g，酵母膏0.5g，kh2po44g，cacl2·2h2o0.3g，mgso4·7h2o0.3g，tween-800.2ml，cmc20g，蒸馏水1000ml，混合均匀后，在115℃下灭菌25min，即得羧甲基纤维素钠液体发酵培养基。

(3)将所述四种菌株接种到羧甲基纤维素钠液体发酵培养基中进行培养，在29℃、110r/min的摇床上振荡培养，直至羧甲基纤维素钠液体发酵培养基中的液体不再粘稠。

上述纤维素降解菌复合系的应用，将所述纤维素降解菌复合系处理农业高纤维有机废弃物。

实施例3：

一种纤维素降解菌复合系，包括链格孢菌、链霉菌、厄氏菌和短梗霉菌，其配比为1：1：1：1。

上述纤维素降解菌复合系的制备方法，包括以下步骤：

(1)复合菌系的提取：采集昆明西郊玉鞍山腐殖土、昆明滇池底泥、厕所周边粪土，以及大理牛粪，从中分离到链格孢菌、链霉菌、厄氏菌和短梗霉菌后，低温保存；

(2)培养基的制备：将蛋白胨3g，硫酸铵2g，酵母膏0.5g，kh2po44g，cacl2·2h2o0.3g，mgso4·7h2o0.3g，tween-800.2ml，cmc20g，蒸馏水1000ml，混合均匀后，在120℃下灭菌20min，即得羧甲基纤维素钠液体发酵培养基。

(3)将所述四种菌株接种到羧甲基纤维素钠液体发酵培养基中进行培养，在28℃、120r/min的摇床上振荡培养，直至羧甲基纤维素钠液体发酵培养基中的液体不再粘稠。

上述纤维素降解菌复合系的应用，将所述纤维素降解菌复合系处理农业高纤维有机废弃物。

实施例4：

一种纤维素降解菌复合系，包括链格孢菌、链霉菌、厄氏菌和短梗霉菌，其配比为1：1：1：1。

上述纤维素降解菌复合系的制备方法，包括以下步骤：

(1)复合菌系的提取：采集昆明西郊玉鞍山腐殖土、昆明滇池底泥、厕所周边粪土，以及大理牛粪，从中分离到链格孢菌、链霉菌、厄氏菌和短梗霉菌后，低温保存；

(2)培养基的制备：将蛋白胨3g，硫酸铵2g，酵母膏0.5g，kh2po44g，cacl2·2h2o0.3g，mgso4·7h2o0.3g，tween-800.2ml，cmc20g，蒸馏水1000ml，混合均匀后，在121℃下灭菌22min，即得羧甲基纤维素钠液体发酵培养基。

(3)将所述四种菌株接种到羧甲基纤维素钠液体发酵培养基中进行培养，在27℃、115r/min的摇床上振荡培养，直至羧甲基纤维素钠液体发酵培养基中的液体不再粘稠。

上述纤维素降解菌复合系的应用，将所述纤维素降解菌复合系处理农业高纤维有机废弃物。

实施例5：

一种纤维素降解菌复合系，包括链格孢菌、链霉菌、厄氏菌和短梗霉菌，其配比为1：1：1：1。

上述纤维素降解菌复合系的制备方法，包括以下步骤：

(1)复合菌系的提取：采集昆明西郊玉鞍山腐殖土、昆明滇池底泥、厕所周边粪土，以及大理牛粪，从中分离到链格孢菌、链霉菌、厄氏菌和短梗霉菌后，低温保存；

(2)培养基的制备：将蛋白胨3g，硫酸铵2g，酵母膏0.5g，kh2po44g，cacl2·2h2o0.3g，mgso4·7h2o0.3g，tween-800.2ml，cmc20g，蒸馏水1000ml，混合均匀后，在121℃下灭菌20min，即得羧甲基纤维素钠液体发酵培养基。

(3)将所述四种菌株接种到羧甲基纤维素钠液体发酵培养基中进行培养，在28℃、120r/min的摇床上振荡培养，直至羧甲基纤维素钠液体发酵培养基中的液体不再粘稠。

上述纤维素降解菌复合系的应用，将所述纤维素降解菌复合系处理农业高纤维有机废弃物。

为了进一步说明本发明的有益效果，选用本发明实施例5中制备的纤维素降解菌复合系与原料中四种菌在同等条件下进行滤纸崩解试验，实验结果见图1，其中滤纸崩解试验的具体操作方法为：将复合系的4株菌分别接种到液体发酵培养基中，接种量均为5％，28℃恒温摇床，120r/min振荡培养1-7天不等(根据各种菌的生长状况确定)，得到菌种扩大培养液。在滤纸条液体发酵培养基中分别接入一定量的菌液(单一菌液，复合菌液以及空白对照)，并在发酵液中加入一根1.0cm×5.0cm的滤纸条，观察滤纸崩解情况。

将链格孢菌(alternariaalternate)、链霉菌(streptomycessp.)、短梗霉菌(aureobasidiumsp.)和厄氏菌(oerskoviasp.)按照4因素3水平构建9组不同比例混合的cm17，研究这些不同比例搭配的cm17对相同条件下同体积质量滤纸的72小时崩解效应，并记录结果为图2。

将20株供试菌株随机分成4组，每组5株菌，按照4因素5水平正交表组合构建得到25组纤维素降解菌复合系(cm1-cm25)，其中cm17为本发明所述4种微生物，链格孢菌(alternariaalternate)、链霉菌(streptomycessp.)、短梗霉菌(aureobasidiumsp.)和厄氏菌(oerskoviasp.)的组合，对25组纤维素降解菌复合系进行酶活测定，具体操作如下：

把cm1-cm25等复合系分别接种到250ml三角瓶cmc液体发酵培养基中，放置到摇床上，120r/min，28℃恒温振荡培养，直到三角瓶cmc液体发酵培养基中的液体不再粘稠，再采用dns法对各复合系的混合发酵液进行测定：

第一组：取cm1-cm25等复合系的混合发酵液0.5ml，加入2ml1％cmc作为反应底物，ph自然，采用dns法分别测定复合系酶液在35℃、45℃和55℃条件下反应30min的cmc酶活。

第二组：取cm1-cm25等复合系的混合发酵液0.5ml，加入2ml1％cmc作为反应底物，反应温度55℃，采用dns法分别测定复合系酶液在ph6、ph7.5和ph10条件下反应30min的cmc酶活。

第三组：取cm1-cm25等复合系的混合发酵液0.5ml，加入1/8片滤纸(重为62±5mg)作为反应底物，同时加入ph4.8柠檬酸缓冲液，采用dns法测定各复合系在55℃，反应60min的fpa滤纸酶活。

并将实验数据记录在图3-7中。

分析图1可知，复合系和这4种菌在同等条件下崩解同等质量和大小的滤纸条所需要的时间和降解率如下图所示(图6)。alternariaalternate、streptomycessp.、aureobasidiumsp.和oerskoviasp.单独作用降解滤纸，所需要的时间分别为7d、18d、11d、15d，降解效率分别为14.29％、5.56％、9.09％和6.67％；当这4种微生物组合为复合系cm17时，其降解滤纸仅要3d，降解效率为33.33％。相比于单菌株对滤纸的降解作用，复合系对滤纸的作用表现得更为高效，作用效率至少是其单菌株作用的2.33倍。由此可见，复合系比单菌株更能够提高纤维素的分解效率，复合系存在对纤维素的协同降解效应。

分析图2可知，复合系对纤维素的降解受到4种菌株搭配比例的影响。当4种降解菌的搭配比例为1：1：1：1时，cm17的滤纸分解率最高，可达35.79％；而当混合比例为1:3:3:3时，复合系的滤纸分解率最低，仅为0.22％；当混合比例为3:1:3:2时，复合系的滤纸分解率为18.97％，仅次于1：1：1：1，但是该搭配比例下的分解率仅是1：1：1：1时的53％。该结果表明，cm17复合系中，4种菌的添加比例会影响cm17的纤维素的降解能力，链格孢菌、链霉菌、厄氏菌和短梗霉菌按照1：1：1：1搭配的复合系，能有效的提高菌剂的纤维素降解效率，具有最佳的纤维素降解功能。

分析图3-7可知，47.62％的复合系在35℃、45℃、55℃、ph6、ph7.5、ph10条件下，表现得极不稳定，例如cm3等10组复合系，对某些温度和ph的极不适应导致酶活功能丧失；其他52.38％的复合系对温度变化和酸碱ph变化表现出一定程度适应和cmc酶活，然而并不完全稳定，其在不同温度和不同酸碱条件下的平均cmc酶活变化范围为7.9136u/ml～98.1433u/ml，其中，多条件平均cmc酶活最高的为复合系cm17，其在35℃、45℃、55℃、ph6、ph7.5和ph10的cmc酶活分别为130.2597u/ml、107.7475u/ml、95.4294u/ml、54.2985u/ml、95.6429u/ml和105.4821u/ml，该复合系对35℃、45℃、55℃、ph6、ph7.5、ph10表现出很高的温度和ph适应性，以及cmc酶活功能稳定性；此外，cm17的fpa滤纸酶活也表现较佳，为23.7158u/ml。相比于其他复合系，cm17对35℃、45℃、55℃、ph6、ph7.5、ph10都具有较高的适应性和降解纤维素的功能稳定性。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，包括语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。