本发明涉及保健酒加工
技术领域：
，具体涉及一种黑豆多肽酒及其制备方法。
背景技术：
黑豆，是表皮为黑色的大豆，民间多称黑小豆或马科豆，是一种药食两用且营养丰富的保健食材，有豆中之王的美称。随着人们对黑豆的营养成分和功能性物质的研究不断加深，使得它在许多行业都受到不同程度的重视，特别是在食品、医药、化工等行业，黑豆及其衍生物都已得到了广泛的应用。其中在食品行业中，利用黑豆及其提取物的多种功能性质，如抗衰老、缓解更年期症状、预防骨质疏松、乳腺癌、老年痴呆、心血管疾病等，研发出了很多相关的保健食品。例如刑建华、侯巧志等以黑豆和红枣为主要原料，添加乳化剂和稳定剂制成黑豆红枣乳，接种乳酸菌后在一定条件下进行发酵，制成黑豆红枣发酵饮料。张琳静等用自制的黑豆肽配以新鲜牛奶，研制一种营养型乳饮料。曾荣、董华强等以黑豆和铁观音为原料，经过浸泡、热磨、过滤、复配等工艺，制成的豆奶在口感、气味、组织状态和色泽方面均良好。翟玮玮利用固稀发酵工艺生产黑豆酱油，提高了酱油的营养价值。黑龙江省农科院大豆所以黑大豆为主料，研究和开发出了一系列的黑大豆食品，如归元口服液和黑豆营养糊等。随着保健酒市场普及率的提高，保健酒被越来越多的消费者所接受，市场发展前景乐观。随着消费者保健意识的增强，对保健酒产品的品质要求也越来越高。目前市场上的保健酒多采用浸渍的方法，采用直接发酵法生产保健酒的品种不多，尤其是采用蛋白质酶解液直接发酵制备多肽酒的报道不多。对于豆类多肽产品的研制，目前有乳清多肽酒和豆乳酒等，但利用黑豆蛋白酶解制备黑豆多肽液进而发酵成黑豆多肽酒还未有相关报道。技术实现要素：针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种黑豆多肽酒及其制备方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供一种黑豆多肽酒的制备方法，包括以下步骤：(1)将黑豆蛋白进行酶解，得到黑豆多肽液；(2)将牛蒡切成薄片，置于含柠檬酸钠的水溶液中浸泡10-15min，干燥，得到预处理后的牛蒡样品；向预处理后的牛蒡样品中加入25-30重量倍的乙醇溶液进行闪式提取，所述乙醇溶液的体积浓度为70-80％，提取电压为100v，提取时间为45-55s，提取次数为2次，得到牛蒡提取液；将牛蒡提取液微波干燥，得到牛蒡提取物；(3)将银杏叶干燥后粉碎成80-100目细粉，加入6-8重量倍的水，80-100℃下浸提1-3h，过滤，弃去滤渣，滤液浓缩干燥，得到银杏提取物；(4)将黑豆多肽液、牛蒡提取物和银杏提取物混合，再加入蔗糖、无水亚硫酸钠和水，灭菌，作为发酵基质；调节发酵基质中的黑豆多肽含量为1.0％，牛蒡提取物含量为2.0-4.0％，银杏提取物含量为1.0-3.0％，蔗糖含量为12-16％，无水亚硫酸钠含量为0.4-0.6％；(5)向发酵基质中接入酵母菌，26℃下发酵9天；(6)采用离心的方法对发酵液进行澄清，即得到黑豆多肽酒。优选的，步骤(1)中，所述酶解的具体方法为：先用alcalase碱性蛋白酶，在温度为60℃、ph为8.5的条件下水解黑豆蛋白；30min后再加入flavourzyme风味蛋白酶，在温度为50℃、ph为7.0的条件下酶解30min；之后再加入neutrase中性蛋白酶，在温度为50℃的条件下酶解1h。优选的，步骤(2)中，将牛蒡切成厚度为0.3-0.5cm的薄片。优选的，步骤(2)中，含柠檬酸钠的水溶液中柠檬酸钠的质量浓度为2-4％。优选的，步骤(2)中，所述微波干燥控制真空压力为-0.1-0.05mpa，干燥温度为40-50℃。优选的，步骤(4)中，调节发酵基质中的黑豆多肽含量为1.0％，牛蒡提取物含量为4.0％，银杏提取物含量为2.0％，蔗糖含量为16％，无水亚硫酸钠含量为0.5％。优选的，步骤(5)中，所述酵母菌的接入量为发酵基质重量的1.2‰。优选的，步骤(5)中，所述酵母菌为安琪酵母股份有限公司生产的安琪酵母。优选的，步骤(6)中，离心转速为3500r/min，离心时间为10min。本发明的第二方面，提供上述方法制备得到的黑豆多肽酒。本发明制备的黑豆多肽酒澄清透明，呈浅黄色，无沉淀或者悬浮物，其感官鉴评得分为88.6以上。本发明的有益效果：采用本发明的方法制备的黑豆多肽酒色、香、味丰富，口感协调，具有很好的抗氧化性，保健功能突出，丰富了我国保健酒市场，提高了黑豆利用的附加值。附图说明图1：多肽含量对酒精度的影响；图2：多肽含量对可溶性固形物的影响；图3：加糖量对酒精度的影响；图4：加糖量对可溶性固形物的影响；图5：多肽含量测定标准曲线。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
背景技术：
部分所介绍的，目前市场上的保健酒多采用浸渍的方法，采用直接发酵法生产保健酒的品种不多，尤其是采用蛋白质酶解液直接发酵制备多肽酒的报道不多。基于此，本发明的目的是提供一种黑豆多肽酒，由黑豆蛋白酶解制备的黑豆多肽液发酵而成。在本发明的一种实施方案中，给出的黑豆多肽酒的制备方法包括以下步骤：(1)将黑豆蛋白进行酶解，所述酶解的具体方法为：先用alcalase碱性蛋白酶，在温度为60℃、ph为8.5的条件下水解黑豆蛋白；30min后再加入flavourzyme风味蛋白酶，在温度为50℃、ph为7.0的条件下酶解30min；之后再加入neutrase中性蛋白酶，在温度为50℃的条件下酶解1h，得到黑豆多肽液；(2)将牛蒡切成厚度为0.3-0.5cm的薄片，置于质量浓度为2-4％的柠檬酸钠的水溶液中浸泡10-15min，干燥，得到预处理后的牛蒡样品；向预处理后的牛蒡样品中加入25-30重量倍的乙醇溶液进行闪式提取，所述乙醇溶液的体积浓度为70-80％，提取电压为100v，提取时间为45-55s，提取次数为2次，得到牛蒡提取液；将牛蒡提取液微波干燥，得到牛蒡提取物；(3)将银杏叶干燥后粉碎成80-100目细粉，加入6-8重量倍的水，80-100℃下浸提1-3h，过滤，弃去滤渣，滤液浓缩干燥，得到银杏提取物；(4)将黑豆多肽液、牛蒡提取物和银杏提取物混合，再加入蔗糖、无水亚硫酸钠和水，灭菌，作为发酵基质；调节发酵基质中的黑豆多肽含量为1.0％，牛蒡提取物含量为2.0-4.0％，银杏提取物含量为1.0-3.0％，蔗糖含量为12-16％，无水亚硫酸钠含量为0.4-0.6％；(5)向发酵基质中接入酵母菌，26℃下发酵9天；(6)采用离心的方法对发酵液进行澄清，离心转速为3500r/min，离心时间为10min，即得到黑豆多肽酒。本发明采用多酶分步水解的方法制备黑豆多肽，可以充分利用不同酶的最适ph和酶解温度，提高黑豆蛋白的酶解率，使制备的黑豆多肽具有抗氧化特性。本发明的制备方法中，发酵基质的组成是影响制备的黑豆多肽酒的营养组成、风味、口感和功能的关键所在。本发明的发酵基质中含有黑豆蛋白的酶解液，酶解液中的蛋白质酶分解成氨基酸和多肽，为酵母菌的生长繁殖提供了必不可少的营养物质，促进了酵母的发酵。特别的，本发明还在发酵基质中添加了牛蒡提取物和银杏提取物，可以降低黑豆多肽的苦味，改善口感，使发酵酒的滋味更加醇和，同时还可以提高发酵酒的抗氧化能力。本发明的发酵基质中还含有一定量的无水硫酸钠，其能够在一定程度上抑制非酵母物质的发酵过程，主导整个发酵进行。因此，本发明的发酵基质中，各原料组分是一个有机的整体，缺一不可。发明人在研发过程中发现，减少上述发酵基质中的任何一种原料组分，或以具有相似性质的原料进行替换，则发酵基质整体的作用效果显著降低；在本发明的发酵基质的基础上再增加其他的原料组分，发酵基质的整体效果并未有明显的改善，甚至有发酵基质的整体效果降低的情况出现。发酵基质中的各原料的加入量也非常关键，酵母菌的发酵与酵母的生长代谢所需营养物质是黑豆多肽，多肽含量的增加促进酵母菌的发酵的加快，发酵的过程产生酒精并引起可溶性固形物的降低(图1和图2)。但当多肽含量大于1％时，酒精度的增大趋势和可溶性固形物的降低速率趋势都趋于稳定，没有明显的变化，而且随着多肽含量的增加，酒精度和可溶性固形物含量没有明显变化，这时如果增加多肽含量反而对多肽酒澄清造成困难且浪费原料，因此选择发酵基质中多肽含量为1％。加糖量对黑豆多肽酒发酵的影响结果如图3和4所示。由图可知，加糖量低的情况下，酒精度也趋于平缓，可溶性固形物的含量在发酵第7天时不再下降，发酵过程接近于尾声，最终的多肽酒酒精度也较低。当加糖量为12％-16％时，发酵酒度和可溶性固形物的含量的变化趋势趋于一致。当加糖量增至24％时起始发酵速率较慢，是因为受到渗透压的影响，但经过几天的适应后，发酵液中糖分含量高的优势开始凸显，发酵中期的速度也因为糖分充足而明显加快，发酵末期的酒精度变化仍然很大。所以综合考虑，根据发酵末期的酒精度和可溶性固形物含量的变化趋势，因此选12％～16％的加糖量较为合适。无水硫酸钠的加入量主要影响发酵的进程，若无水硫酸钠的加入量过少，则会导致非酵母物质发酵过程的产生；若无水硫酸钠的加入量过多，则会对酵母菌的发酵过程产生抑制。综合考虑，本发明的发酵基质中选择无水硫酸钠的加入量为0.4-0.6％。经发酵后制备的发酵液中会含有一些沉淀或者悬浮物，因此需要对发酵液进行澄清以制备黑豆多肽酒。本发明采用离心的方法进行澄清，但是，黑豆多肽酒的抗氧化特性会随着离心速率的增大和时间的延长而出现不同程度的降低。为保证黑豆多肽酒的澄清度和抗氧化性能，本发明选择的离心条件为：3500r/min离心10min。由于牛蒡多酚的性质不稳定，极易被降解，而闪式提取是依靠转头的高速旋转，将药物磨碎，此过程会产生热量，因此，即使是采用闪提法也有可能会造成牛蒡多酚的降解，影响牛蒡多酚的提取率。本发明意外的发现，在闪式提取之前，将牛蒡用一定浓度的柠檬酸钠水溶液浸泡一段时间，可以有效提高牛蒡中多酚类物质的稳定性，减少其在提取过程中出现降解，提高了牛蒡多酚的提取率。柠檬酸钠水溶液的浓度和浸泡时间对于牛蒡多酚稳定性的保护效果而言是非常关键的，只有合适的浓度和浸泡时间才会对牛蒡中多酚类化合物的稳定性起到保护作用。本发明经多次试验发现，柠檬酸钠水溶液中柠檬酸钠的质量浓度为2-4％，浸泡时间为10-15min时，其对牛蒡中多酚类化合物的稳定性的保护效果最优。在闪提过程中，提取电压的提高会促进物料细胞壁的破裂，有利于多酚类物质释放到溶液中去；但是，随着提取电压的提高，会导致提取液的温度提高，从而加快多酚的氧化。经综合考虑，本发明将提取电压设定为100v，该提取电压下，一方面可以保证多酚类物质能被充分的释放到溶液中去，另一方面可以尽量避免多酚的氧化。与别的提取方法不同的是，闪提是需要将刀头浸入溶剂中，需要一定的溶剂高度，另外，物料在高速旋转过程中被粉碎，溶液黏度增加，为了提高成分在溶液中扩散速度，需要增加溶剂用量；当加液量达到一定程度时，提取率增势趋于和缓，但又因为过多的提取溶剂会增加后续的处理的工作量。综合考虑，本发明选择提取溶剂的加入量为预处理后的牛蒡样品的25-35重量倍，其中，提取溶剂的加入量为预处理后的牛蒡样品的30重量倍时，其提取效果最佳。闪式提取中，随着提取时间的增加，牛蒡多酚的得率呈现增大趋势。在提取时间为20s至40s时，多酚提取率稳步上升，40s至50s范围内提取率有明显大幅上升，大于50s后多酚得率显现下降趋势。得率下降的出现可能是由于提取器的部件经长时间高速摩擦产生的热效应以及溶液中分子高速运动带来的热量使得一部分不稳定的多酚发生分解。综合以上考虑，选择50s的提取时间进行研究最为适宜。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明中所使用的碱性蛋白酶alcalase、中性蛋白酶neutrase和风味蛋白酶flavourzyme均购于诺维信生物技术有限公司。实施例1：黑豆多肽酒的制备1.黑豆蛋白的制备：(1)黑豆的预处理从市场选购黑豆，清洗干净，去皮，将去皮黑豆放入粉碎机中进行粉碎，粉碎后过50目筛，将过筛黑豆粉装好，放入干燥箱中待用。(2)黑豆粉脱脂采用石油醚脱脂法从黑豆粉中脱去黑豆脂肪以及一些溶于有机试剂的物质，黑豆粉与石油醚以1:10比例，用保鲜膜封口，常温下在数显磁力搅拌器上搅拌3h，倾去上清液(黄色的，含石油醚、水和脂肪等)，再加入新石油醚继续搅拌3h，然后静置5h以上，倾去上清液，将沉淀部分取出风干，直至风干变为白色粉末，再干燥待用。(3)制备黑豆蛋白称取一定质量的脱脂黑豆粉，其固液比为1:10的比例加入蒸馏水，常温下在数显磁力搅拌器上搅拌，直到脱脂黑豆粉与蒸馏水混合均匀。再使用校正好的ph计，用1mol/l的naoh溶液调上述溶液ph为8.0，搅拌30min后再采用4000r/min速度离心15min去除豆粉中不溶性物质。取其上清液用2mol/l的hcl溶液调上清液的ph值为4.5，再以4000r/min条件下离心15min，使蛋白质处于等电点状态而凝聚产生沉淀下沉。最后取出沉淀水洗离心两次，弃去上清液，所得沉淀即为黑豆蛋白，随后冷冻干燥后待用。2.黑豆多肽的制备：采用多酶分步水解的方法制备黑豆多肽，鉴于alcalase碱性蛋白酶的最适ph为7-9，温度为55-70℃；neutrase中性蛋白酶的最适ph为5.5-7.5，温度为55-70℃；flavourzyme风味蛋白酶的最适ph为5.0-7.5，温度为50-65℃。先用底物蛋白浓度的2％的alcalase碱性蛋白酶，在温度为60℃、ph为8.5水解黑豆蛋白，ph值不断下降，约30min后溶液的ph降到7.0左右，这时候再加入底物蛋白浓度3％的flavourzyme风味蛋白酶，在温度为50℃的情况下酶解30min，之后再加入2％的neutrase中性蛋白酶，在温度为50℃的条件下酶解1h，进一步提高它的酶解率，制得具有抗氧化特性的黑豆多肽。3.牛蒡提取物的制备：将牛蒡切成厚度为0.3-0.5cm的薄片，置于质量浓度为3％的柠檬酸钠的水溶液中浸泡15min，干燥，得到预处理后的牛蒡样品；向预处理后的牛蒡样品中加入30重量倍的乙醇溶液进行闪式提取，所述乙醇溶液的体积浓度为75％，提取电压为100v，提取时间为50s，提取次数为2次，得到牛蒡提取液；将牛蒡提取液微波干燥，得到牛蒡提取物。4.银杏提取物的制备：将银杏叶干燥后粉碎成80-100目细粉，加入8重量倍的水，100℃下浸提2h，过滤，弃去滤渣，滤液浓缩干燥，得到银杏提取物。5.发酵基质的制备：将黑豆多肽、牛蒡提取物和银杏提取物混合，再加入蔗糖、无水亚硫酸钠和水，灭菌，作为发酵基质；调节发酵基质中的黑豆多肽含量为1.0％，牛蒡提取物含量为4.0％，银杏提取物含量为2.0％，蔗糖含量为16％，无水亚硫酸钠含量为0.5％；以上均为重量百分比。6.发酵：向发酵基质中按1.2‰接入安琪酵母，26℃下发酵9天；7.澄清：采用离心的方法对发酵液进行澄清，离心转速为3500r/min，离心时间为10min，即得到黑豆多肽酒。对比例1：调节发酵基质的组成，发酵基质中的黑豆多肽含量为1.0％，蔗糖含量为16％，无水亚硫酸钠含量为0.5％。向发酵基质中按1.2‰接入安琪酵母，26℃下发酵9天；采用离心的方法对发酵液进行澄清，离心转速为3500r/min，离心时间为10min，即得到黑豆多肽酒。对比例2：调节发酵基质的组成，发酵基质中的黑豆多肽含量为1.0％，蔗糖含量为16％。向发酵基质中按1.2‰接入安琪酵母，26℃下发酵9天；采用离心的方法对发酵液进行澄清，离心转速为3500r/min，离心时间为10min，即得到黑豆多肽酒。对比例3：调节发酵基质的组成，发酵基质中的黑豆多肽含量为1.0％，蔗糖含量为16％，无水亚硫酸钠含量为0.5％。向发酵基质中按1.2‰接入安琪酵母，26℃下发酵9天；发酵液过滤，即得到黑豆多肽酒。对比例4：调节发酵基质的组成，发酵基质中的黑豆多肽含量为1.0％，牛蒡提取物含量为4.0％，蔗糖含量为16％，无水亚硫酸钠含量为0.5％。向发酵基质中按1.2‰接入安琪酵母，26℃下发酵9天；采用离心的方法对发酵液进行澄清，离心转速为3500r/min，离心时间为10min，即得到黑豆多肽酒。对比例5：调节发酵基质的组成，发酵基质中的黑豆多肽含量为1.0％，银杏提取物含量为2.0％，蔗糖含量为16％，无水亚硫酸钠含量为0.5％。向发酵基质中按1.2‰接入安琪酵母，26℃下发酵9天；采用离心的方法对发酵液进行澄清，离心转速为3500r/min，离心时间为10min，即得到黑豆多肽酒。试验例1：黑豆多肽酒中酒精含量测定、多肽含量测定及感官评定1.酒精含量测定：用容量瓶取100ml酒样于500ml蒸馏瓶中，加100ml水和数粒玻璃珠，装好冷凝器，以100ml容量瓶接收溜出液，约95ml时取下，加水定容至刻度，摇匀，将溜出液倒入100ml量筒中，轻轻放入温度计和酒精计，至酒精计能浮起来，并在静止时读数，然后查《酒精相对密度与酒精度对照表》换算成酒精度。实施例1、对比例1-3制备的黑豆多肽酒的酒精含量测定结果见表1。表1：酒精含量测定结果产品酒精含量(％)实施例19.8对比例18.4对比例27.5对比例39.32.多肽含量测定：(1)标准曲线的绘制取六只试管，分别编号，按照表2-4加入所需试剂，必须先加入试剂a创造碱性条件，然后再加入双缩脲试剂b，双缩脲试剂的用量一共为4ml，混匀后室温情况下放置30min，然后于540nm处测定其吸光值，其a试剂与b试剂的比例为3:2，便于待测物质与双缩脲b试剂反应。以牛血清蛋白含量为横坐标，测得吸光值为纵坐标，绘制标准曲线的回归方程(图5)。(2)黑豆多肽含量的测定将0.9ml蒸馏水，加入2.4ml双缩脲试剂a加入0.1ml的待测样品中，混匀后加入1.6ml双缩脲试剂b，同时做三个重复，以空白试剂作为参比，分别测定其吸光度值，计算待测样品种多肽含量。根据标准曲线回归方程计算得到多肽含量。实施例1、对比例1-3制备的黑豆多肽酒的酒精含量测定结果见表2。表2：多肽含量测定结果产品多肽含量(mg/ml)实施例19.28对比例18.25对比例27.64对比例38.363.感官评定：评价员用清晰、准确的分档定性描述样品的各类评分指标如(表3)对产品进行感官评定。根据每位评价员的得分计算出平均每个样品的感官评分。表3：黑豆多肽酒感官评分标准注：括号内代表评分值。实施例1、对比例1-3制备的黑豆多肽酒的感官评分测定结果见表4。表4：黑豆多肽酒的感官评分测定结果产品感官评定实施例188.6对比例164.5对比例271.2对比例374.7由表4可以看出，本发明制备的黑豆多肽酒其色泽、状态、口感、味道和气味均优于对比例1-对比例3制备的多肽酒。试验例2：黑豆多肽酒的抗氧化性测定一、试验方法：(1)dpph·清除能力测定分别在发酵的第1至第9天取一定浓度的样品溶液4ml，加入1ml用无水乙醇(分析纯)配制的dpph·溶液并使dpph·终浓度为0.1mmol/l。用力振摇混匀然后，放在暗室中静置30min，于517nm下测定吸光度。按下式计算dpph·清除率。dpph·清除率％＝100×[1-(ax-axo)/ao]式中：ax为加入dpph·和样品溶液后的吸光度；axo为样品溶液的吸光度；ao为蒸馏水和dpph·的吸光度。(2)o2-·清除率测定分别在发酵的第1至第9天，采用邻苯三酚自氧化法测定。取50mmol/ltris-hcl缓冲液(ph8.2)4.5ml置于25℃水浴锅保温20min，分别加入0.4ml的25mmol/l邻苯三酚溶液和1ml样品溶液，混匀后在25℃水浴反应5min，加入1ml的8mmol/lhcl停止反应，于299nm处测定吸光度ax，空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。每个试样做3个平行样，取平均值，按下式计算o2-·清除率。o2-·清除率/％＝100×(ao-ax)/ao式中：ao为空白对照溶液吸光度；ax为样品溶液的吸光度。(3)还原能力测定分别在发酵的第1至第9天，采用铁氰化钾法。取1ml多肽酒溶液，分别加入2.5ml的0.2mol/l1％铁氰化钾溶液和ph6.6的磷酸缓冲液使其混合均匀，混合液在50℃水浴锅中加热20min后，再加入2.5ml10％三氯乙酸终止反应。吸取此混合溶液2.5ml，加入0.5ml0.1％的三氯化铁，混合均匀后放置30min后于700nm处测定吸光度。二、试验结果：实施例1、对比例1-3制备的黑豆多肽酒的抗氧化性测定结果见表5。表5：黑豆多肽酒的抗氧化性测定结果产品dpph·清除率o2-·清除率还原能力实施例178.9％64.6％1.876对比例156.4％45.3％1.152对比例252.3％41.6％1.082对比例354.5％42.1％1.174对比例460.3％51.2％1.204对比例558.6％48.7％1.195由表5可以看出，与其他方法制备的黑豆多肽酒相比，本发明制备的黑豆多肽酒的抗氧化能力得到显著的提高。经协同性分析发现，本发明的发酵基质中各原料组分具有协同增效作用。以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。当前第1页12