本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种高纯度两端氨基封端的聚乙二醇的制备方法。
背景技术
聚乙二醇(polyethyleneglycol，peg)是一种以环氧乙烷为原料聚合得到的线性高分子，无腐蚀性，无刺激性，无抗原性和免疫原性，生物相容性好，在体内表现为低蛋白质和低血小板吸附以及低细胞粘附性，并且已经获得fda批准使用。因此，聚乙二醇广泛应用于诸多领域，例如化妆品、水基涂料、纸张涂层、粘合剂、印刷油墨、表面活性剂等。从而聚乙二醇与蛋白质、多肽或者小分子药物通过化学方法相连后，把聚乙二醇的一些特性传递给与之相连的蛋白质、多肽或者小分子化合物，从而改变这些物质在体内的药代动力学和生理学特征，例如，屏蔽多肽的抗原性，降低体内清除率，降低蛋白水解酶的水解程度，提高蛋白质和多肽类化合物的水溶性，增加蛋白质、多肽或者小分子化合物的表观分子量，降低肾脏清除率，延长在体内的半衰期。
近年来，聚乙二醇在生物医药领域受到广泛关注，主要是由于它能够被不同基团功能化，在应用过程中，必须要将不活泼的端羟基进行衍生化，将其转化为带有氨基、醛基、羧基等活性官能团的聚乙二醇衍生物，其中异(同)双官能团的聚乙二醇衍生物，即携带不同端基的peg，扩大了聚乙二醇的应用范围，使它在有机合成、多肽合成、高分子合成及药物的缓释控释、靶向递药等多方面均具有广阔的应用前景。
本发明报道了一种制备高纯度的两端氨基修饰的peg，采用磺化反应、n-取代反应和氨化反应制备目标产物h2n-peg-nh2，并用1h-nmr法分析了产物的结构和产物的纯度，该制备方法选择性高、操作简单、原料易得、条件温和，而且产物纯度较高，在高分子合成、靶向药物释放系统等领域有重要的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种高纯度两端氨基封端的聚乙二醇的制备方法，以克服现有技术中提到的不足。本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种高纯度两端氨基封端的聚乙二醇的制备方法，所述方法如下所示：
步骤一、将聚乙二醇(peg)和磺酰基衍生物置于容器中加入有机溶剂进行溶解，反应在室温下保持搅拌10-24小时，将有机溶剂浓缩，然后将浓缩液滴入冰乙醚沉淀，过滤，得到磺酰基化peg(tso-peg-ots)；
步骤二、将步骤一所得到的tso-peg-ots和邻苯二甲酰亚胺盐溶于有机溶剂中，在100-130℃反应2-6小时并搅拌，将有机溶剂浓缩，然后将浓缩液滴入冰乙醚沉淀，过滤，得到双邻苯二甲酰亚胺化peg(pi-peg-pi)；
步骤三、将步骤二所得到的pi-peg-pi溶于乙醇中，然后加入氨水，在50-80℃搅拌下反应10-24小时，得到h2n-peg-nh2，纯度大于97％。
进一步地，所述聚乙二醇(peg)的分子量为500-20000。
进一步地，所述的磺酰基衍生物包括苯磺酰氯、甲磺酰氯、对甲基苯磺酰氯、对硝基苯磺酰氯或邻硝基苯磺酰氯。
进一步地，所述的邻苯二甲酰亚胺盐包含邻苯二甲酰亚胺钾和/或邻苯二甲酰亚胺钠。
进一步地，所述聚乙二醇(peg)和磺酰基衍生物的摩尔比：1:(3-10)。
进一步地，步骤一中的所述有机溶剂均能够包括二氯甲烷、三氯甲烷、n-甲基吡咯烷酮、dmf、苯或甲苯。
进一步地，所述的tso-peg-ots和邻苯二甲酰亚胺盐摩尔配比为1:(5-10)。
进一步地，所述的pi-peg-pi和氨水重量比为1:(2-15)。
进一步地，步骤二中所述的有机溶剂包含乙酸乙酯、dmf(n,n-二甲基甲酰胺)、苯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、n-甲基吡咯烷酮。
进一步地，步骤一中所述的反应时间为12h。
进一步地，步骤二中所述的反应时间分别为3h。
进一步地，步骤三中所述的反应时间为11-14h。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种高纯度两端氨基封端的聚乙二醇的制备方法，该方法采用具体的磺化反应、n-取代反应和氨化反应制备目标产物h2n-peg-nh2，得到了高纯度、高收率的目标产物。并用1h-nmr法分析了产物的结构和产物的纯度，该制备方法选择性高、操作简单、原料易得、条件温和，而且产物纯度较高。具体地，本发明中的方法简单，后处理也非常简单，没有严苛的条件，不需要柱色谱层析、重结晶等等，只需要在乙醚中沉底过滤便可，而且得到的产物纯度极高，在97％以上，甚至能够达到99％，可直接进行应用，在高分子合成、靶向药物释放系统等领域有重要的应用前景；而且通过本发明中的方法产率损失极少，产量同样能够达到97％以上。此外，本发明中所用到的物质都是常规物质，其成本低，因此，该方法所制备的两端氨基封闭的聚乙二醇的成本低，因此，工业化应用更具有优势。
附图说明
图1是本发明实施例所述的h2n-peg2000-nh2的1h-nmr。
具体实施方式
下面以具体实验案例为例来说明具体实施方式，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1、氨基封端的聚乙二醇(h2n-peg-nh2)的制备
步骤一、将10g聚乙二醇(peg，分子量为2000，简称peg2000)(5mmol)和7.626g对甲基苯磺酰氯(40mmol)溶于100ml二氯甲烷中。反应在室温下保持搅拌12小时，将有机溶剂二氯甲烷浓缩，然后将浓缩后的物质滴入冰乙醚沉淀，过滤，得到对甲基苯磺酰化peg(tso-peg2000-ots)，真空干燥。
步骤二、将5gtso-peg2000-ots(2mmol)和2.408g邻苯二甲酰亚胺钾(13mmol)溶于80mldmf中，在120℃反应2小时并搅拌，将有机溶剂dmf浓缩，然后将浓缩后的物质滴入冰乙醚沉淀，过滤，得到双邻苯二甲酰亚胺化peg(pi-peg2000-pi)。
步骤三、将4gpi-peg2000-pi溶于70ml乙醇中，然后加入10ml氨水。在70℃搅拌下反应12小时，得到h2n-peg2000-nh2，即氨基封端的聚乙二醇，其含量97.38％，即纯度为97.38％。
2、h2n-peg-nh2的谱图表征
该产物h2n-peg-nh2，分子式为
表1h2n-peg2000-nh2的核磁图谱分析
产物的核磁共振图谱见图1，其图谱分析见表1，图中δ＝3.62-3.83处特征峰(d:-och2ch2-)是h2n-peg2000-nh2和原料peg的共有特征峰，δ＝2.10处特征峰(a:-nh2)，δ＝2.87-2.92处特征峰(b:-ch2-nh2)，δ＝3.51-3.54处特征峰(c:-ch2-ch2-nh2，β位亚甲基氢原子)均为产物的特征峰，b和d处的峰面积比为1:45.18，而理论上h2n-peg2000-nh2上b和d处的氢原子的个数比为1:44，表明peg两端的羟基都已转化为氨基。
3、h2n-peg2000-nh2的定量分析
相对含量测定法当不能获得样品纯品或者合适的内标时，可以选用此法。此方法适用于含有1-2种杂质的样品分析。先计算出样品指定基团上一个质子引起的吸收峰面积(as/ns)和杂质指定基团上一个质子引起的吸收峰面积(ar/nr),再按(1)式计算样品的相对百分含量：
其中，as为被测样品定量峰的积分面积，ns为被测样品定量峰包含质子数，ar为杂质定量峰的积分面积，nr为杂质定量峰包含质子数，由于h2n-peg2000-nh2与peg的溶解性能很接近,故可能仍有少量未反应的peg裹留在产物中。而目标产物h2n-peg2000-nh2与所含杂质peg存在共有的特征峰(d:-och2ch2-)，其实际含量可通过nmr谱图中相应的特征峰进行定量表征，将h2n-peg2000-nh2的特征峰b与共有特征峰d的积分比值计算其含量百分比：
假设样品特征峰b处的积分面积标为as1，对应的峰质子数为ns1，特征峰d处的积分面积标为as2,对应的峰质子数为ns2。因为as1＝ab，as2+ar＝ad，ns2＝nr＝nd；所以其公式可以变形为：
ab＝0.9119ad＝41.2036nb＝4nd＝176
实施例2
氨基封端的聚乙二醇(h2n-peg-nh2)的制备
将5mmol聚乙二醇(peg，分子量为8000，简称peg8000)和40mmol甲磺酰氯溶于100ml甲苯中，反应在室温下保持搅拌13小时，将有机溶剂浓缩，然后将浓缩液滴入冰乙醚沉淀，过滤，得到甲磺酰化的peg8000，真空干燥。
将2mmol所得的甲磺酰化的peg8000和13mmol邻苯二甲酰亚胺钠溶于80ml乙酸乙酯中，在120℃反应2小时并搅拌，将有机溶剂浓缩，然后将浓缩液滴入冰乙醚沉淀，过滤，取4g过滤得到的产物溶于70ml乙醇中，然后加入10ml氨水。在70℃搅拌下反应10小时，得到h2n-peg8000-nh2，即氨基封端的聚乙二醇，其含量99.01％，即纯度为98.01％；产率98％。其谱图以及纯度计算方法如实施例1一致。
实施例3
氨基封端的聚乙二醇(h2n-peg-nh2)的制备
将5mmol聚乙二醇(peg，分子量为5000，简称peg5000)和40mmol邻硝基苯磺酰氯溶于100mln-甲基吡咯烷酮中，反应在室温下保持搅拌11小时，将n-甲基吡咯烷酮浓缩，然后将浓缩液滴入冰乙醚沉淀，过滤，得到邻硝基苯磺酰化的peg5000，真空干燥。
将2mmol所得的邻硝基苯磺酰化的peg5000和13mmol邻苯二甲酰亚胺钠溶于80mln-甲基吡咯烷酮中，在120℃反应3小时并搅拌，将n-甲基吡咯烷酮浓缩，然后将浓缩液滴入冰乙醚沉淀，过滤，取4g过滤得到的产物溶于70ml乙醇中，然后加入10ml氨水。在70℃搅拌下反应10小时，得到h2n-peg5000-nh2，即氨基封端的聚乙二醇，其含量98.12％，即纯度为98.12％；产率98％。其谱图以及纯度计算方法如实施例1一致。
实施例4
将实施例1中步骤一到步骤三中的某些成分、加量、反应时间或反应条件等进行改变，然后测定所得到的氨基封端聚乙二醇的纯度和产率，具体如下表所示。
上表中没有标示的均与实施例1一致。由上可进一步获知，在本申请中，各种磺酰基衍生物的选择、反应物之间的摩尔比、溶剂的选择不同步骤中溶剂的具体选择、反应时间、反应温度选择等等都对最终产物的纯度具有重要影响，改变可能会对最终产物的纯度和产量产生重要影响，从而使其工业化应用、在医药领域中的应用大打折扣。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。