基于外显子捕获的遗传性疾病基因文库构建用的探针组合物、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及基因检测领域，尤其是涉及一种基于外显子捕获的遗传性疾病基因文库构建用的引物组合物、试剂盒及应用。
背景技术：
外显子组测序技术是指利用目标序列捕获技术将基因组的全部外显子区域dna捕获后进行高通量测序的技术，目标序列的富集是外显子测序技术的关键。目前市售的主要捕获平台有罗氏的nimblegen基因捕获芯片、安捷伦的sureselect靶向序列捕获系统及illumina的truseq和nexterarapid序列捕获系统等，其主要流程都是将dna文库与设计好的探针进行杂交，通过收集杂交片段达到富集目的基因的目的。上述平台已经被广泛应用，其相关参数也比较完善，并有多篇论文对比分析其间差异，作为捕获的核心技术，捕获探针的设计最为关键。根据测序数据推测，上述平台使用的捕获探针普遍为外显子转录位点的上下游保守区域。国内对于外显子组文库的构建方法，在发明专利201510419231.0《一种全基因组外显子序列捕获探针的构建方法》中采用的是提取总rna逆转录后使用通用捕获探针富集；在《外显子捕捉法快速分离新基因的原理和方法》(生物化学与生物物理进展.1997.24(3)207-211)中利用5’或3’端保守的拼接序列进行捕获，其捕获的目标同样是cdna。由于mrna的表达具有很强的特异性，其最后构建的外显子文库只是一个表达文库而非外显子组的文库。基于外显子或mrna的捕获探针，往往也只能捕获部分外显子基因片段，有一定的遗漏，因而构建的文库并不完善。人类基因组中大约有两万多个蛋白质编码基因，蛋白质编码序列占整个基因组碱基数量少于1.5％。当一个或多个基因发生不正常表现时，便可能会使某个相对应的表型产生临床症状。遗传性异常包括基因突变和染色体数目异常，如果异常的基因会从亲代遗传到子代，那就会成为一种遗传性疾病。目前已知的遗传性疾病有七千多种，然而已知的涉及遗传性基因的基因只有四千多。因此，对于遗传性疾病，如果以人类基因组的整个外显子或者所有mrna构建文库，则测序数据太大，成本非常高，并且存在大量的功能不明基因，会影响基因分析的结果，容易造成误诊或漏诊。技术实现要素：基于此，有必要提供一种基于外显子捕获的遗传性疾病基因文库构建用的探针组合物、试剂盒及应用，以用于人类多种遗传性疾病的基因研究分析。一种基于外显子捕获的遗传性疾病基因文库构建用的探针组合物，包括序列分别同表1中各染色体上相应位点之间的序列完全一致的多条寡核苷酸探针，各所述寡核苷酸探针的5’端连接有第一连接标记物。一种基于外显子捕获的遗传性疾病基因文库构建用的试剂盒，包括捕获磁珠和上述探针组合物，所述捕获磁珠上固定有能够与所述第一连接标记物反应结合的第二连接标记物。上述探针组合物或上述试剂盒在构建基于外显子捕获的遗传性疾病基因文库中的应用。通过研究发现，直接针对外显子或mrna来设计捕获探针，往往也只能捕获部分外显子基因片段，有一定的遗漏，因而构建的文库并不完善。因此，本发明的基于外显子捕获的遗传性疾病基因文库构建用的探针组合物选择以基因组dna为模板，创造性的对内含子序列进行分类，将部分捕获探针设计在临近外显子的内含子保守区域，包含了比市售试剂盒的外显子捕获区域更多的内含子区域，同时，对于特定的基因的保守区域设定多个捕获探针，通过探针密度调整确保目标区域捕获的成功率与覆盖均一性，以保证文库所包含的基因数据可以真实的反映外显子水平的点突变和拷贝数突变等突变类型。该基于外显子捕获的遗传性疾病基因文库构建用的探针组合物和试剂盒可以用于构建基于外显子捕获的遗传性疾病基因文库，以用于人类多种遗传性疾病的基因研究分析，有利于降低成本，减少漏诊，提高检测阳性率，有利于临床推广。附图说明图1为打碎的dna片段的电泳图；图2为捕获前lm-pcr产物纯化后的电泳图；图3为捕获后lm-pcr产物纯化后的电泳图。具体实施方式本发明从ncbi、omim、uniprot、hgmd、hugo和refseq等数据库以及目前已知的人类致病基因中选择多个致病基因作为靶点并将所有基因组合在一起，创造性的对相关基因的内含子序列进行分类，将部分捕获探针设计在临近外显子的内含子保守区域，包含了比市售试剂盒的外显子捕获区域更多的内含子区域，同时，对于特定的基因的保守区域设定多个捕获探针，通过探针密度调整确保目标区域捕获的成功率与覆盖均一性，以保证文库所包含的基因数据可以真实的反映外显子水平的点突变和拷贝数突变等突变类型。具体地，本发明的基于外显子捕获的遗传性疾病基因文库构建用的探针组合物包括序列分别同下表1中各染色体上相应位点之间的序列完全一致的多条寡核苷酸探针，各所述寡核苷酸探针的5’端连接有第一连接标记物。表1注：参考序列为hg19；“chr”及后面的数字(1～22)或字母(“x”或“y”)表示具体的染色体，染色体后面的数字表示染色上的碱基位置，“|”用作项目隔开符号。以“chr3|48682875|48683082”为例，其表示3号染色体上第48682875位碱基到第48683082碱基之间的碱基序列。本发明还提供了一种基于外显子捕获的遗传性疾病基因文库构建用的试剂盒，其包括捕获磁珠和上述探针组合物。捕获磁珠上固定有能够与第一连接标记物反应结合的第二连接标记物。在一个具体的实例中，第一连接标记物为生物素，第二连接标记物为亲和素或链霉亲和素。进一步，该试剂盒还包括dna末端修复试剂、加a试剂、加接头试剂、lm-pcr试剂、杂交反应试剂和磁珠捕获试剂中的至少一种。上述基于外显子捕获的遗传性疾病基因文库构建用的探针组合物和试剂盒可以用于构建基于外显子捕获的遗传性疾病基因文库，以用于人类多种遗传性疾病的基因研究分析，有利于降低成本，减少漏诊，提高检测阳性率，有利于临床推广。以下结合具体实施例对本发明的基于外显子捕获的遗传性疾病基因文库构建用的探针组合物及试剂盒和应用作进一步详细的说明。本实施例对18例样本构建遗传性疾病基因文库，具体步骤如下。1、提取基因组dna，并将其打碎，得到dna片段按照常规的dna提取方法从每个样本的400μl全血中提取dna，取2μldna样本在nanodrop上进行浓度测定。测得dna浓度要求od260/od280比值在1.8～2.0之间，od260/od230比值在1.8～2.2之间，以上两个比值可以判断所提取的dna纯度。若超出上述范围，则可认为提取的dna纯度不符合要求，需重新提取或再纯化。根据测定的浓度，用dna溶解缓冲液进一步稀释到终浓度为25ng/μl。提取的dna用q800r超声波破碎仪打断，具体步骤如下：向杯式探头杯中加入纯水，且没过钛合金探头。在0.5ml的离心管中转入40μl25ng/μl的dna，将其固定在样本固定器上，并轻轻弹走底部的气泡。将样本固定器放入到杯式探头中，再向杯式探头中加入纯水，直至纯水液面与管中dna液面平齐。提前开启超声波破碎仪的循环冷凝水系统，设置温度在3℃。在主机上设置好打断程序：pulseon20sec；pulseoff30sec；time20min；amplitude40％。待温度降到设定温度3℃时，即可开启打断程序。程序运行完成后，将离心管中的样本置于-20℃保存。所有样本完成打断后，关掉循环冷凝水系统，关闭发动机。每例样本取2μl打碎后的dna片段，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，最终每例样本的片段长度应在500bp以下，峰值在350bp为合格。18例样本的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。其中，第1泳道是marker，第2～6泳道不同样本打断后的dna片段，片段大小约在500bp以下，后续步骤纯化收集峰值约350bp左右片段。2、末端修复每例样本取50μldna片段，加入20μl末端修复反应混合物，总体积70μl。在热循环仪上于20℃孵育30min，结束后立即进行纯化。纯化的具体方法如下：向每例样本中加入120μl的agencourtrampurerxpreagent，总体积190μl。用移液枪上下反复吸打，充分混匀溶液。室温孵育10分钟，使dna与磁珠充分结合。将离心管放置于磁力架上，直至溶液变清澈，小心弃掉上清。将离心管继续留在磁力架上，加入200μl80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精。将离心管继续留在磁力架上，加入200μl80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精，此步应尽可能将酒精吸干净，但应注意不要吸走底部的磁珠。室温充分干燥。将离心管从磁力架上取出。3、加a向每个含有修复dna-磁珠的管中加入50μl的加a反应混合物反应液，总体积50μl。移液枪上下反复吸打，充分混匀样本。在热循环仪上于30℃孵育30min，结束后立即进行纯化。纯化的具体方法如下：向每例样本中加入90μl的peg/naclsprirsolution，总体积140μl。用移液枪上下反复吸打，充分混匀溶液。室温孵育10分钟，使dna与磁珠充分结合。将离心管放置于磁力架上，直至溶液变清澈，小心弃掉上清。将离心管继续留在磁力架上，加入200μl80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精。将离心管继续留在磁力架上，加入200μl80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精，此步应尽可能将酒精吸干净，但应注意不要吸走底部的磁珠。室温充分干燥。将离心管从磁力架上取出。4、加接头向每个加a的dna-磁珠离心管中加入2μl水、45μl连接混合物(ligationmastermix)、3μl接头片段，总体积50μl。用移液枪上下反复吸打，充分混匀样本。在热循环仪上于20℃孵育15min，结束后立即进行后续纯化步骤。纯化的具体方法如下：向每例样本中加入50μl的peg/naclsprirsolution，总体积100μl。用移液枪上下反复吸打，充分混匀溶液。室温孵育10分钟，使dna与磁珠充分结合。将离心管放置于磁力架上，直至溶液变清澈，小心弃掉上清。将离心管继续留在磁力架上，加入200μl80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精。将离心管继续留在磁力架上，加入200μl80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精，此步应尽可能将酒精吸干净，但应注意不要吸走底部的磁珠。室温充分干燥。将离心管从磁力架上取出。加入50μl的10mmtris-hcl(ph8.0)，室温孵育2分钟，使得dna从磁珠上分离开来。将上清全部转移至一个新的离心管中，继续后面的操作。5、捕获前lm-pcr反应体系为：2×kapahifihotstartreadymix25μl、浓度为5μm的pre-lm-pcroligos1和2各2.5μl、加接头的dna片段样本20μl，总体积50μl。反应条件为：98℃45秒；98℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，共9个循环；72℃1分钟。样本在4℃或-20℃保存72小时，或者直接进行后续的纯化实验。纯化的具体方法为：每例样本中加入50μl的agencourtrampurerxpreagent，总体积100μl。用移液枪上下反复吸打，充分混匀溶液。室温孵育10分钟，使dna与磁珠充分结合。将离心管放置于磁力架上，直至溶液变清澈，小心弃掉上清。将离心管继续留在磁力架上，加入200μl80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精。将离心管继续留在磁力架上，加入200μl80％酒精。室温孵育30秒以上，小心吸走酒精，此步应尽可能将酒精吸干净，但应注意不要吸走底部的磁珠。室温充分干燥。将离心管从磁力架上取出。加入52μlddh2o，室温孵育2分钟，使得dna从磁珠上分离开来。将离心管放回到磁力架上直至溶液变清澈。取50μl上清转移至一个新的管中，继续后面的操作。用1.5％琼脂糖凝胶电泳、qubit及qpcr测定扩增后的dna浓度及片段大小。琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，第1泳道是marker，其他泳道为对不同样本进行捕获前lm-pcr，片段大小约在400bp左右。qubit测定扩增后的dna浓度结果见下表2。表26、杂交及捕获(1)试剂和仪器准备①杂交准备a)打开pcr仪器，设置温度为95℃并保持该稳定温度。b)取表1中探针组合物4.5μl，放置室温解冻。②5个样本的heuniversaloligo和heindexoligo的配制。表3heuniversaloligo和heindexoligo配制成分含量seqcapheuniversaloligo4500pmol(9μlof500μm)seqcapheindex1oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex2oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex3oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex4oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex5oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex6oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex7oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex8oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex9oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex10oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex11oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex12oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex13oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex14oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex15oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex16oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex17oligo250pmol(0.5μlof500μm)seqcapheindex18oligo250pmol(0.5μlof500μm)最终浓度9,000pmol(18μlof500μm)③dna样本混合液的准备根据nanodrop测定的样本浓度，每例样本取300ng混合于一个1.5ml离心管中，每六个样本混合成一个文库，制成混合文库样本，最终取1.8μg的混合文库样本用于杂交。④探针捕获与磁珠洗脱液的准备将nimblegenseqcapezhybridizationandwashkit中的10×洗脱液(i,ii,iiiandstringent)和2.5×bead洗脱液稀释成1×的工作液，制备1个捕获单位量工作液的洗脱液用量如表4所示。表4洗脱液的稀释用量表试剂用量加入的pcr级水反应体积(1×)10×stringentwashbuffer(vial4)–40μl360μl400μl10×washbufferi(vial1)–30μl270μl300μl10×washbufferii(vial2)–20μl180μl200μl10×washbufferiii(vial3)–20μl180μl200μl2.5×beadwashbuffer(vial7)–200μl300μl500μl工作液在室温下可保存2周。在洗脱前提前2小时将buffers置于47℃水浴中进行平衡。⑤捕获磁珠(capturebeads)预处理使用前提前30分钟将捕获磁珠恢复至室温。将磁珠充分涡旋混匀15秒。以每个捕获单位加100μl磁珠于1.5ml离心管中。每个离心管最多可加6个捕获单位的磁珠量。将离心管置于磁力架上，当液体变澄清时(此过程不超过5分钟)，小心弃掉上清，注意不要吸走底部的磁珠，残留的液体将在后续洗脱步骤被去除。加2倍于磁珠体积的1×beadwashbuffer于磁力架的离心管中。将离心管从磁力架中取出并涡旋10秒。将离心管放回磁力架中以结合磁珠。一旦液体变澄清，便可弃掉上清。重复本步骤一次。用等体积的1×beadwashbuffer重悬磁珠。取100μl重悬磁珠加入新的0.2ml离心管中。将离心管放回磁力架中以结合磁珠。一旦液体变澄清，便可弃掉上清。此时，捕获磁珠预处理完成，可以结合捕获的dna。此步骤结束后应立即进行后续的操作，避免捕获磁珠失水变干。少量的磁珠洗脱液不会干扰捕获磁珠与dna结合。(2)杂交向新的1.5ml离心管中加入5μl的1mg/mlcotdna和1.5μg混合文库样本，得到混合物1。混合物1中分别加入3μl的500μmseqcapheuniversaloligo和3μl的500μmseqcapheindexoligo(以5个样本为例)，得到混合物2(samplelibrary/cotdna/seqcapheuniversaloligo-seqcapheindexoligo混合物)，混合物2的组成如表5所示。表5混合物2的组成成分含量cotdna5μg混合文库样本1.5μg≤50ul500μmseqcapheuniversaloligo3μl500μmseqcapheindexoligos3μl总体积体积≤57μl将混合物2的离心管盖打开，放入dna真空浓缩仪中60℃，浓缩15min。随着加入液体的体积增多，需适当延长浓缩时间，直至液体蒸干。向蒸干的混合物2中加入：7.5μlof2×hybridizationbuffer(vial5)和3μlofhybridizationcomponenta(vial6)，得到混合物3。混合物3的组成如表6所示。表6混合物3的组成成分含量cotdna5μg混合文库样本1.8μg≤50ul500μmseqcapheuniversaloligo3μl500μmseqcapheindexoligos3μl2×hybridizationbuffer(vial5)7.5μlhybridizationcomponenta(vial6)3μl最终体积10.5μl将混合物3混匀10秒，并在浓缩仪的离心模式下以最大转速离心10秒。将混合物置于95℃加热模块上加热10mins以变性dna。室温下以最大转速离心10秒。将变性的混合物加入4.5μl4000人类致病靶基因特异性探针文库的0.2ml离心管中。涡旋混匀3秒并离心10秒。将以上的混合物全部转移至0.2ml离心管中，并盖好管盖，得到混合物4。混合物4在热循环仪上热模块47℃(热盖57℃)孵育24小时。混合物4的组成如表7所示。表7混合物4的组成(3)捕获磁珠与dna的结合将杂交的样本加入到预处理好的捕获磁珠中。用移液器上下充分混匀10次，置于热循环仪中47℃(热盖57℃)结合45分钟。每15分钟将样本涡旋混匀3秒，以确保磁珠均匀悬浮。(4)磁珠-dna结合物洗脱向15μl的磁珠-dna结合物中加入100μl47℃的1×washbufferi。涡旋混匀10秒。瞬时离心，将0.2ml离心管中内容物全部转移至0.5ml的离心管中。将离心管放回磁力架中以结合磁珠。一旦液体变澄清，便可弃掉上清。将离心管从磁力架中取出，加入200μl47℃的1×stringentwashbuffer，移液枪上下吸打10次混匀。此过程47℃恒温快速操作以确保温度不下降。47℃孵育5分钟。重复本步骤一次。将离心管放回磁力架中以结合磁珠。一旦液体变澄清，便可弃掉上清。加200μl室温1×washbufferi，涡旋混匀2分钟。若管盖上有液体残留，继续下一步骤前轻轻敲打离心管收集管盖上液体。将离心管放回磁力架中以结合磁珠。一旦液体变澄清，便可弃掉上清。加200μl室温1×washbufferii，涡旋混匀1分钟。将离心管放回磁力架中以结合磁珠。一旦液体变澄清，便可弃掉上清。加200μl室温1×washbufferiii，涡旋混匀30秒。将离心管放回磁力架中以结合磁珠。一旦液体变澄清，便可弃掉上清。将离心管从磁力架上取出，每管beads-dna结合捕获样本加50μlddh2o。将磁珠捕获的样本于-15℃至-25℃保存。dna不用进行再次分离磁珠，磁珠捕获的样本将作为模板用于接下来的捕获后的lm-pcr。7、捕获后lm-pcr反应体系为：kapahifihotstartreadymix25μl、浓度为5μm的post-capturelm-pcroligos1和2各2.5μl、磁珠捕获的dna样本20μl，总体积50μl。反应条件为：98℃45秒；98℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，共14个循环；72℃1分钟。样本在4℃或-20℃保存72小时，或者直接进行后续的纯化实验。纯化方法为：向每个离心管中加入90μl的agencourtrampurerxpreagent，总体积140μl，用移液枪上下反复吸打，充分混匀溶液。室温孵育15min，使dna与磁珠充分结合。将离心管置于磁力架上，静置直至液体变得清澈。小心弃掉上清。将离心管继续留在磁力架上，加入200μl80％酒精，室温孵育30秒以上，小心吸走酒精。将离心管继续留在磁力架上，加入200μl80％酒精，室温孵育30秒以上，小心吸走酒精，室温充分干燥。将离心管从磁力架上取出，加入52μl的ddh2o，室温孵育2min，使dna从磁珠上分离开来。将离心管放回到磁力架中直至溶液变清澈。每例样本直接转移50μl至1.5ml离心管中，继续后面的操作。用1.5％琼脂糖凝胶电泳、nanodrop、qubit及qpcr测定扩增后的dna浓度及片段大小。琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，第1泳道是marker，第二泳道为不同样本，峰值约在400bp左右。qubit及qpcr测定扩增后的dna浓度结果如表8所示。表8qubit及qpcr测定扩增后的dna浓度结果样本编号组1组2组3qubit测定值(ng/μl)29.849.549.5qpcr测定值(nm)100.34168.2174.2以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12