与纤维小体全菌糖化匹配的木质纤维类生物质的预处理方法与流程

本发明属于生物质能源与生物质综合利用领域，具体的说，涉及一种适用于纤维小体全菌糖化生产可发酵糖的木质纤维生物质的预处理方法。

背景技术：

当今社会，人类对能源的需求日趋庞大，但随着传统石油资源的供应紧张以及对地球环境的破坏，寻求绿色替代能源成为全世界关注的热点。木质纤维生物质是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，是传统石化能源的理想替代品。彭博社最新的能源报告显示，全球有约17.5％的农林废弃物可作为新一代生物燃料的生产原料，到2030年生物燃料有望满足全球约一半的汽油需求量。与传统的化石燃料相比，生物燃料可以减少约80％的温室气体排放。中国作为世界上最大的二氧化碳排放国，面临越来越大的国际压力；因此，中国于2017年12月启动了碳排放权交易体系，并成为全球最大的碳市场。近期多部门联合出台的《关于扩大生物燃料乙醇生产和推广使用车用乙醇汽油的实施方案》明确提出，到2020年，在全国范围内推广使用车用乙醇汽油；到2025年，努力在中国实现纤维素乙醇的商业化生产。所以，发展纤维素乙醇不仅有利于提高国家能源安全，还可促进人类社会的可持续发展。

将纤维素类生物质高效转化为能源或化学品的一个关键步骤是，通过物理或化学作用预处理分离纤维原料，获得较高纯度易于转化利用的纤维素、半纤维素和木质素。然而，木质纤维素生物质在漫长进化过程中形成的天然复杂高分子结构对微生物(如纤维素酶、纤维小体等)的降解作用具有非常强的抵制能力。因此，开发经济高效的预处理技术是破坏木质纤维素生物质天然抗降解屏障，并实现纤维素、半纤维素和木质素高效分离和利用的关键。

目前，比较有代表性的预处理方法可以归纳为3类：物理法(机械粉碎、微波、辐射)、化学法(稀酸法、碱法、有机溶剂、离子液体)和生物法。然而，每一种单一处理方式都有其优势和制约性。其中，物理法不能特定分离某一组分，所以通常作为化学法或生物法处理的前端或后续辅助手段，通过降低原料的机械强度、增大比表面积，以利于后续化学药品或生物制剂与反应底物的作用(biomedresearchinternational，2015：325905)。化学法中常用的是无机酸、碱，其在分离效果上具有较好的优势，但在设备要求和环境保护方面具有短板，从而大大限制了其在产业化上的推广应用(biotechnologyforbiofuels,2017，10(1),297)。化学法中低沸点的有机溶剂(如乙醇、甲醇、丙酮、甲酸、乙酸等)则存在易挥发、易泄漏、易燃易爆甚至有毒的问题，而且其处理工艺需要高压下运行，存在安全隐患，限制了其进一步应用。化学法中高沸点有机溶剂(如丁二醇、丙二醇、甘油等)具有蒸汽压力小、安全性高、损失量少等优点；但却存在溶液粘度大、溶解的木质素和碳水化合物分离回收困难的问题，因此短期内也很难实现商业化(biomass&bioenergy,2017，100,10)。生物法是利用微生物除去木质素和部分半纤维素，以解除其对纤维素的包裹作用，从而提高木质纤维生物质转化效率的过程。生物法中常见的是用白腐菌、褐腐菌和软腐菌等微生物产生分解木质素的酶类(如过氧化物酶和漆酶)，从而选择性降解木质素，提高纤维素的酶水解糖化率；其中，木聚糖酶对半纤维素水解具有较高的生物选择性。生物法处理产物纯度高、过程绿色环保，但是周期过长，从而导致其难以在工业化生产中应用。为了增强预处理效果，研究人员通常采用几种方式联合使用。

同时，针对不同类型生物质原料的结构特点，选择环保、低成本的集成分离技术是解决木质纤维生物质高值转化的有效方式。由于半纤维素侧链含有一定量乙酰基，可以在高温液态水中释放乙酸(水热法)，实现自催化水解溶出半纤维素。该方法无需额外加入酸，且整个处理过程酸性较弱，对设备腐蚀影响小，工艺过程也清洁简单。分离的半纤维素主要以木聚糖的形式存在，可以进一步酶解制备高附加值低聚木糖。亚硫酸盐具有优异的亲核性，木质素可以通过磺化作用生成木质素磺酸盐溶于水中而脱除；如果在磺化药液中加入富含氮源的氨基，还可以进一步将其用作农业肥料，从而极大提高木质纤维生物质的综合利用效率。朱俊勇等开发的sporl法(酸性亚硫酸钠加盘磨处理)处理松木具有很好的分离效果，且纤维素糖化后发酵乙醇不需要脱毒处理(tappijournal,2011，10(5),9)。leonardo等通过液氨处理木质纤维原料，在脱除45％的木质素的同时可以使得纤维素构型由原生ci型向更容易酶解的ciii型转变，从而比传统的氨蒸汽爆破法酶用量减少60％(energy&environmentalscience,2016，9(4),1215)。

发明人前期公开了一种预处理分离木质纤维素类生物质的方法(cn105625075a)，该法通过水热和亚硫酸铵两步预处理木质纤维原料，对预处理后的底物使用纤维素酶(novozymecelluclast)和β葡萄糖苷酶(novozyme188)进行酶水解，该方法显著提高了纤维素酶水解效率。但是，该方法只验证了对纤维素酶的糖化效果，并未考察其对纤维小体全菌糖化的适用性。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，是一种复合酶，多产自于真菌，比较典型的有木霉属(trichoderma)、曲霉属(aspergillus)和青霉属(penicillium)。

纤维小体是热纤梭菌等厌氧细菌生产的一种具有复杂结构和组分的多酶复合体，是自然界中已知的最高效的纤维素降解体系之一。纤维小体包括脚架蛋白等非催化单元以及具有不同催化活性的酶单元，并通过多级脚架蛋白和不同纤维小体酶类具有的多类型组装模块间特异性的非共价相互作用，将不同的功能组分组装成为分子量超过兆道尔顿的超分子多酶复合体。纤维小体组分和结构还具有时空调控特性，以适应木质纤维素的复杂成分，从而保证了其高效降解活力。而且纤维小体可以在线生产，替代外购商品纤维素酶，使糖化成本大幅降低。但是纤维小体对纤维底物的性质也有一定的要求，底物中木质素和半纤维素都不能太高。因此，急需开发一种与纤维小体全菌糖化相匹配的预处理方法。

技术实现要素：

基于现有技术在木质纤维素预处理方面所存在的问题，本发明提供了一种适用于纤维小体全菌糖化纤维素底物生产可发酵糖的木质纤维生物质的预处理方法。该方法可以实现生物质三大组分纤维素、半纤维素和木质素的绿色高效分离，以及综合利用。

本发明的技术方案：

与纤维小体全菌糖化匹配的木质纤维类生物质的预处理方法，包括依次进行的(1)物理粉碎、(2)磺化预处理和(3)水热预处理/木聚糖酶水解预处理三个步骤。其中，所述(2)磺化预处理步骤必须设置在(3)水热预处理/木聚糖酶水解预处理步骤的前面。

这是由于：研究人员发现，如果先进行水热预处理，在半纤维素溶出的同时，大量木质素会迁移、重排、缩聚到纤维表面，使纤维表面被粘性木质素包覆和部分封闭(见附图1)，从而导致在后续进行的磺化预处理过程中木质素脱除不彻底，纤维暴露不充分(见附图2)。由于残留木质素是磺化木质素，对酶水解并没有抑制性；但纤维小体是一个酶的群落，比游离酶的尺寸要大得多，过多残留的木质素就会降低纤维小体对纤维底物的可及性，从而造成水解效率的降低。而如果先进行磺化预处理，木质素被磺化后可以直接溶出，避免了水热预处理步骤中木质素的迁移、重排、缩聚到纤维表面。由附图3可知，与直接水热预处理后的麦秆(附图1)相比，直接磺化预处理后的麦秆固体表面粗糙度明显增加，纤维表面更加光滑。在此基础上进行水热处理就不会导致木质素在纤维底物表面的缩聚，使得纤维可以充分暴露(附图4)，从而显著增加了纤维小体的可及性，进而大大提高了水解效率。

所述步骤(1)物理粉碎具体为：将木质纤维素类生物质机械粉碎，直至合适的粒径，得到预处理物料a。所述木质纤维素类生物质是指农作物及农作物的加工残留物和副产物、林业产品及加工过程的副产物；所述机械粉碎包括双螺杆挤压、铡刀破碎、锤式破碎或研磨；所述粒径为0.1mm-50mm。

所述步骤(2)磺化预处理具体为：按照固液重量比1:4-1:10，将步骤(1)得到的预处理物料a与磺化预处理药液混合，在90-200℃的温度条件下磺化预处理30-180min；然后固液分离，得到预处理固体物料b和黑液。所述磺化预处理药液为亚硫酸盐或亚硫酸氢盐的溶液；相对于预处理物料a的绝干质量，所述亚硫酸盐或亚硫酸氢盐用量为5-40wt％。所述黑液主要为磺化木质素，经浓缩改性后可用于生产木质素基有机复合肥还田。

所述步骤(3)水热预处理具体为：按照固液重量比1:4-1:20，将步骤2中得到的预处理固体物料b与水/水蒸气混合，在100-240℃下水热预处理5-200min；然后固液分离，得到的固体浆料主要成分是纤维素，用去离子水洗涤至中性，即得到可用于纤维小体全菌糖化的预处理物料c1。水热预处理中可以添加适量有机酸；所述有机酸的添加量为预处理固体物料b的0-5wt％。分离得到的液体主要是半纤维素，可经木聚糖酶水解制备木糖和低聚木糖。

所述步骤(3)木聚糖酶水解预处理具体为：将步骤2中得到的预处理物料b与木聚糖酶水解液混合，温度40-60℃、ph＝4.0-7.0下酶解12-48h；然后固液分离，得到的固体浆料主要成分是纤维素，用去离子水洗涤至中性，得到的固体即为可用于纤维小体全菌糖化的预处理物料c2。所述木聚糖酶为液体木聚糖酶或固体木聚糖酶。相对于预处理固体物料b的绝干质量，所述木聚糖酶的用量为0.1-1wt％；所述预处理物料b在酶水解体系中的含量为1-20wt％。分离得到的液体主要是半纤维素降解的木糖和低聚木糖。

优选的是，步骤(1)中所述作物及农作物的加工残留物和副产物具体为：玉米秸秆、玉米苞叶、麦杆、稻杆、高粱秆、麻杆、烟杆和甘蔗渣；所述林业产品及加工过程的副产物具体为木屑、木粉；所述粒径为2.0mm-30mm。

优选的是，步骤(2)中所述亚硫酸盐为亚硫酸镁、亚硫酸铵、亚硫酸钠、亚硫酸钙和亚硫酸钾中的一种或多种；所述亚硫酸氢盐为亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钙和亚硫酸氢钾中的一种或多种。相对于预处理物料a的绝干质量，所述亚硫酸盐或亚硫酸氢盐的用量为10-25wt％。

优选的是，步骤(3)中所述有机酸为甲酸或乙酸，所述有机酸的添加量为预处理固体物料b的1-3wt％。

优选的是，步骤(3)中相对于预处理固体物料b的绝干质量，所述木聚糖酶的用量为0.3-0.8wt％，所述预处理物料b在酶水解体系中的含量为5-10wt％。

本发明的有益效果：

1、本发明提供了一种适用于纤维小体全菌糖化纤维素底物生产可发酵糖的木质纤维生物质的预处理方法，为纤维小体木质纤维素类生物质的糖化解决了预处理方面的关键问题，填补了现有技术的空白。

2、本发明所述的预处理方法实现了木质纤维素类生物质中三大组分——纤维素、半纤维素和木质素的绿色、高效分离，为生物质的高效利用奠定了基础；纤维素可以转化为可发酵糖用于生产燃料乙醇，半纤维素可以生产木糖和低聚木糖产品，木质素可用于生产有机肥还田。

3、采用本发明所述的预处理方法得到的纤维素底物，用于纤维小体全菌糖化，与现有技术相比，虽然仅仅是步骤顺序不同，但却大大提升了水解糖化效率，产生了意料不到的技术效果，具有显著的进步。

附图说明

附图1为第一步水热处理后的麦秆固体表面形貌；

附图2为第一步水热+第二步磺化处理后麦秆固体表面形貌(圈内为木质素团聚颗粒)；

附图3为第一步磺化处理后麦秆固体表面形貌；

附图4为第一步磺化+第二步水热处理后麦秆固体表面形貌。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：

1)麦秆粉碎

用双螺杆挤压机将麦秆挤压破碎至颗粒大小0.05-1.0cm，得到预处理物料a，收集到自封袋中待用。

2)磺化预处理

称取步骤1)中备好的预处理物料a绝干质量80g，装入反应釜群罐(单罐体积1.5升)中，同时称取亚硫酸铵固体16g(相当于预处理物料a绝干重量的20％)加入到水中搅拌至全部溶解，将溶解后的药液倒入所述反应釜群罐中，使整个反应体系液固比为6:1，拧紧盖子，装入旋转式反应釜中，加热至160度，保温1小时。反应完后，降温冷却，开釜卸料，用500目的筛网将蒸煮完的物料挤至干度20-30％，固体浆料用去离子水洗涤至中性，即得到预处理固体物料b，收集到自封袋后备用。液体为磺化木质素，经浓缩改性后可用于生产木质素基有机复合肥还田。

3)水热预处理

称取步骤2)得到的预处理固体物料b绝干质量40g，装入反应釜群罐(单罐体积1.5升)中，向罐中加入去离子水，以及1.2g的乙酸(相当于预处理固体物料b绝干质量的3％)，使整个反应体系液固比为10：1，拧紧盖子，加热至175度，保温20分钟。反应完后，降温冷却，开釜卸料，用500目的筛网将蒸煮完的物料挤至干度20-30％。固体浆料主要成分是纤维素，用去离子水洗涤至中性，得到预处理物料c1，装入自封袋用于后续酶水解或者纤维小体水解糖化实验；液体成分主要是半纤维素，可经木聚糖酶水解制备木糖和低聚木糖。

4)热纤梭菌纤维小体全菌糖化

热纤梭菌dsm1313使用以纤维二糖为碳源的gs-2培养基(4ml厌氧管)培养18h后，取1ml接入以0.5％avicel为碳源的gs-2培养基(100ml厌氧瓶)中培养约36h，得到预处理底物糖化所需的热纤梭菌种子。取预处理物料c1绝干质量3g加入100mlgs-2培养基(相当于底物固含3％)，121℃，20min灭菌。从热纤梭菌种子液中取1ml菌液接入100ml糖化培养基(100ml厌氧瓶)中，即接种量为1％(v/v)。在恒温摇床中，55℃，170rpm，连续培养16天，完成热纤梭菌利用纤维小体实现对木质纤维素预处理底物的糖化。糖化后糖液经高效色谱分析(hplc,model1200,agilenttechnologies,usa)，纤维小体糖化底物中纤维素的转化率为91％。

对照实施例1：

将步骤2)与步骤3)调换，各步反应条件不变，纤维小体糖化底物中纤维素的转化率只有64％。证明先进行磺化预处理再进行水热预处理的两步处理方法是与纤维小体全菌糖化相匹配的预处理方法，两步预处理后纤维表面更加光滑(见附图4)，残留木质素较少(底物中木质素含量6.3％)，可以显著提高纤维小体糖化效果；而先进行水热处理再进行磺化预处理得到的底物，木质素脱除不充分(底物中木质素含量10.7％)，纤维暴露不够充分(见附图2)，用纤维小体糖化效率较低，不适合纤维小体全菌糖化。

实施例2：

1)麦秆粉碎

步骤同实施例1中的步骤1。

2)磺化预处理

步骤同实施例1中的步骤2。

3)木聚糖水解预处理

称取步骤2)预处理固体物料b绝干质量1g加入到50ml玻璃瓶中，向瓶中加入预先配制好的ph＝4.5-5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液，使反应体系中预处理固体物料b绝干含量为5％，再向其中加入0.005g木聚糖酶(用量相当于0.005g/g底物，标签酶活13200u/g)，将玻璃瓶盖紧瓶塞后放置于恒温空气摇床中，保持温度50度，转速120rpm，水解反应24h后，进行固液分离。液体主要是半纤维素降解的木糖和低聚木糖；固体主要是纤维素，即为预处理物料c2。低聚木糖得率为61％。

4)热纤梭菌纤维小体全菌糖化

步骤同实施例1中的步骤4。

糖化后糖液经高效色谱分析(hplc,model1200,agilenttechnologies,usa)，纤维小体糖化底物中纤维素的转化率为93％。

对照实施例2：

将步骤2)与步骤3)调换，各步反应条件不变，纤维小体糖化底物中纤维素的转化率只有61％。证明先进行磺化预处理再进行木聚糖酶水解预处理的两步处理方法是与纤维小体全菌糖化相匹配的预处理方法(底物中木质素含量为8.1％)，而先进行木聚糖酶水解处理再进行磺化预处理得到的底物(底物中木质素含量为12.4％)，用纤维小体糖化效率较低，不适合纤维小体全菌糖化。此外，麦秆直接先进行木聚糖酶水解的效率很低，半纤维素的脱除率只有约20％，而先磺化预处理后由于大量木质素的脱除，会显著增加第二步木聚糖酶的可及性，半纤维素的脱除率会大于70％。

实施例3：

1)玉米秸秆粉碎

用双螺杆挤压机将麦秆挤压破碎至颗粒大小0.5-2.0cm，得到预处理物料a，收集到自封袋中待用。

2)磺化预处理

称取步骤1)中备好的预处理物料a绝干质量70g，装入反应釜群罐(单罐体积1.5升)中，同时称取亚硫酸铵固体10.5g(相当于预处理物料a绝干重量的15％)加入到水中搅拌至全部溶解，将溶解后的药液倒入所述反应釜群罐中，使整个反应体系液固比为5：1，拧紧盖子，装入旋转式反应釜中，以每分钟升温2℃的速率加热至150度，保温1.5小时。反应完后，降温冷却，开釜卸料，用500目的筛网将蒸煮完的物料挤至干度20-30％，固体浆料用去离子水洗涤至中性，即得到预处理物料b，收集到自封袋后备用。液体为磺化木质素，经浓缩改性后可用于生产木质素基有机复合肥还田。

3)木聚糖水解预处理

称取步骤2)预处理固体物料b绝干质量1g加入到50ml玻璃瓶中，向瓶中加入预先配制好的ph＝4.5-5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液，使反应体系中预处理固体物料b绝干含量为8％，再向其中加入0.01g木聚糖酶(用量相当于0.01g/g底物，标签酶活13200u/g)，将玻璃瓶盖紧瓶塞后放置于恒温空气摇床中，保持温度50度，转速120rpm，水解反应20h后，进行固液分离。液体主要是半纤维素降解的木糖和低聚木糖；固体主要是纤维素，即为预处理物料c2。低聚木糖得率为65％。

4)热纤梭菌纤维小体全菌糖化

热纤梭菌dsm1313使用以纤维二糖为碳源的gs-2培养基(4ml厌氧管)培养18h后，取1ml接入以0.5％avicel为碳源的gs-2培养基(100ml厌氧瓶)中培养约36h，得到预处理底物糖化所需的热纤梭菌种子。取预处理物料c2绝干质量3g加入100mlgs-2培养基(相当于底物固含3％)，121℃，20min灭菌。从热纤梭菌种子液中取1ml菌液接入100ml糖化培养基(100ml厌氧瓶)中，即接种量为1％(v/v)。在恒温摇床中，50℃，180rpm，连续培养14天，完成热纤梭菌利用纤维小体实现对木质纤维素预处理底物的糖化。糖化后糖液经高效色谱分析(hplc,model1200,agilenttechnologies,usa)，纤维小体糖化底物中纤维素的转化率为92％。

对照实施例3：

将步骤2)与步骤3)调换，各步反应条件不变，纤维小体糖化底物中纤维素的转化率只有67％。证明先进行磺化预处理再进行木聚糖酶水解预处理的两步处理方法是与纤维小体全菌糖化相匹配的预处理方法(底物中木质素含量5.8％)，而先进行木聚糖酶水解处理再进行磺化预处理得到的底物(底物中木质素含量13％)，用纤维小体糖化效率较低，不适合纤维小体全菌糖化。此外，玉米秸秆直接先进行木聚糖酶水解的效率很低，半纤维素的脱除率只有约21％，而先磺化预处理后由于大量木质素的脱除，会显著增加第二步木聚糖酶的可及性，半纤维素的脱除率会大于75％。

实施例4：

1)使用甘蔗渣为原料

甘蔗渣无需进一步破碎，即为预处理物料a。

2)磺化预处理

2)称取步骤1)中备好的预处理物料a绝干质量60g，装入反应釜群罐(单罐体积1.5升)中，同时称取亚硫酸铵固体4.8g(相当于预处理物料a绝干重量的8％)加入到水中搅拌至全部溶解，将溶解后的药液倒入所述反应釜群罐中，使整个反应体系液固比为7:1，拧紧盖子，装入旋转式反应釜中，加热至110度，保温3小时。反应完后，降温冷却，开釜卸料，用500目的筛网将蒸煮完的物料挤至干度20-30％，固体浆料用去离子水洗涤至中性，即得到预处理物料b，收集到自封袋后备用。液体为磺化木质素，经浓缩改性后可用于生产木质素基有机复合肥还田。

3)水热预处理

3)称取步骤2)预处理固体物料b绝干质量50g，装入反应釜群罐(单罐体积1.5升)中，向罐中加入去离子水，以及0.5g的乙酸(相当于预处理固体物料b绝干质量的1％)，使整个反应体系液固比为15：1，拧紧盖子，加热至120度，保温120分钟。反应完后，降温冷却，开釜卸料，用500目的筛网将蒸煮完的物料挤至干度20-30％。固体浆料主要成分是纤维素，用去离子水洗涤至中性，得到预处理物料c1，装入自封袋用于后续酶水解或者纤维小体水解糖化实验；液体成分主要是半纤维素，可经木聚糖酶水解制备木糖和低聚木糖。

4)热纤梭菌纤维小体全菌糖化

热纤梭菌dsm1313使用以纤维二糖为碳源的gs-2培养基(4ml厌氧管)培养18h后，取1ml接入以0.5％avicel为碳源的gs-2培养基(100ml厌氧瓶)中培养约36h，得到预处理底物糖化所需的热纤梭菌种子。取预处理物料c1绝干质量3g加入100mlgs-2培养基(相当于底物固含3％)，121℃，20min灭菌。从热纤梭菌种子液中取1ml菌液接入100ml糖化培养基(100ml厌氧瓶)中，即接种量为1％(v/v)。在恒温摇床中，52℃，160rpm，连续培养12天，完成热纤梭菌利用纤维小体实现对木质纤维素预处理底物的糖化。糖化后糖液经高效色谱分析(hplc,model1200,agilenttechnologies,usa)，纤维小体糖化底物中纤维素的转化率为88％。

对照实施例4：

将步骤2)与步骤3)调换，各步反应条件不变，纤维小体糖化底物中纤维素的转化率只有54％。证明先进行磺化预处理再进行水热预处理的两步处理方法是与纤维小体全菌糖化相匹配的预处理方法(底物中木质素含量8.6％)，而先进行水热处理再进行磺化预处理得到的底物(底物中木质素含量10.9％)，用纤维小体糖化效率较低，不适合纤维小体全菌糖化。

实施例5：

1)使用木屑为原料

木屑无需进一步破碎，即为预处理物料a。

2)磺化预处理

称取步骤1)中备好的预处理物料a绝干质量50g，装入反应釜群罐(单罐体积1.5升)中，同时称取亚硫酸铵固体10g(相当于预处理物料a绝干重量的20％)加入到水中搅拌至全部溶解，将溶解后的药液倒入所述反应釜群罐中，使整个反应体系液固比为6：1，拧紧盖子，装入旋转式反应釜中，加热至165度，保温1.6小时。反应完后，降温冷却，开釜卸料，用500目的筛网将蒸煮完的物料挤至干度20-30％，固体浆料用去离子水洗涤至中性，即得到预处理物料b，收集到自封袋后备用。液体为磺化木质素，经浓缩改性后可用于生产木质素基有机复合肥还田。

3)木聚糖水解预处理

称取步骤2)中预处理固体物料b绝干质量1g加入到50ml玻璃瓶中，向瓶中加入预先配制好的ph＝4.5-5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液，使反应体系中预处理固体物料b的绝干含量为10％，再向其中加入0.006g木聚糖酶(用量相当于0.006g/g底物，标签酶活13200u/g)，将玻璃瓶盖紧瓶塞后放置于恒温空气摇床中，保持温度48度，转速130rpm，水解反应30h后，进行固液分离。液体主要是半纤维素降解的木糖和低聚木糖；固体主要是纤维素，即为预处理物料c2。低聚木糖得率为62％。

4)热纤梭菌纤维小体全菌糖化

热纤梭菌dsm1313使用以纤维二糖为碳源的gs-2培养基(4ml厌氧管)培养18h后，取1ml接入以0.5％avicel为碳源的gs-2培养基(100ml厌氧瓶)中培养约36h，得到预处理底物糖化所需的热纤梭菌种子。取预处理物料c2绝干质量3g加入100mlgs-2培养基(相当于底物固含3％)，121℃，30min灭菌。从热纤梭菌种子液中取1ml菌液接入100ml糖化培养基(100ml厌氧瓶)中，即接种量为1％(v/v)。在恒温摇床中，56℃，160rpm，连续培养16天，完成热纤梭菌利用纤维小体实现对木质纤维素预处理底物的糖化。糖化后糖液经高效色谱分析(hplc,model1200,agilenttechnologies,usa)，纤维小体糖化底物中纤维素的转化率为93％。

对照实施例5：

将步骤2)与步骤3)调换，各步反应条件不变，纤维小体糖化底物中纤维素的转化率只有59％。证明先进行磺化预处理再进行木聚糖酶水解预处理的两步处理方法是与纤维小体全菌糖化相匹配的预处理方法(底物中木质素含量5.7％)，而先进行木聚糖酶水解处理再进行磺化预处理得到的底物(底物中木质素含量13.2％)，用纤维小体糖化效率较低，不适合纤维小体全菌糖化。此外，木屑直接先进行木聚糖酶水解的效率很低，半纤维素的脱除率只有约14％，而先磺化预处理后由于大量木质素的脱除，会显著增加第二步木聚糖酶的可及性，半纤维素的脱除率会大于60％。

实施例6：

1)高粱秆粉碎

用双螺杆挤压机将高粱秆挤压破碎至颗粒大小1.0-3.0cm，得到预处理物料a，收集到自封袋中待用。

2)磺化预处理

称取步骤1)中备好的预处理物料a绝干质量100g，装入反应釜群罐(单罐体积1.5升)中，同时称取亚硫酸铵固体35g(相当于预处理物料a绝干重量的35％)加入到水中搅拌至全部溶解，将溶解后的药液倒入所述反应釜群罐中，使整个反应体系液固比为10:1，拧紧盖子，装入旋转式反应釜中，加热至190度，保温40min。反应完后，降温冷却，开釜卸料，用500目的筛网将蒸煮完的物料挤至干度20-30％，固体浆料用去离子水洗涤至中性，即得到预处理物料b，收集到自封袋后备用。液体为磺化木质素，经浓缩改性后可用于生产木质素基有机复合肥还田。

3)水热预处理

称取步骤2)得到的预处理固体物料b绝干质量80g，装入反应釜群罐(单罐体积1.5升)中，向罐中加入去离子水，以及4.0g的乙酸(相当于预处理固体物料b绝干质量的5％)，使整个反应体系液固比为5:1，拧紧盖子，加热至220度，保温10分钟。反应完后，降温冷却，开釜卸料，用500目的筛网将蒸煮完的物料挤至干度20-30％。固体浆料主要成分是纤维素，用去离子水洗涤至中性，得到预处理物料c1，装入自封袋用于后续酶水解或者纤维小体水解糖化实验；液体成分主要是半纤维素，可经木聚糖酶水解制备木糖和低聚木糖。

4)热纤梭菌纤维小体全菌糖化

热纤梭菌dsm1313使用以纤维二糖为碳源的gs-2培养基(4ml厌氧管)培养18h后，取1ml接入以0.5％avicel为碳源的gs-2培养基(100ml厌氧瓶)中培养约36h，得到预处理底物糖化所需的热纤梭菌种子。取预处理物料c1绝干质量3g加入100mlgs-2培养基(相当于底物固含3％)，121℃，20min灭菌。从热纤梭菌种子液中取1ml菌液接入100ml糖化培养基(100ml厌氧瓶)中，即接种量为1％(v/v)。在恒温摇床中，50℃，180rpm，连续培养14天，完成热纤梭菌利用纤维小体实现对木质纤维素预处理底物的糖化。糖化后糖液经高效色谱分析(hplc,model1200,agilenttechnologies,usa)，纤维小体糖化底物中纤维素的转化率为92％。

对照实施例6：

将步骤2)与步骤3)调换，各步反应条件不变，纤维小体糖化底物中纤维素的转化率只有67％。证明先进行磺化预处理再进行水热预处理的两步处理方法是与纤维小体全菌糖化相匹配的预处理方法(底物中木质素含量5.8％)，而先进行水热预处理再进行磺化预处理得到的底物(底物中木质素含量13％)，用纤维小体糖化效率较低，不适合纤维小体全菌糖化。此外，高粱杆直接先进行木聚糖酶水解的效率很低，半纤维素的脱除率只有约21％，而先磺化预处理后由于大量木质素的脱除，会显著增加第二步木聚糖酶的可及性，半纤维素的脱除率会大于75％。

实施例7：

1)玉米秸秆粉碎

用双螺杆挤压机将麦秆挤压破碎至颗粒大小0.02-0.8cm，得到预处理物料a，收集到自封袋中待用。

2)磺化预处理

称取步骤1)中备好的预处理物料a绝干质量100g，装入反应釜群罐(单罐体积1.5升)中，同时称取亚硫酸铵固体8.0g(相当于预处理物料a绝干重量的8％)加入到水中搅拌至全部溶解，将溶解后的药液倒入所述反应釜群罐中，使整个反应体系液固比为4:1，拧紧盖子，装入旋转式反应釜中，加热至100度，保温3小时。反应完后，降温冷却，开釜卸料，用500目的筛网将蒸煮完的物料挤至干度20-30％，固体浆料用去离子水洗涤至中性，即得到预处理物料b，收集到自封袋后备用。液体为磺化木质素，经浓缩改性后可用于生产木质素基有机复合肥还田。

3)木聚糖水解预处理

称取步骤2)预处理固体物料b绝干质量1g加入到50ml玻璃瓶中，向瓶中加入预先配制好的ph＝4.5-5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液，使反应体系中预处理固体物料b绝干含量为18％，再向其中加入0.002g木聚糖酶(用量相当于0.002g/g底物，标签酶活13200u/g)，将玻璃瓶盖紧瓶塞后放置于恒温空气摇床中，保持温度55度，转速120rpm，水解反应40h后，进行固液分离。液体主要是半纤维素降解的木糖和低聚木糖；固体主要是纤维素，即为预处理物料c2。低聚木糖得率为65％。

4)热纤梭菌纤维小体全菌糖化

热纤梭菌dsm1313使用以纤维二糖为碳源的gs-2培养基(4ml厌氧管)培养18h后，取1ml接入以0.5％avicel为碳源的gs-2培养基(100ml厌氧瓶)中培养约36h，得到预处理底物糖化所需的热纤梭菌种子。取预处理物料c2绝干质量3g加入100mlgs-2培养基(相当于底物固含3％)，121℃，20min灭菌。从热纤梭菌种子液中取1ml菌液接入100ml糖化培养基(100ml厌氧瓶)中，即接种量为1％(v/v)。在恒温摇床中，56℃，160rpm，连续培养14天，完成热纤梭菌利用纤维小体实现对木质纤维素预处理底物的糖化。糖化后糖液经高效色谱分析(hplc,model1200,agilenttechnologies,usa)，纤维小体糖化底物中纤维素的转化率为92％。

对照实施例7：

将步骤2)与步骤3)调换，各步反应条件不变，纤维小体糖化底物中纤维素的转化率只有67％。证明先进行磺化预处理再进行木聚糖酶水解预处理的两步处理方法是与纤维小体全菌糖化相匹配的预处理方法(底物中木质素含量5.8％)，而先进行木聚糖酶水解处理再进行磺化预处理得到的底物(底物中木质素含量13％)，用纤维小体糖化效率较低，不适合纤维小体全菌糖化。此外，玉米秸秆直接先进行木聚糖酶水解的效率很低，半纤维素的脱除率只有约21％，而先磺化预处理后由于大量木质素的脱除，会显著增加第二步木聚糖酶的可及性，半纤维素的脱除率会大于75％。

综上所述，实施例1-7得到的预处理底物c1或预处理底物c2，用于纤维小体全菌糖化，具有良好的水解糖化效果，底物中纤维素的转化率均不低于88％。对照实施例1-7中，将步骤2和步骤3的顺序反过来，将其得到的预处理底物用于纤维小体全菌糖化，则水解糖化效果较差，底物中纤维素的转化率仅为54-67％。充分说明，本发明提供的预处理方法是与纤维小体全菌糖化相匹配的预处理方法。此外，本发明所述的预处理方法实现了木质纤维素类生物质中三大组分——纤维素、半纤维素和木质素的绿色、高效分离，为生物质的高效利用奠定了基础，在木质纤维素类生物质的产业化上具有重要的意义。