本发明属于微生物工程技术和药理学领域，具体涉及从投喂吲哚-3-甲醇的大刀螳螂肠道真菌炭球菌属(daldinia)光轮层炭壳ifb-tl01(daldiniaeschscholzii)的发酵液中提取的一类吲哚聚酮生物碱及其制备方法和应用。
背景技术：
新骨架化合物的发现和运用，对于药物的研发具有至关重要的作用。聚酮化合物是一大类由细菌、真菌和植物合成的次生代谢产物。它们具有独特的结构和生物活性，引起人们的广泛关注。聚酮合酶生物合成生产线用于系列新骨架化合物的构建和组装，是一个有待挖掘的巨大宝库。通过添加活性外源性物质，巧妙利用这些天然的生物合成反应器，从而实现将生物体内的小分子物质和外源性物质及其代谢产物进行拼接，形成生物体本身并不存在的系列新骨架化合物。这种化合物合成方法具有高效，绿色环保的特点，将成为化学合成的有效补充手段。当今社会，癌症已经严重威胁人类健康，成了当之无愧的“第一杀手”。而乳腺癌是世界各地女性最常见的恶性肿瘤之一。据最新估计，2002年全球女性乳腺癌的发病率为37.5/10万，发病人数115万；死亡率13.2/10万，死亡人数41万。乳腺癌总发病数占女性全部恶性肿瘤发病的22.8％，死亡占总癌死亡的14.1％。然而，目前的化疗药物仍然存在治疗有效率偏低，耐药性等问题，严重制约肿瘤患者的治疗效果和生命质量。因此，从天然产物中寻找有效的癌症治疗药物已经成为国内外重要的研究课题。技术实现要素：发明目的：本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种从投喂吲哚-3-甲醇的大刀螳螂肠道真菌炭球菌属(daldinia)光轮层炭壳ifb-tl01(daldiniaeschscholzii)的发酵液中分离得到的吲哚聚酮生物碱；本发明另一个目的是提供吲哚聚酮生物碱的制备方法和应用。技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：具有抗肿瘤活性的吲哚聚酮生物碱，其特征在于，其结构式为：本发明所述的具有抗肿瘤活性的吲哚聚酮生物碱的制备方法，包括以下步骤：(1)将活化好的炭球菌属(daldinia)光轮层炭壳daldiniaeschscholziiifb-tl01接种于麦芽培养基中，放置于摇床上，培养2至3天；并分别于24，48，72小时投喂吲哚-3-甲醇，至溶液中的吲哚-3-甲醇的终浓度为1.0mm，同等条件下继续培养10天；(2)对步骤(1)所得发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩得到黑色粗浸膏a；(3)对步骤(2)所得浸膏a进行硅胶柱层析分段，用石油醚：丙酮进行梯度洗脱，得到7个洗脱部分a1-a7；(4)取步骤(3)的a4段(石油醚：丙酮＝5:1部位)和a6段(石油醚：丙酮＝2:1部位)反复采用硅胶柱层析、反向c-18柱层析和sephadexlh-20柱层析分析纯化得到含有新化合物的部位；(5)取含有新化合物的部位馏分分别过sephadexlh-20柱层析(甲醇洗脱)，然后用高压制备液相[色谱柱：ods-2hy0persilcolumns(5μm,250×10mm)]meoh/h2o等度洗脱，分别获得吲哚聚酮生物碱消旋体a–d；(6)取消旋体a–b经手性制备液相进行手性拆分，分别获得dalesindoleb的四个异构体(+)-(2s,4r)，(-)-(2r,4s)，(-)-(2s,4s)和(+)-(2r,4r)，并依次命名为：dalesindoleb-1、dalesindoleb-2、dalesindoleb-3、dalesindoleb-4。取消旋体c–d经手性制备液相进行手性拆分，分别获得dalesindolec的四个异构体(+)-(2s,4r)，(–)-(2r,4s)，(-)-(2s,4s)和(+)-(2r,4r)，并依次命名为：dalesindolec-1、dalesindolec-2、dalesindolec-3和dalesindolec-4。作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤活性的吲哚聚酮生物碱的制备方法，步骤(1)中的培养基组成为：麦芽20g，蔗糖20g，蛋白胨1g和水1l。作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤活性的吲哚聚酮生物碱的制备方法，步骤(3)用石油醚：丙酮梯度洗脱的体积比依次为100:2，100:5，10:1，5:1，3:1，2:1和1:1。作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤活性的吲哚聚酮生物碱的制备方法，步骤(6)手性拆分的手性柱为ia,lotno.ia00cg-re001,10×250mm。本发明所述的吲哚聚酮生物碱在制备抗肿瘤药物中的应用。优选为在制备防治乳腺癌药物中的应用。一种药物制剂，它包括权利要求1所述的吲哚聚酮生物碱。所述的制剂为丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或注射剂。将本发明提供的吲哚聚酮生物碱制成片剂时，把吲哚聚酮生物碱和乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，整粒，然后压片制成片剂。本发明提供的吲哚聚酮生物碱制成胶囊剂时把吲哚聚酮生物碱和载体乳糖或玉米淀粉混合均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。本发明提供的吲哚聚酮生物碱制成颗粒剂时，把吲哚聚酮生物碱和稀释剂乳糖或玉米淀粉、混合均匀，整粒，干燥，制成颗粒剂。本发明提供的吲哚聚酮生物碱制成粉针剂、注射液时加入载体按药学常规方法制备得到。本发明提供的吲哚聚酮生物碱制成脂肪乳剂、软膏剂或透皮控释贴剂等剂型时加入载体按药学常规方法制备得到。本发明提供的的具有抗肿瘤活性的吲哚聚酮生物碱(dalesindoleb和dalesindolec)在制备抗肿瘤药物中的应用。有益效果：本发明提供的具有抗肿瘤活性的吲哚聚酮生物碱和现有技术相比具有以下优点：1.本发明分离得到的吲哚聚酮类生物碱是骨架新颖的化合物，可选择性抑制mcf-7和mda-mb-231肿瘤细胞活性的作用，可以制备成新型的抗癌药物。2.本发明的吲哚聚酮生物碱的制备方法，工艺设计合理，可操作性强，可以通过投喂微生物发酵液生产，工艺简便，周期短，成本低，来源有保证。同时用于投喂的吲哚-3-甲醇有多家公司生产销售，价格优惠，供应充足。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1：螳螂肠道菌ifb-tl01(daldiniaeschscholzii)的液体发酵和投喂活化大刀螳螂肠道菌来源的daldiniaeschscholziiifb-tl01的菌块接种于1l锥形瓶中，每瓶含有400ml麦芽培养基，接种10瓶于摇床上，在200rpm、28‐30℃条件下培养2～3天，作为种子液，然后以各20ml的接种量将种子液接种于到新的麦芽培养基(400ml/瓶×200瓶)中，200rpm、28至30℃条件下继续培养2天。分别于24，48，72小时投喂吲哚-3-甲醇，至溶液中的吲哚-3-甲醇的终浓度为1.0mm，200rpm、然后在28～30℃条件下继续发酵10天。实施例2：吲哚聚酮生物碱的提取与分离取实施例1中发酵液经纱布过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，离心浓缩得到黑色浸膏a(83g)；浸膏a进行硅胶柱层析分段，依次用石油醚：丙酮(体积比：100:2,100:5,10:1,5:1,3:1,2:1,1:1)进行梯度洗脱，得到7个洗脱部分a1-a7；a4段(石油醚：丙酮＝5:1部位)继续用石油醚：丙酮(100:2→1:1)梯度洗脱，获得f1–f7共7个馏分。其中f3(20:1)和f4(10:1)馏分，分别经sephadexlh-20柱层析(甲醇洗脱)，高压制备液相[色谱柱：ods-2hy0persilcolumns(5μm,250×10mm)]，meoh/h2o(70:30和65:35)洗脱纯化，分别获得消旋体(8mg,产率0.01％)和消旋体(14mg,产率0.02％)。消旋体和进一步经手性柱分离：ia,lotno.ia00cg-re001,10×250mm手性拆分分别获得dalesindolec的两个异构体(-)-(2s,4s)(4mg)和(+)-(2r,4r)(3mg)(流动相：n-hexane/ethanol＝85:15)和dalesindoleb的两个异构体(-)-(2s,4s)(6.5mg)和(+)-(2r,4r)(6mg)(流动相：n-hexane/ethanol＝85:15)。a6段(石油醚：丙酮＝2:1部位)经c-18柱层析(30:70→100:0)梯度洗脱，获得馏分a–g。馏分f经ods，凝胶柱层析，半制备液相meoh/h2o(75:25)洗脱纯化，获得消旋体c*(14mg,产率0.02％)，进一步手性拆分(手性柱同前，流动相：n-hexane/ethanol＝70:30)得到dalesindolec的另外两个异构体(+)-(2s,4r)(6mg)和(–)-(2r,4s)(5.5mg)。馏分g经半制备液相meoh/h2o(60:40)洗脱纯化，获得消旋体a*(34mg,产率0.04％)，进一步手性拆分(手性柱同前)(流动相n-hexane/ethanol＝50:50)获得dalesindoleb的另外两个异构体(-)-(2r,4s)(17mg,产率0.02％)和(+)-(2s,4r)(17mg,产率0.02％)。实施例3：吲哚聚酮生物碱的结构鉴定吲哚聚酮生物碱的结构是基于它们的质谱、核磁共振谱、x-ray单晶衍射分析确定的。光谱学数据如下：dalesindoleb,从ch2cl2/meoh(1:1)混合溶液中得到的黄色单晶，高分辨电喷雾质谱hr/esims:m/z302.1156；红外(kbr)νmax(cm-1):3409,2971,2913,1616,1587,1464,744.1h和13cnmr如表1。手性拆分消旋体a获得两个对映异构体{(+)-(2s,4r),浅灰色粉末,高分辨电喷雾质谱hr/esims:m/z302.1159；旋光[α]25d+25.3°(c＝0.15,meoh),圆二色谱cd(meoh)λmax(δε)＝204(5.5),228(-6.1)，270(1.38)nm；(–)-(2r,4s),浅灰色粉末,高分辨电喷雾质谱hr/esims:m/z302.1154；旋光[α]25d–20.0°(c＝0.10,meoh),圆二色谱cd(meoh)λmax(δε)＝204(–4.4),228(5.2)，273(–0.88)nm}.手性拆分消旋体b获得两个对映异构体{(–)-(2s,4s),浅灰色粉末,高分辨电喷雾质谱hr/esims:m/z302.1157；旋光[α]25d–26.4°(c＝0.27,meoh),圆二色谱cd(meoh)λmax(δε)＝207(13.5),230(–7.7),277(2.3)nm；and(+)-(2r,4r),浅灰色粉末,高分辨电喷雾质谱hr/esims:m/z302.1158；旋光[α]25d+33.9°(c＝0.11,meoh)；圆二色谱cd(meoh)λmax(δε)＝207(–17.9),230(10.41),and277(–2.67)nm}。表1.吲哚聚酮生物碱dalesindoleb的nmr数据dalesindolec,从ch2cl2/meoh(1:1)混合溶液中得到的淡褐色粉末，，红外ir(kbr)νmax(cm-1)3409,2927,1617,1461,1384,and746；高分辨电喷雾质谱hr/esims:m/z431.1731.1hand13cnmr如表2。手性拆分消旋体c获得两个对映异构体{异构体(+)-(2s,4r),淡褐色粉末,高分辨电喷雾质谱hr/esims:m/z431.1731,旋光[α]25d+20.0°(c＝0.10,meoh),cd(meoh)λmax(δε)＝209(-5.62),236(2.82),and275(-1.18)nm)；和异构体(–)-(2r,4s),淡褐色粉末,高分辨电喷雾质谱hr/esims:m/z431.1729,[α]25d–22.1°(c＝0.27,meoh),圆二色谱cd(meoh)λmax(δε)＝204(18.6),239(–2.51),and279(2.23)nm}.手性拆分消旋体d获得两个对映异构体{异构体(-)-(2s,4s),淡褐色粉末,高分辨电喷雾质谱hr/esims:m/z431.1732,旋光[α]25d–40.0°(c＝0.12,meoh),圆二色谱cd(meoh)λmax(δε)＝201(–16.8),239(2.12),278(–1.84)nm)；和异构体(+)-(2r,4r),淡褐色粉末,高分辨电喷雾质谱hr/esims:m/z431.1732,旋光[α]25d+32.3°(c＝0.11,meoh),圆二色谱cd(meoh)λmax(δε)＝209(5.64),236(–2.87),275(1.15)nm}。表2.吲哚聚酮生物碱dalesindolec的nmr数据实施例4：抗肿瘤实验采用mtt法(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐法)测定化合物dalesindoleb和c的抗肿瘤活性1.培养基配置：培养基中均含10％新生小牛血清、青霉素100u/ml和链霉素100u/ml。培养基名称适用肿瘤细胞dmem培养基mcf-7、mda-mb-231、sw480、a375、caov-3、a549rpmi-1640培养基hl-60、hepg-22.细胞培养：分别将人乳腺癌细胞sw480、hl-60、hepg-2、a375,mcf-7,caov-3,a549和mda-mb-231细胞接种于含有相应培养基的培养瓶中，置于37℃，5％co2培养箱，相对饱和湿度的条件下培养，每3～5d传代一次。3.受试药物处理：将dalesindoleb和dalesindolec分别溶解于适量的dmso(终浓度不超过0.5％)中，再用完全培养基将其稀释成10倍的工作液，置于4℃保存备用。4.mtt比色法检测药物对肿瘤细胞增殖的影响：选用对数生长期的肿瘤细胞sw480、hl-60、hepg-2、a375,mcf-7,caov-3,a549和mda-mb-231，用0.25％胰酶消化，以1×104/ml的浓度分别接种于96孔微板内，每孔100μl。培养24h后加入不同浓度的受试药物，继续培养，使终浓度达到所设定的浓度，阴性对照组中加入等量的dmso液。每浓度设6个平行孔。分别培养24,48,72h后，每孔加入mtt溶液(5mg.ml-1)10μl,继续培养4h，去掉上清，使结晶物充分溶解于dmso中，用酶标仪测定各孔的吸光度(a，570nm)，以6个孔的平均值作为各组的平均a值。按下列公式计算药物对细胞增殖的抑制率(ir)。ir＝(1-用药组测定的平均a值/对照组测定的平均a值)×100％。再根据得到ir值计算相应的ic50值。抗肿瘤活性测试结果(如表3)表明：吲哚聚酮生物碱dalesindoleb-1和dalesindolec-3对sw480、hl-60、hepg-2、a375、caov-3均具有较好的抑制活性，特别是可以选择性地抑制乳腺癌细胞mcf-7和mda-mb-231的增殖。表3.吲哚聚酮生物碱抑制肿瘤细胞增殖活性测试结果((ic50/μm)以上结果提示，吲哚聚酮生物碱(2s,4r)-dalesindoleb和(2s,4s)-dalesindolec具有很强的抗乳腺癌活性且具有一定的选择性，因此本发明的吲哚聚酮生物碱可开发成为新兴抗癌药物。以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本
发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。当前第1页12