一种光固化丝素蛋白水凝胶及其制备方法与流程

本发明涉及一种水凝胶材料，特别涉及一种光固化丝素蛋白水凝胶及其制备方法。
背景技术：
：丝素蛋白，是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70%～80%，含有18种氨基酸，其中甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)和丝氨酸(ser)约占总组成的80%以上。丝素本身具有良好的机械性能和理化性质，如良好的柔韧性和抗拉伸强度、透气透湿性、缓释性等，而且经过不同处理可以得到不同的形态，如纤维、溶液、粉、膜以及凝胶等。水凝胶，是再生丝素的一种重要表现形式，具有高含水量和高度交联的空间网络结构，独特的理化性质和对细胞和小分子优异的透过性和扩散性。因此，以丝素蛋白水凝胶为原料的组织工程、创伤治愈和细胞增殖等研究应运而生。光固化丝素蛋白水凝胶将能够实现溶液原位交联，因而可以用作生物医学上微创、靶向给药，并且可以控制几何形状的原位注射水凝胶，同时能够在生理温度下固化，反应热低，凝胶时间远短于一般丝素蛋白水凝胶。该新型水凝胶在防止血栓、术后粘连的形成，以及药物传送、定向组织修复、角膜修复、细胞移植等生物医学领域具有广阔的应用前景。目前该领域中，中国发明专利（cn201711061174.9）公开一种丝素蛋白基自愈合水凝胶及其制备方法，属于生物材料
技术领域：
，是以丝素蛋白为原料，对丝素蛋白的氨基酸侧链进行化学修饰，在其氨基酸侧链引入环糊精(主体)和胆固醇(客体)，通过主客体单元之间的可逆性结合作用，构建具有自愈合性能的水凝胶。但制得的水凝胶容易破裂，从而破坏了凝胶的结构和功能稳定性。中国发明专利（cn107118359a）将丝素蛋白水溶液与核黄素水溶液混匀后得到复合溶液；复合溶液经紫外光照射后固化，得到光固化水凝胶。但加入的核黄素浓度相对较高，会影响水凝胶的透光性能，同时制得的水凝胶回弹性相对较差。技术实现要素：本发明针对本领域现有技术存在的不足，提供一种具有高透光性、高压缩强度以及高回弹性能的光固化丝素蛋白水凝胶及其制备方法。实现本发明目的的技术方案是提供一种光固化丝素蛋白水凝胶的制备方法，以家蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析处理得到丝素蛋白水溶液，再进行如下步骤：（1）调节丝素蛋白水溶液的浓度为10g/l～50g/l,再分别加入光敏剂核黄素和辣根过氧化物酶，混合均匀，得到复合溶液；复合溶液中，核黄素的终浓度为0.1mmol/l～1mmol/l，辣根过氧化物酶的终浓度为2unit/ml～20unit/ml；（2）将复合溶液倒入可透过紫外光的透明模具中，向复合溶液中通入氧气，保持复合溶液中氧气分压处于饱和状态；（3）在室温、紫外光照射条件下处理20min～40min，得到一种光固化丝素蛋白水凝胶。步骤（1）中加入的辣根过氧化物酶为浓度1000unit/ml的辣根过氧化物酶水溶液。步骤（2）模具中复合溶液的厚度为5毫米～50毫米。步骤（3）所述紫外光照射的光源为功率50w～500w、波长350～400nm的紫外灯；紫外光照射的距离为5cm～10cm。本发明技术方案还包括按上述制备方法得到的一种光固化丝素蛋白水凝胶。本发明以丝素蛋白水溶液为原料，在丝素蛋白水溶液中加入核黄素和辣根过氧化物酶，并在室温下持续通入氧气，在紫外光照射下，诱导丝素蛋白大分子中的基团产生化学交联，从而凝胶化，获得光固化水凝胶，其发明原理是：核黄素在紫外光的照射下，激发生成三线态与o2反应；一方面发生能量的转移生成单线态氧为主的活性氧自由基；另一方面产生电子的转移生成超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基（o2-.）与氢离子结合生成过氧化氢，在辣根过氧化物酶（hrp）的作用下产生更多的自由基。自由基可与各种分子发生反应，诱导丝素蛋白大分子中的基团产生化学交联，从而凝胶化。本发明通过向丝素蛋白水溶液与核黄素水溶液持续通入氧气，可以重复利用核黄素的光敏性，只需要很低的浓度就可以达到光固化的效果，从而可以提高水凝胶的透光性能。而辣根过氧化物酶的加入，增加了自由基的浓度与形成的速度，可提高凝胶回弹性和缩短凝胶时间。这种光固化水凝胶中的丝素蛋白主要以无规卷曲为主，具有高透光性、高压缩强度以及高回弹性能，可以用于组织修复材料。与现有的技术相比，本发明的优势在于：1．本发明在水凝胶的制备过程中，使用的核黄素浓度较低，因此，具有更优良的透光性能。2．采用通入氧气的方法，提供了充足的反应物，使核黄素能够迅速找到分子转移能量，然后再吸收光子，大大提高了核黄素的利用效率，制得的水凝胶具有更高的压缩强度，具有更加优异的弹性回复性。附图说明图1是本发明实施例1制备的核黄素/丝素水凝胶与普通纯丝素水凝胶的电镜照片对比图，a为纯丝素蛋白水凝胶，b为光固化的核黄素/丝素水凝胶。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。实施例1（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置1000unit/ml的辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白溶液浓度为10mg/ml，加入核黄素使其浓度为0.1mm，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为10unit/ml。（3）取以上配制的混合溶液放入可透过紫外光的透明烧杯中，厚度为20毫米。（4）利用制氧机制取纯氧，持续通入烧杯中。（5）采用紫外光表面照射装置，光照30min，紫外光的波长为350～400nm，紫外光的照射距离为5cm，形成核黄素/丝素水凝胶。参见附图1，是本实施例制备的核黄素/丝素水凝胶与普通纯丝素水凝胶的电镜照片对比图。图中，a为纯丝素蛋白水凝胶，b为光固化的核黄素/丝素水凝胶。用模具在形成的核黄素/丝素水凝胶上打孔，制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表一。实施例2（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置1000unit/ml的辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白溶液浓度为20mg/ml，加入核黄素使其浓度为0.3mm，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为10unit/ml。（3）取以上配制的混合溶液放入烧杯，厚度为20毫米。（4）利用制氧机制取纯氧，持续通入烧杯中。（5）采用紫外光表面照射装置，光照30min，紫外光的波长为350～400nm，紫外光的照射距离为5cm，形成水凝胶。（6）用模具在水凝胶上打孔，制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表一。实施例3（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置1000unit/ml的辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白溶液浓度为30mg/ml，加入核黄素使其浓度为0.5mm，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为6unit/ml。（3）取以上配制的混合溶液放入烧杯，厚度为20毫米。（4）利用制氧机制取纯氧，持续通入烧杯中。（5）采用紫外光表面照射装置，光照30min，紫外光的波长为350～400nm，紫外光的照射距离为5cm，形成水凝胶。（6）用模具在水凝胶上打孔，制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表一。实施例4（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置1000unit/ml的辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白溶液浓度为40mg/ml，加入核黄素使其浓度为0.7mm，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为8unit/ml。（3）取以上配制的混合溶液放入烧杯，厚度为20毫米。（4）利用制氧机制取纯氧，持续通入烧杯中。（5）采用紫外光表面照射装置，光照30min，紫外光的波长为350～400nm，紫外光的照射距离为5cm，形成水凝胶。（6）用模具在水凝胶上打孔，制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表一。实施例5（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置1000unit/ml的辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白溶液浓度为50mg/ml，加入核黄素使其浓度为0.9mm，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为5unit/ml。（3）取以上配制的混合溶液放入烧杯，厚度为20毫米。（4）利用制氧机制取纯氧，持续通入烧杯中。（5）采用紫外光表面照射装置，光照30min，紫外光的波长为350～400nm，紫外光的照射距离为5cm，形成水凝胶。（6）用模具在水凝胶上打孔，制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表一。实施例6（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析34～天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置1000unit/ml的辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白溶液浓度为10mg/ml，加入核黄素使其浓度为0.2mm，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为20unit/ml。（3）取以上配制的混合溶液放入烧杯，厚度为15毫米。（4）利用制氧机制取纯氧，持续通入烧杯中。（5）采用紫外光表面照射装置，光照30min，紫外光的波长为350～400nm，紫外光的照射距离为6cm，形成水凝胶。（6）用模具在水凝胶上打孔，制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表一。实施例7（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置1000unit/ml的辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白溶液浓度为20mg/ml，加入核黄素使其浓度为0.2mm，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为17unit/ml。（3）取以上配制的混合溶液放入烧杯，厚度为25毫米。（4）利用制氧机制取纯氧，持续通入烧杯中。（5）采用紫外光表面照射装置，光照30min，紫外光的波长为350～400nm，紫外光的照射距离为8cm，形成水凝胶。（6）用模具在水凝胶上打孔，制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表一。实施例8（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置1000unit/ml的辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白溶液浓度为30mg/ml，加入核黄素使其浓度为0.2mm，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为18unit/ml。（3）取以上配制的混合溶液放入烧杯，厚度为30毫米。（4）利用制氧机制取纯氧，持续通入烧杯中。（5）采用紫外光表面照射装置，光照30min，紫外光的波长为350～400nm，紫外光的照射距离为8cm，形成水凝胶。（6）用模具在水凝胶上打孔，制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表一。实施例9（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置1000unit/ml的辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白溶液浓度为40mg/ml，加入核黄素使其浓度为0.2mm，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为19unit/ml。（3）取以上配制的混合溶液放入烧杯，厚度为40毫米。（4）利用制氧机制取纯氧，持续通入烧杯中。（5）采用紫外光表面照射装置，光照30min，紫外光的波长为350～400nm，紫外光的照射距离为9cm，形成水凝胶。（6）用模具在水凝胶上打孔，制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表一。实施例10（1）丝素蛋白水溶液的制备：称取3g无水nahco3和1g无水na2co3放入煮沸的4l去离子水中，充分溶解后加入80g蚕茧，调节溶液状态为微沸，每隔10分钟用玻璃棒搅拌一次，30分钟后用去离子水洗涤干净，重复上述操作3次，每次称取新的无水nahco3和无水na2co3；充分洗净后，将蚕丝扯松，放入60℃烘箱中烘干。取100ml的9.3mol/l的溴化锂溶液倒入锥形瓶中，在恒温磁力搅拌器中加热到65℃，将总重15g的脱胶丝素分多次加入，在65±2℃下溶解30～40分钟，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3～4天，透析完成后，将得到丝素蛋白溶液用脱脂棉过滤后装入试剂瓶中，低温保存备用。（2）配置1000unit/ml的辣根过氧化物酶水溶液，调节丝素蛋白溶液浓度为50mg/ml，加入核黄素使其浓度为0.2mm，加入辣根过氧化物酶水溶液，使其浓度为20unit/ml。（3）取以上配制的混合溶液放入烧杯，厚度为50毫米。（4）利用制氧机制取纯氧，持续通入烧杯中。（5）采用紫外光表面照射装置，光照30min，紫外光的波长为350～400nm，紫外光的照射距离为10cm，形成水凝胶。（6）用模具在水凝胶上打孔，制成尺寸为10mm（直径）×8mm（高）的圆柱型样品，在tms-pro型质构仪上进行压缩力学测试，测试结果参见表一。表一核黄素/丝素蛋白水凝胶的性能样品压缩率（%）压缩强度（kpa）压缩率（%）压缩回弹性（%）实施例19017.48081.1实施例29042.78093.3实施例39046.58093.1实施例49051.18093.7实施例59052.88085.3实施例69029.68080.3实施例79035.48088.1实施例89045.38080.4实施例99046.78089.6实施例109052.48090.2从表一可以看出，本发明各实施例提供的光固化水凝胶压缩强度可以达到50kpa以上，在压缩率达到80%的情况下，弹性回复性可以达到80%以上，最高可以达到93%。当前第1页12