本发明属于基因工程技术领域，涉及slgras4基因在提高番茄果实抗冷害的应用。
背景技术
番茄果实采后的低温贮藏会对品质产生不利的影响，家庭冰箱的保鲜温度一般为4℃左右，对番茄果实会造成严重的冷害损伤。番茄果实的冷害损伤一方面表现为果实不能完全成熟，另一方面是果皮结构受损皱缩；与此同时，果实的风味品质(如糖含量、芳香物质含量和酚类物质含量)变差。说明番茄采后的低温贮藏影响外观品相的同时伴随着风味变差。
目前在生产实践中，番茄在刚刚破色时采摘，随后直接放在低温条件下冷藏，或者进行一些预处理(如温水浸泡、化学试剂喷施处理等)来减缓冷害损伤，但效果只能达到部分缓解，并不能大幅度、高效率的解决果实的冷害损伤。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供slgras4基因在提高番茄果实抗冷害的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
slgras4基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。
slgras4基因在培育冷害抗性番茄品种中的应用。
含有slgras4基因的重组表达载体。
上述重组表达载体的构建方法，在plp100-35s载体的smai位点连入slgras4基因，得到重组质粒plp100-35s-slgras4。
优选的，采用同源重组技术连入slgras4基因。
优选的，将seqidno.2和seqidno.3所示的扩增引物序列seq-f(下划线部分为载体接头序列)和seq-r(下划线部分为载体接头序列)扩增得到的slgras4基因的编码框片段(图8)，连接到克隆载体peasy-blunt-zero上，然后通过同源重组反应将slgras4基因的编码框接到plp100-35s终载体上，其中，plp100-35s终载体的核苷酸序列如seqidno.8所示。
seq-f：
seq-r：
上述重组表达载体在培育冷害抗性番茄品种中的应用。
一种冷害抗性番茄品种的培育方法，具体步骤如下：
(1)构建含有slgras4基因的重组表达载体，并转化微生物转化本，制备工程菌；
(2)利用步骤(1)制备的工程菌转化番茄外植体，共培养、诱导生芽、生根，即得一种冷害抗性番茄品种。
优选的，步骤(1)中，所述微生物转化本为根癌农杆菌gv3101。
优选的，步骤(1)的具体方法是：
(1-1)将采用seqidno.2和seqidno.3所示的扩增引物序列扩增得到的片段与peasy-blunt-zero载体连接，转化dh5α涂在含有50μg/ml卡纳霉素的平板上筛选，挑选单克隆菌株，做菌落pcr，将扩增出目的片段的菌株送测序，测序正确后方可认定为阳性菌株；
(1-2)将步骤(1-1)中的阳性菌株摇菌抽提质粒，以此质粒为模板采用seqidno.2和seqidno.3所示的扩增引物序列扩增，得到的片段切胶，回收，然后将回收的目的产物与smai单酶切的plp100-35s空载体胶回收产物在takara
(1-3)取步骤(1-2)中获得的阳性菌株，摇菌，提质粒即为重组表达载体的plp100-35s-slgras4质粒，转化农杆菌gv3101在含有50μg/ml卡纳霉素和100μg/ml利福平的平板上面筛选，挑选单克隆进行菌落pcr验证，验证通过后的菌株即为所述重组表达载体的工程菌。
优选的，步骤(2)的具体方法是：用含有重组质粒plp100-35s-slgras4的农杆菌通过叶盘法转化番茄外植体，具体步骤如下：
a.种子消毒
野生型番茄种子放入灭过菌的组培瓶中，倒入体积百分数70％的乙醇水溶液中浸泡30秒进行表面消毒；倒出乙醇水溶液，马上倒入有效氯5％的次氯酸钠溶液浸泡15分钟；无菌水洗涤3次后留适量无菌水使其没过种子，盖紧瓶盖后放置在100rpm的摇床上震荡2-3天。待种子萌发后转移到种子培养基上，放入光照培养箱培养。
b.外植体预培养
番茄幼苗的真叶即将长出时为获得外植体的最佳时期，将幼苗放于无菌的滤纸上，用手术刀片将子叶和下胚轴切段，用镊子小心的转移到kcms预培养基上暗培养一天。
c.农杆菌侵染外植体
在20mllb(含有20μl50μg/ml卡那霉素和40μl100μg/ml利福平)中加入100μl保存的农杆菌甘油菌，28℃，250rpm培养过夜，直到od600约1.0。吸取1ml菌液5000rpm离心5min，弃上清，用kcms液体培养基洗涤一次，再用kcms液体培养基将菌液稀释至od600约为0.1时为最佳侵染浓度。在外植体的伤口处滴加10μl稀释好的农杆菌，菌液无需吸出，将平皿封口后暗培养2天。
d.外植体的分化与生根
外植体与农杆菌共培养2天后，用镊子小心将外植体转移至初筛2z培养基上培养，每2周更换一次初筛培养基。待有分化的芽点冒出时，将外植体转移至1z培养基上培养，每2周更换一次培养基。当分化的愈伤组织长出具有独立主茎的芽体后，切下并插入生根培养基enr中，待生根后移栽至土中。
e.转基因阳性植株的鉴定
在slgras4基因的3’端设计一条前引物，35s-terminator(35s-终止子)序列的尾端设计一条后引物(slgras4-oecheck-f:agcagtggcaacttagatgc；slgras4-oecheck-r:cctggattttggtttttaggg)，如seqidno.4和seqidno.5所示。以t0代幼苗的基因组dna为模板进行pcr扩增，电泳检测出预期大小的片段确定为转基因阳性植株。t0代种子经卡那霉素筛选后播种，提取t1代植株叶片总rna，反转录cdna后进行荧光定量pcr检测slgras4基因的表达量(slgras4-qpcr-f:ttaggcacccttccattcca；slgras4-qpcr-r:aagaatctcccactccaacaaca)，如seqidno.6和seqidno.7所示，表达量较高的3个株系收取种子经卡那霉素筛选后播种至t2和t3代用于后续研究。
进一步优选的，步骤a中，光照培养箱条件为：光照14小时，温度25℃；黑暗10小时，温度20℃；光照强度，250μmol·m-2·s-1；相对湿度，80％。
一种冷害抗性番茄品种，是通过上述培育方法得到的。
本发明的有益效果在于：
本发明利用基因工程技术，通过超表达番茄slgras4基因可以显著提高番茄果实采后的冷害抗性，冷害处理后的超表达果实可以正常成熟且果皮不会出现皱缩等可见损伤，其果实的风味品质也能维持在较高水平。在生产过程中，不需增加任何预处理步骤和经济投入，即可达到很好的抗冷害效果。
本发明的超表达果实采后无需任何预处理，即可直接进行低温贮藏，果实并不会产生冷害损伤，且风味品质也维持在较高水平。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为番茄slgras4基因扩增产物连接peasy-bluntzero载体，菌落pcr验证凝胶电泳图，其中m为dna分子量标准marker，1为检测引物扩增的目的条带；
图2为终载体plp100-35s-slgras4转化农杆菌gv3101后菌落pcr的验证凝胶电泳图，其中m为dna分子量标准marker，1为检测引物扩增的目的条带；
图3为番茄slgras4基因在野生型(wt)和转基因(oe#12、#18和#27)番茄中的表达量分析；
图4为转基因高抗冷性番茄与野生型番茄果实的冷害处理表型对比图，其中，a为野生型和转基因绿熟期果实在常温处理和冷害处理后的照片；b为野生型和转基因绿熟期果实冷害处理后的冷害指数，c为果实硬度，d为果实失水率，e、f、g为色度统计；显著性差异分析为student’st-test(**p<0.01,*p<0.05)；
图5为转基因高抗冷性番茄与野生型番茄果实总可溶性糖含量的测定；
图6为转基因高抗冷性番茄与野生型番茄果实总酚含量的测定；
图7为转基因高抗冷性番茄与野生型番茄果实芳香物质含量的测定；
图8为slgras4基因开放阅读框的序列信息；
图9为plp100-35s载体图谱。
其中，图4～7中的rnai10、15、16为下调slgras4的转基因果实，作为超表达slgras4的对照。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明涉及的克隆载体peasy-blunt-zero，购自北京全式金生物有限公司。
一种冷害抗性番茄品种的培育方法，具体步骤如下：
(1)构建含有slgras4基因(开放阅读框的序列信息见图8)的重组表达载体，并转化微生物转化本，制备工程菌
(1-1)将采用seqidno.2和seqidno.3所示的扩增引物序列扩增得到的片段与peasy-blunt-zero载体连接，转化dh5α涂在含有50μg/ml卡纳霉素的平板上筛选，挑选单克隆菌株，做菌落pcr，将扩增出目的片段的菌株送测序，测序正确后方可认定为阳性菌株；(图1)
(1-2)将步骤(1-1)中的阳性菌株摇菌抽提质粒，以此质粒为模板采用seqidno.2和seqidno.3所示的扩增引物序列扩增，得到的片段切胶，回收，然后将回收的目的产物与smai单酶切的plp100-35s(载体图谱见图9)空载体胶回收产物在takara
(1-3)取步骤(1-2)中获得的阳性菌株，摇菌，提质粒即为重组表达载体的plp100-35s-slgras4质粒，转化农杆菌gv3101在含有50μg/ml卡纳霉素和100μg/ml利福平的平板上面筛选，挑选单克隆进行菌落pcr验证(所用引物对为：seqidno.2和seqidno.3)，验证通过后的菌株即为所述重组表达载体的工程菌。(图2)
(2)利用步骤(1)制备的工程菌转化番茄外植体，共培养、诱导生芽、生根，即得一种冷害抗性番茄品种
用含有重组质粒plp100-35s-slgras4的农杆菌通过叶盘法转化番茄外植体，具体步骤如下：
a.种子消毒
野生型番茄种子放入灭过菌的组培瓶中，倒入体积百分数70％的乙醇水溶液中浸泡30秒进行表面消毒；倒出乙醇水溶液，马上倒入有效氯5％的次氯酸钠溶液浸泡15分钟；无菌水洗涤3次后留适量无菌水使其没过种子，盖紧瓶盖后放置在100rpm的摇床上震荡2-3天。待种子萌发后转移到种子培养基上，放入光照培养箱培养。
b.外植体预培养
番茄幼苗的真叶即将长出时为获得外植体的最佳时期，将幼苗放于无菌的滤纸上，用手术刀片将子叶和下胚轴切段，用镊子小心的转移到kcms预培养基上暗培养一天。
c.农杆菌侵染外植体
在20mllb(含有20μl50μg/ml卡那霉素和40μl100μg/ml利福平)中加入100μl保存的农杆菌甘油菌，28℃，250rpm培养过夜，直到od600约1.0。吸取1ml菌液5000rpm离心5min，弃上清，用kcms液体培养基洗涤一次，再用kcms液体培养基将菌液稀释至od600约为0.1时为最佳侵染浓度。在外植体的伤口处滴加10μl稀释好的农杆菌，菌液无需吸出，将平皿封口后暗培养2天。
d.外植体的分化与生根
外植体与农杆菌共培养2天后，用镊子小心将外植体转移至初筛2z培养基上培养，每2周更换一次初筛培养基。待有分化的芽点冒出时，将外植体转移至1z培养基上培养，每2周更换一次培养基。当分化的愈伤组织长出具有独立主茎的芽体后，切下并插入生根培养基enr中，待生根后移栽至土中。
e.转基因阳性植株的鉴定
在slgras4基因的3’端设计一条前引物，35s-terminator(35s-终止子)序列的尾端设计一条后引物(slgras4-oecheck-f:agcagtggcaacttagatgc；slgras4-oecheck-r:cctggattttggtttttaggg)，如seqidno.4和seqidno.5所示。以t0代幼苗的基因组dna为模板进行pcr扩增，电泳检测出预期大小的片段确定为转基因阳性植株。t0代种子经卡那霉素筛选后播种，提取t1代植株叶片总rna，反转录cdna后进行荧光定量pcr检测slgras4基因的表达量(slgras4-qpcr-f:ttaggcacccttccattcca；slgras4-qpcr-r:aagaatctcccactccaacaaca)，如seqidno.6和seqidno.7所示，表达量较高的3个株系收取种子经卡那霉素筛选后播种至t2和t3代用于后续研究。
步骤a中，光照培养箱条件为：光照14小时，温度25℃；黑暗10小时，温度20℃；光照强度，250μmol·m-2·s-1；相对湿度，80％。
本发明涉及的培养基配方见表1。
表1.培养基及添加物配比表
注：-代表不添加。ms，ms基础盐培养基；kh2po4，磷酸二氢钾；vb1，维生素b1；as，乙酰丁香酮；2,4-d，生长激素；kt，激动素；aug，阿莫西林钠克拉维酸钾；tm，替卡西林钠克拉维酸钾；kan，卡那霉素；zr，反式玉米素核苷；vr3：维生素b11g/l，烟酸0.5g/l，维生素b60.5g/l。
如图3～7所示，本发明通过超量表达番茄slgras4基因获得一种冷害抗性的番茄品种，与野生型番茄果实一同进行冷害处理后，野生型果实冷害损伤严重，表现为不能正常成熟且表皮明显损伤严重，相反，转基因番茄果实能够正常成熟且表皮无损伤；同时，冷害处理后的转基因番茄果实中的可溶性糖含量高于野生型果实，对风味有益的芳香物质含量和总酚含量也均显著的高于野生型果实。这些结果说明超表达番茄slgras4基因可以获得一种冷害抗性的番茄品种，其果实采后无需任何预处理即可直接低温贮藏，且不会影响番茄果实的外观品质和风味品质。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>重庆大学
<120>slgras4基因在提高番茄果实抗冷害的应用
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>2001
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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<213>人工序列(artificialsequence)
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