本发明涉及分子生物学、基因工程领域，具体地涉及一种番茄胁迫响应基因、其重组表达载体及其在培育耐盐番茄中的应用。
背景技术
番茄、马铃薯、茄子和辣椒等茄科植物易受很多环境胁迫的影响。番茄是一种世界范围内广泛栽培的农作物，是世界上最重要的蔬菜和园艺作物之一。番茄除了作为抗氧化剂、矿物质、纤维和维生素的重要来源之外，还被广泛用作基因工程、果实成熟等方面的研究材料。然而，大多数番茄品种在种子发育、营养生长和繁殖等发育阶段都对盐敏感，因此在盐胁迫下其果实产量受到显著的抑制。而番茄的产量是农业生产中备受关注的重要问题之一。传统的育种方法周期长、耗资大、效果不显著等问题已不能满足现代番茄生产的需求。近年来，随着转基因技术的日益成熟和完善，基因工程技术已广泛应用于番茄品种的改良和育种。我们致力于筛选胁迫响应的功能基因，通过基因工程的方法，我们将胁迫响应的slste1基因超表达于番茄中，获得了耐盐性增强的转基因番茄株系。利用基因工程技术手段快速获取稳定遗传、性状优良的番茄新品种必将是当前和未来的发展趋势。
技术实现要素：
为了克服现有盐渍土的改良方法的不足，本发明提供了一种番茄胁迫响应基因，其核苷酸序列为下列序列之一：
(1)如seqidno.3所示的核苷酸序列；
(2)如seqidno.3所示的核苷酸序列经添加、替换、插入或缺失一个或几个核苷酸而成的同源序列；
(3)如seqidno.3所示的核苷酸序列的等位基因或所述等位基因衍生物的核苷酸序列。
此构成本发明的第一个方面。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述番茄胁迫响应基因的全序列、上述番茄胁迫响应基因的部分片段或上述重组表达载体，此构成本发明的第二个方面。
本发明还提供了一种微生物转化体，所述微生物转化体含有上述番茄胁迫响应基因的全序列或部分片段，此构成本发明的第三个方面。
进一步的，上述的微生物转化体为根癌农杆菌。
本发明还进一步提供了，上述番茄胁迫响应基因、重组表达载体、微生物转化体或根癌农杆菌在培育耐盐番茄品种中的应用，此构成本发明的第四个方面。
进一步的，所述应用具体包括步骤：
s1：构建含番茄胁迫响应基因的全序列或部分片段的重组超表达载体，然后转化微生物，获得微生物转化体；
s2：将所得微生物转化体转化番茄子叶，然后在ph为5.8含1mg/l吲哚乙酸、1.75mg/l玉米素和30g/l蔗糖的ms固体培养基中于25℃、黑暗条件下共培养2d；再转入ph为5.8的含1.0mg/l吲哚乙酸、1.75mg/l玉米素、30g/l蔗糖、500mg/l羧苄青霉素和50mg/l卡那霉素的ms固体培养基中，于25℃，光照强度1000-2000lx条件下光照16h，再在18℃条件下黑暗8h培养至长出再生芽；
s3：当芽长长至3cm时切下再生芽，转入ph为5.8的含有250mg/l羧苄青霉素、50mg/l卡那霉素和30g/l蔗糖的ms固体培养基中，在25℃、光照强度1000-2000lx的条件下光照16h，再在18℃黑暗8h培养至生根，得耐盐番茄品种。
本发明的有益效果：本发明的番茄胁迫响应基因通过重组表达载体转入番茄后所得的转基因番茄植株的耐盐性与非转基因植株相比显著增强；本发明的番茄胁迫响应基因、重组表达载体、微生物转化体或根癌农杆菌在培育耐盐番茄品种中的应用，采用基因工程技术，使转基因番茄植株使高效且可稳定遗传的增强了耐盐性，在培养耐盐番茄品种方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1本发明实施例2中含有slste1基因的重组表达载体构建示意图；
图2本发明实施例5中pcr检测nptii标记基因在转基因番茄植株中的表达量，其中，m为maker，ck+为阳性对照，ac++为空白对照，1、2、6、11、13为不同的转基因番茄植株；
图3为本发明实施例5中slste1基因在阳性转基因番茄植株中的表达量，其中，ac++为非转基因番茄，1、2、6、11、13为不同的阳性转基因番茄株系；
图4为本发明实施例6中阳性转基因番茄植株与非转基因番茄在盐胁迫处理下的表型对比照片，其中ac++为非转基因番茄，1、2、6为不同的阳性转基因番茄株系。a、b、c图分别表示盐胁迫处理0、15和25天后的番茄植株表型。
具体实施方式：
以下将结合附图对本发明优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第二版，j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明实施例中使用的番茄品种为“solanumlycopersiconmill.cv.ailsacraig”，番茄种子于2015年6月采集于江苏省徐州市。pbi121载体购自优宝生物公司、大肠杆菌dh5α感受态购自北京博迈德基因技术有限公司；根癌农杆菌lba4404感受态为北京博迈德基因技术有限公司产品；pmd19-t载体、rna提取试剂rnaisoplus、dna提取试剂盒universalgenomicdnaextractionkitver.3.0、反转录试剂盒primescript1ststrandcdnasynthesiskit、dna纯化试剂盒、连接试剂盒dnaligationkitver.2.1、限制性内切酶、taqdna聚合酶、primestarhsdna聚合酶、定量pcr试剂sybrpremixextaqii(2×)(tlirnasehplus)均为大连takara公司产品；引物合成与测序由擎科新业生物技术有限公司完成，其余试剂均为分析纯试剂。
实施例1番茄slste1基因的全长序列的制备
根据ncbi数据库中番茄基因核苷酸序列(ak329679)，设计克隆slste1基因的全长引物，分别为f-slste1-f和f-slste1-r，引物序列如下：
f-slste1-f：5'agaaaaggaagagagaagatgg3'(seqidno.1)；
f-slste1-r：5'caatgaatgaaagaagttgacc3'(seqidno.2)；
提取番茄果实总rna，根据primescript1ststrandcdnasynthesiskit说明书的步骤合成cdna，再以cdna为模板，以seqidno.1和seqidno.2为引物，扩增slste1基因全长，pcr反应体系为：21μlddh2o、25μlprimestarhs(premix)、2μlcdna模板、下游引物各各1μl，共50μl；pcr反应程序为：98℃10s，58℃5s，72℃1min，32个循环。
将pcr扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，目的片段采用dna纯化试剂盒进行纯化后，连接到pmd19-t载体，获得重组质粒pmd19-t::slste1，然后送擎科新业生物技术有限公司测序。结果显示，获得的slste1基因长度为289bp，其中编码区长度为234bp，核苷酸序列如seqidno.3所示。。
实施例2含番茄slste1基因的重组表达载体的构建
根据pbi121载体的多克隆位点和slste1基因核苷酸序列，设计构建含slste1编码区的超表达载体的引物，具体为：
slste1-ov-f：5'-cgcggatccagaaaaggaagagagaagatgg-3'(seqidno.4)，下划线部分为bamhi酶切位点。
slste1-ov-r：5'-cgagctccaatgaatgaaagaagttgacc-3'(seqidno.5)，下划线部分为saci酶切位点。
重组表达载体的构建过程如图1所示，具体为：以重组质粒pmd19-t::slste1为模板，以seqidno.4和seqidno.5为引物，进行pcr扩增，pcr反应体系为：21μlddh2o、25μlprimestarhs(premix)、2μlcdna模板、下游引物各各1μl，共50μl；pcr反应程序为：98℃10s，58℃5s，72℃1min，32个循环，扩增获得两侧带bamhi和saci酶切位点的slste1基因片段；纯化后的slste1基因产物用bamhi和saci双酶切，再与经相同酶双酶切的pbi121载体在t4dna连接酶作用下连接，获得重组质粒pbi121::slste1，并由擎科新业生物技术有限公司测序验证。
实施例3根癌农杆菌lba4404感受态的转化
将含有pbi121::slste1重组表达载体的质粒根据北京博迈德基因技术有限公司根癌农杆菌lba4404感受态的转化方法，将重组超表达载体转化进入lba4404菌种，菌液均匀涂在含有50mg/l利福平、500mg/l链霉素和50mg/l卡那霉素yeb固体培养基中(ph7.2)，28℃黑暗条件下倒置培养2-2.5天，至长出单菌落，用seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列为引物，鉴定得到阳性的单菌落，然后用含有50mg/l利福平、500mg/l链霉素、50mg/l卡那霉素的yeb液体培养基(ph7.2)在28℃、黑暗、200rpm条件下培养至菌液od600为1.8-2.0，提取质粒，再用seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列为引物进行pcr鉴定，阳性重组子即为pbi121::slste1农杆菌工程菌株，-80℃冻存备用。
实施例4耐盐番茄植株的转化
a.农杆菌工程菌株的活化：将含有pbi121::slste1的农杆菌工程菌株接种于50mg/l利福平、500mg/l链霉素和50mg/l卡那霉素的yeb固体培养基(ph7.2)上，28℃黑暗条件下活化2-3天至长出单菌落，挑取单菌落，用含有50mg/l利福平、500mg/l链霉素和50mg/l卡那霉素的yeb液体培养基(ph7.2)20ml，在28℃、200rpm条件下扩大培养1.5天，再将所得菌液按体积比为1:100接入含有50mg/l利福平、500mg/l链霉素和50mg/l卡那霉素的yeb液体培养基(ph7.2)中，在28℃、200rpm条件下扩大培养至od600为1.8～2.0，然后28℃离心弃上清，菌体用新鲜的yeb液体培养基(ph7.2)洗涤，再用ms盐液体培养基(ph5.8)100ml重悬，制得农杆菌工程菌液。
b.番茄种子的消毒：无菌水浸泡种子4h后，用75％的酒精消毒番茄种子2min，无菌水冲洗3次后，再用2％(v/v)的naclo水溶液消毒种子15min，无菌水冲洗7次，然后播种在ms固体培养基(ph5.8)上，光照培养箱27℃(16h光照)/18℃(8h黑暗)培养10～15天直至子叶展开。
c.番茄外植体的遗传转化：切除已展平子叶的两端即得备用的番茄外植体，在含有0.2mg/l2，4-d和0.1mg/lkt的ms液体培养基(ph5.8)中浸泡1h，然后放置在含有1mg/l吲哚乙酸、1.75mg/l玉米素和30g/l蔗糖的ms固体培养基(ph5.8)中于25℃、黑暗条件下共培养2d；将预培养的子叶浸泡在b步骤中ms盐培养基重悬的农杆菌菌液中15min，用灭过菌的滤纸吸干多余的菌液，放回原培养基共培养2d。然后再转入含1.0mg/l吲哚乙酸、1.75mg/l玉米素、30g/l蔗糖、500mg/l羧苄青霉素和50mg/l卡那霉素的ms固体培养基(ph5.8)中，于光照16h(25℃，光照强度1000-2000lx)、黑暗8h(18℃)条件下培养至长出再生芽；待芽长至约3cm时切下再生芽，转入含有250mg/l羧苄青霉素、50mg/l卡那霉素和30g/l蔗糖的ms固体培养基(ph5.8)中，在光照16h(25℃，光照强度1000-2000lx)、黑暗8h(18℃)条件下培养至生根，即得转化的番茄植株。本实施例中，所有与ms培养基接触的用具和试剂都是无菌的。
实施例5耐盐番茄植株的转化
1.pcr检测nptii标记基因在转基因番茄植株中的表达
根据载体pbi121中的nptii标记基因序列，设计如下特异检测引物：
nptii-f：5'-actgggcacaacagacaatcg-3'(seqidno.6)；
nptii-r：5'-gcatcagccatgatggatacttt-3'(seqidno.7)。
分别取转基因番茄植株和非转基因番茄植株叶片，根据dna提取试剂盒universalgenomicdnaextractionkitver.3.0说明书提取基因组dna，再以此为模板、seqidno.6和seqidno.7所示序列为引物进行pcr扩增，检测nptii标记基因在转基因番茄植株中的表达。pcr产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果如图2所示，可以看出，转基因番茄植株的pcr产物在289bp位置出现目标dna条带，证实这些植株为阳性转基因番茄植株。
2.定量pcr检测slste1基因在阳性转基因番茄植株中的表达
根据slste1基因序列和番茄内参基因cac的序列，设计如下定量引物：
slste1-q-f：5'-tcacaatttgtatttccaccactc-3'(seqidno.8)；
slste1-q-r：5'-aatgatatttgatgccttactttcc-3'(seqidno.9)；
slcac-q-f：5'-cctccgttgtgatgtaactgg-3'(seqidno.10)；
slcac-q-r：5'-attggtggaaagtaacatcatcg-3'(seqidno.11)。
分别取阳性转基因番茄植株和非转基因番茄植株的成熟叶，提取总rna，并将其反转录为cdna，再以此为模板，分别以seqidno.8和seqidno.9所示序列，seqidno.10和seqidno.11所示序列为引物进行定量pcr，检测slste1基因在阳性转基因番茄植株中的表达量。具体步骤如下：在0.1ml八联管中分别加入3.0μlddh2o、5μlsybrpremixextaqii、1μlcdna模板及上下游引物各0.5μl，总体积为10μl。pcr反应程序为95℃预变性10s，然后95℃5s，60℃45s，40个循环，然后进行融解曲线分析，结果如图3所示。从图3中可以看出，阳性转基因番茄植株中slste1基因的表达有显著的提高，其中slste1基因在转基因株系1、2、6、11和13中的表达量分别达到约26、21、53、11和5倍。
实施例6阳性转基因番茄植株的耐盐表型分析
将上述获得的阳性转基因番茄植株和非转基因番茄植株的种子进行筛选种植，收获t3代阳性转基因番茄植株的种子，经消毒后在温室中先播种于育苗穴中预培养10d，而后移植到长宽高为10cm的黑色育苗盆中继续生长到8周大小的苗龄。同时向上述阳性转基因番茄植株和非转基因番茄植株的根部每三天灌溉300mm的nacl200ml，持续观察阳性转基因番茄植株的表型特征变化，并于盐胁迫处理的第0、15和25天后拍照记录表型的差异，如图4所示。从图4中可以看出，转基因番茄植株的耐盐性明显获得提升。由以上结果可知，可以通过超表达slste1基因获得耐盐的番茄新品种，并具有良好的市场应用前景。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
序列表
<110>江苏师范大学
<120>番茄胁迫响应基因、其重组表达载体及其在培育耐盐番茄中的应用
<160>11
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
agaaaaggaagagagaagatgg22
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
caatgaatgaaagaagttgacc22
<210>3
<211>289
<212>dna
<213>番茄(lycopersiconesculentummiller)
<400>3
agaaaaggaagagagaagatgggatgcttcgattgcttcgatgggggcagcaaaagagaa60
caaaggagagaagaagaacaattagcctccgaagaagctcgtgccagagctgccgaagcc120
gcccaaaaaaggcaagaacaatatgaaaaatctgccgcaggaagagcagcacgtgcacaa180
atggcagctgctgccaagcaagcaacgaatgcaaaccagggagaaccagttcttaaatgg240
cagatgggatgagcattagttctcttaggtcaacttctttcattcattg289
<210>4
<211>31
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
cgcggatccagaaaaggaagagagaagatgg31
<210>5
<211>29
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
cgagctccaatgaatgaaagaagttgacc29
<210>6
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
actgggcacaacagacaatcg21
<210>7
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
gcatcagccatgatggatacttt23
<210>8
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
tcacaatttgtatttccaccactc24
<210>9
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
aatgatatttgatgccttactttcc25
<210>10
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
cctccgttgtgatgtaactgg21
<210>11
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>11
attggtggaaagtaacatcatcg23