本发明涉及基因工程技术领域，更具体地涉及一种提高镉抗性及镉含量的基因及其用途。
背景技术
我国是农业大国，土壤是立农之本，其作为重要的自然环境要素被动承载着包括重金属在内的大部分污染物；我国重金属污染的耕地面积已达2000万公顷，每年仅镉污染的粮食高达1200万吨，造成的直接经济损失超过200亿元。重金属元素的难降解、易富集及食物链的可传递性给生态环境和食品安全带来严重威胁，是人类生命健康和安全的“隐形杀手”，近年来“镉米”等重金属污染食品事件频发，令人痛心疾首，镉污染土壤治理刻不容缓。开展镉超积累型植物抗性基因的功能研究，阐明植物耐受镉的分子机制，培育镉抗性转基因新种质以及治理和修复我国重金属污染土壤具有重要意义。
超积累型东南景天是我国本土生长的锌/镉（cd/zn）超积累型植物，其在地上部分可以积累9,000μg.g-1cd和29,000μg.g-1zn而不呈现任何毒性症状，极具研究价值；东南景天通过高效的根-茎转运机制将高浓度的镉离子转运到地上部分，并最终储存于叶肉的薄壁细胞、茎的髓部及皮层组织中。
为了解析超积累型东南景天的高抗及超积累能力，有研究者对参与离子转运、螯合、氧化损伤修复等进程的基因开展研究；然而，在超积累型东南景天中是否存在特异的镉离子转运、解毒、应答相关蛋白仍不清楚。现有研究表明超积累型东南景天sanramp6基因可以提高植物的镉离子积累量，但过高的镉离子积累使得转基因植物的镉抗性降低。东南景天中是否存在一种基因既可以提升转基因植物的镉抗性又可以提高镉含量亟需开展研究。
技术实现要素：
本发明通过构建东南景天cdna文库，借助镉敏感型酵母筛选镉抗性基因，首次从东南景天cdna文库中发现了具有提高镉抗性及镉含量功能的基因，并将其命名为sedumalfrediicdtoleranceprotein(sactp)，将所述sactp基因转入镉敏感型酵母突变体菌株（ycf1）中，通过酵母点板实验发现在含镉的培养基上转基因酵母的生长状况明显优于对照组。将所述sactp基因在拟南芥中异源表达，发现在拟南芥中异源表达sactp基因后可以显著提高转基因拟南芥的镉抗性及镉离子吸收量。
本发明的目的之一是提供一种提高镉抗性及镉含量的基因。
本发明的目的之二是提供含有上述提高镉抗性及镉含量相关基因的转基因拟南芥植株。
本发明的目的之三是提供含有上述提高镉抗性及镉吸收量相关基因在提高植物的镉抗性及镉含量方面的应用。
为了达到上述目的，本发明公开了一种提高镉抗性及镉含量的基因sactp，所述基因sactp从东南景天的叶片cdna文库中所分离获得，其核苷酸序列如seq.id.no.1所示。
本发明还提供一种提高镉抗性及镉含量的基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为seq.id.no.2所示。
本发明还提供一种含有提高镉抗性及镉含量的基因的拟南芥转基因植株。
本发明还提供一种提高镉抗性及镉含量的基因在提高植物的镉抗性及镉含量方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是:
（1）本发明提供了一种具有提高镉抗性及镉含量的植物编码基因sactp，该基因目前尚未见相关的报道研究，该基因源自于东南景天cdna文库酵母异源表达后的镉胁迫筛选；通过构建sactp的酵母表达载体，利用酵母点板实验可验证本发明所述基因能提高酵母镉抗性。
（2）本发明将sactp基因在拟南芥中异源表达，发现该基因可以显著提高转基因拟南芥幼苗及成苗的镉抗性及镉离子含量，与普通拟南芥相比，镉胁迫后幼苗的生物量提高了35-50%，幼苗根长提高了75-90%，成苗的镉离子含量提高了20-60%。
（3）本发明所述的sactp基因为培育具有高镉抗性高镉含量植物新种质提供基因资源，可应用于镉污染地区的土壤监测与治理中，在研究植物生物修复技术、改善土壤重金属污染状况等方面起着重要作用。
附图说明
图1为镉超积累矿山型东南景天cdna文库的混合质粒电激转化入酵母突变体ycf1后在含15μm·l-1cdcl2的sd-u培养基上菌落的生长情况；
图2为本发明中sactp基因的酵母菌落pcr扩增电泳图；
图3为t-easy-sactp在大肠杆菌中的pcr扩增电泳图；
图4为转基因拟南芥t3代种子和野生型拟南芥种子在1/2ms固体培养基上培育十天后的表型对比图；其中，图4a为不含镉的对照组，图4b为含有100umcdcl2的胁迫组；
图5为转基因拟南芥t3代种子和野生型拟南芥种子在1/2ms固体培养基上培育十天后的根长和平均鲜重对比图；其中，图5a为培育十天后的根长对比图，图5b为5棵幼苗平均鲜重对比图；
图6为移栽后野生型拟南芥植株和超表达sactp的转基因拟南芥植株的表型对比图；其中图6a为未经cdcl2胁迫处理的拟南芥植株，作为对照；图6b为0.5mmcdcl2胁迫2周时的拟南芥植株；
图7为转基因拟南芥植株和野生型拟南芥植株的金属累积量对比图。
具体实施方式
下面结合附图，进一步阐释本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实验材料和试剂：
（1）菌株与载体：大肠杆菌/酵母穿梭载体pyes2.0g、大肠杆菌/酵母穿梭表达载体pyes2-dest、农杆菌eha105均购自invitrogen公司。大肠杆菌dh5α购自康为世纪生物科技有限公司。t-easy载体购自promega公司。镉敏感型酵母突变体菌株（ycf1）购自euroscarf公司。
（2）酶与试剂盒：totalrnapurificationkit植物组织总rna提取试剂盒购自norgen公司。smarttmcdna文库构建试剂盒购自clontech公司。dna凝胶回收试剂盒、质粒dna小量提取试剂盒均购自axygen生物技术公司。限制性内切酶sfii购自newenglandbiolabs公司。
（3）反应底物：smart™ivoligonucleotide、cdsiii/3'pcrprimer、5'pcrprimer均购自clontech公司。
实施例1
镉超积累矿山型东南景天cdna文库的构建
(1）以筛选出的镉超积累矿山型东南景天（采自浙江省衢州市一个古老的铅锌矿区，后移栽至本实验室）水培苗为材料，经400μm·l-1的氯化镉（cdcl2）胁迫处理后用植物组织总rna提取试剂盒(totalrnapurificationkit)提取镉胁迫下的东南景天叶片总rna，经过寡(dt)—纤维柱过滤得到纯化mrna；
(2）全长cdna的获得
cdna链的合成使用smarttmcdna文库构建试剂盒完成；
cdna第一链的合成：以上述步骤(1)中得到的纯化mrna为模板，smart™ivoligonucleotide(10μm)(序列如seq.id.no.3所示：5’-aagcagtggtatcaacgcagagtggccattacggccggg-3’)和cdsiii/3'pcrprimer(10μm),序列如seq.id.no.4所示：5’-attctagaggccgaggcggccgacatg-d(t)30n-1n-3’(n=a,g,c,ort;n-1=a,g,orc)作为引物，按照试剂盒说明书加样合成cdna第一链；
cdna第二链的合成：以cdna第一链为模板，cdsiii/3'pcrprimer(序列如seq.id.no.4所示)和5'pcrprimer(序列如seq.id.no.5所示：5’-aagcagtggtatcaacgcagagt-3’)作为引物，按照试剂盒说明书依次加入缓冲液（buffer）、dntpmix、polymerasemix和双蒸水，在pcr仪上合成得到全长cdna。
pcr反应程序：95℃→1min；（95℃→15sec；68℃→6min）×20个循环。
(3）构建cdna文库
用sfii酶分别对大肠杆菌/酵母穿梭载体pyes2.0g和上述步骤（2）得到的全长cdna进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物并用dna凝胶回收试剂盒回收大于500bp的条带；
将大肠杆菌/酵母穿梭载体pyes2.0g酶切回收产物与大于500bp的全长cdna酶切产物于16℃过夜连接；将连接产物通过电激转化法转入大肠杆菌dh5α中，电激转化产物涂于含有氨苄青霉素抗性的lb培养基上37℃过夜倒置培养，随机挑选长出的单克隆分别以t7（序列如seq.id.no.6所示：5’-taatacgactcactataggg-3’），pyes2-r（序列如seq.id.no.7所示：5’-tcggttagagcggatgtg-3’）引物检测进行pcr鉴定。
实施例2
耐镉转化子的筛选及鉴定
（1）提取实施例1中得到的镉超积累矿山型东南景天cdna文库的混合质粒，电激转化镉敏感型酵母突变体（ycf1）：
使用质粒dna小量提取试剂盒提取cdna文库混合质粒，将提取的混合质粒电激转化至ycf1菌株中，电激转化所用电压1.5v；转化产物涂板至含15μm·l-1cdcl2的sg-u平板上；于28℃倒置培养3天，如图1可见酵母菌落大小均匀、生长良好。
（2）进行ta克隆并测序获得插入片段序列信息：
分别对实施例2中步骤（1）得到的酵母菌落进行pcr鉴定，用琼脂糖凝胶电泳分离并观察sactp基因目的片段条带，pcr所用引物为t7（如seq.id.no.6所示）和pyes2-r（如seq.id.no.7所示）。如图2所示，图中m为dna分子量标准；1代表以t7为引物检测sactp基因的酵母菌落的pcr产物、2代表以pyes2-r为引物检测sactp基因的酵母菌落的pcr产物；使用dna凝胶回收试剂盒回收sactp基因酵母转化子菌落的pcr条带。通过ta克隆技术连接pcr回收产物与t-easy载体，经过热激法转入大肠杆菌dh5α，并涂板至含氨苄青霉素抗性的lb培养基上于37℃倒置过夜培养。挑取单克隆进行t-easy-sactp在大肠杆菌中pcr检测，电泳结果如图3所示，图中m为dna分子量标准，1-3分别代表m13f/m13r为引物检测t-easy-sactp在大肠杆菌中的pcr产物。
将菌液送去上海生工生物工程有限公司测序，经过序列拼接获得序列表中的序列seq.id.no.1。根据测序得到的sactp基因的开放阅读框（orf），推算出基因编码蛋白的氨基酸序列seq.id.no.2。pcr及测序引物为t-easy载体通用引物m13-f（如seq.id.no.8所示：5’-tgtaaaacgacggccagt-3’）和m13-r（如seq.id.no.9所示：5’-caggaaacagctatgacc-3’）。
实施例3
酵母点板实验验证sactp基因镉抗性
根据测序得到的sactp基因的开放阅读框（orf）序列分别设计引物ng3-f1（如seq.id.no.10所示：atggcttccggcacgttctt）和ng3-r1（如seq.id.no.11所示：tcaagcgacttgaattgtatc），从cdna文库中克隆得到sactp基因编码序列；
通过gateway技术将sactp基因插入至大肠杆菌/酵母穿梭表达载体pyes2-dest获得含sactp基因的表达载体pyes2-sactp。
pyes2-sactp酵母表达载体质粒与pyes2-dest空载体质粒分别电激转化至镉敏感型酵母突变体ycf1菌株中，将获得的酵母转化子及空载体于sd-u平板划线培养3天。
挑选单菌落，振荡培养至od600为1.0时依次稀释10倍并分别在不含镉、含15μm·l-1和30μm·l-1cdcl2的sg-u平板上进行点板实验，验证耐镉功能。结果发现，在不加镉的培养基上，酵母的菌落大小和数量基本一致，说明含有空表达载体和sactp基因表达载体的酵母长势基本一致，其生长状况也较为一致；在15μm·l-1和30μm·l-1镉处理时，两种酵母的生长均受到一定程度的抑制，但空载酵母转化子比表达sactp基因的酵母转化子受抑制情况严重。结果表明，在镉处理条件下，sactp基因可以显著提高镉敏感型酵母突变体ycf1的耐镉性，证实sactp基因的异源表达可以发挥其提高镉抗性及镉离子含量的作用。
实施例4：
转基因拟南芥幼苗镉胁迫实验验证sactp基因异源表达提高拟南芥镉抗性
设计正向引物（引物序列如seq.id.no.12所示：caccatggcttccggcacgttctt）和反向引物（引物序列如seq.id.no.13所示：tcaagcgacttgaattgtatc），pcr扩增出cdna片段sactp基因全编码序列。利用gateway方法将sactp基因插入到植物表达载体ph2gw7.0，获得含sactp基因的表达载体ph2gw7.0-sactp。
将ph2gw7.0-sactp以电激方法转入农杆菌eha105，获得农杆菌工程细胞系；采用花序侵染法进行拟南芥转化，将侵染后的拟南芥平躺放至避光的塑料盆中，喷上少量水后盖上保鲜膜以防止水分蒸发，在保鲜膜上盖上报纸以保持黑暗环境，培养16-24h后，揭去保鲜膜，并拿出拟南芥，继续放在拟南芥室中培养；待拟南芥成熟后收取种子，干燥后于4℃保存备用。
将干燥后的t0代种子在在超净工作台上经过75%的乙醇消毒，均匀地撒在含潮霉素（hyg）20mg·l-1的1/2ms固体培养基上；4℃环境下暗培养2天，随后将培养皿转移至拟南芥室中培养，培养一周左右；随后将可以正常生长的具有hyg抗性的拟南芥植株转移至营养土中，并在拟南芥室中培养。经pcr和rt-qpcr检测之后，选取表达量高的阳性植株作为超表达sactp的转基因拟南芥植株株系，逐代培养直至收获t3代纯合体种子并于-4℃保存，用于后面的生物学功能分析。
将获得的超表达sactp的转基因拟南芥t3代种子（oe1、oe2和oe3）和野生型拟南芥种子（wt）用灭菌牙签播种在含有100umcdcl2的1/2ms固体培养基上，同时将生长在不含镉的1/2ms固体培养基的超表达sactp的转基因拟南芥t3代种子（oe1、oe2和oe3）和野生型拟南芥种子（wt）作为对照，10天后进行观察，如图4所示，生长在不含镉的1/2ms固体培养基的野生型拟南芥和超表达sactp的转基因拟南芥均正常生长，未有明显差异，而在含有100umcdcl2的1/2ms固体培养基上的野生型拟南芥植株生长明显受到抑制。
如图5a所示，在未胁迫状态下，拟南芥植株根长均在4.5cm左右，在重金属镉胁迫后，野生型拟南芥植株根长在0.8cm左右，而超表达sactp的转基因拟南芥的根长尽管生长也受到抑制，但是其根茎长度明显长于野生型拟南芥，oe-1、oe-2、oe-3三个株系的统计根长平均值为1.47cm，1.55cm,1.40cm。如图5b所示，通过生物量的测量也表明超表达sactp的转基因拟南芥镉胁迫后三个株系的5棵幼苗平均鲜重为17.87mg，18.72mg,16.04mg，而野生型为12.23mg,显著高于野生型株系。幼苗胁迫实验表明转基因拟南芥的幼苗对镉胁迫的耐受性高于野生型，sactp的超表达可以显著提高转基因拟南芥的镉抗性。
按照上述方法培养的野生型拟南芥wt和超表达sactp的转基因拟南芥株系oe1、oe2和oe3，移栽后30天左右，选取生长状态一致的野生型和转基因拟南芥开始用含0.5mmcdcl2的水溶液浇透拟南芥，待土壤干燥后用同样的溶液进行浇透，处理时间为2周，以未经cdcl2胁迫处理的拟南芥作为对照。如图6所示，镉胁迫2周期间对野生型和转基因拟南芥植株的表型差异进行观察发现，在受到镉胁迫之后，野生型和转基因拟南芥植株都能够生长，胁迫初始表型差异不太明显；但随着时间的延长，野生型拟南芥的叶片的颜色开始变深，逐渐变为紫色，而转基因拟南芥的外轮叶片外围出现微弱黄化，叶片紫化不明显。因此从表型上推测野生型拟南芥对镉的耐性较差。
分离并获取不同处理时间的野生型和转基因拟南芥植株的地上部位，用双蒸水清洗三遍；将所有样品放至105℃烘箱中干燥30min后80℃直至样品彻底烘干至恒重。高含量的镉元素采用火焰原子吸收光度法测定，而低含量的镉元素采用石墨炉原子吸收光度法测定。通过上机浓度、称样量和定容体积计算植物组织中的镉含量。结果如图7所示，在未受镉处理时，在野生型和转基因拟南芥中基本检测不到镉含量；0.5mmcd处理2w后，野生型拟南芥株系的镉含量为50.17µg/gfw，三个转基因株系的镉含量分别为82.56µg/gfw,71.96µg/gfw,60.33µg/gfw,结果表明，超表达sactp基因后可以提高转基因拟南芥对镉的含量而维持较为正常的生长状态。
sactp基因编码序列如seq.id.no.1所示：
atggcttccggcacgttcttctatgcagagtgcgatgatcgttgcactcttgtatcaaaatcgccttgtaaagagtcttgctttatgtgcgagaagccgcttggattcagcgctgatatattcatgtacatggggaatacaccgttttgtagcacggagtgtagacaagagcagattgaaatggacgatgcggaggagaggaggaagaggaagaaatccgcgctgagggctaaggcggagacagcaagatcgacggccgggggtaaatcggtcaggacggatacaattcaagtcgcttga。
sactp氨基酸序列如seq.id.no.2所示：
masgtffyaecddrctlvskspckescfmcekplgfsadifmymgntpfcstecrqeqiemddaeerrkrkksalrakaetarstaggksvrtdtiqva。
序列表
<110>中国林业科学研究院亚热带林业研究所
<120>一种提高镉抗性及镉含量的基因及其用途
<160>13
<170>siposequencelisting1.0
<210>14
<211>300
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>14
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