大麦α-淀粉酶及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及花粉特异性表达α-淀粉酶，其可导致花粉败育，并且利用现代生物技术，应用于杂交种子生产技术体系，保证制种质量，提高制种效率，也可应用于防止转基因扩散。

背景技术：

植物杂种优势利用是最为经济有效的提高粮食产量的途径之一，虽然几乎所有的农作物都尽可能利用杂种优势，但仍存在一些限制因素，例如选育优良组合难度较大，杂交制种成本高、风险高等特点，导致杂交作物所占的比重仍较小，主要农作物中尤以水稻为甚，其杂种优势商业化应用主要通过上世纪研发的“三系法”到“两系法”育制种路线，尽管“两系法”克服了“三系法”的种质资源利用率低、不育系培育难度大时间长、病害风险高等缺陷，提高了配组自由度，提高了水稻杂种优势利用效率，但“两系法”的温敏不育系易受温度影响，从而易造成大面积制种失败，损失严重，至今不能完全替代“三系法”。“三系法”和“两系法”的上述缺陷仍然是制约水稻杂种优势利用的关键环节，因此，研究人员努力开发新方法提高农作物的杂种优势利用效率，其中创制优良不育系是核心。

植物雄性不育主要体现在花粉败育，它涉及到花器官中雄蕊的发生与发育、绒毡层结构、小孢子形成、花药开裂以及外部生态环境等众多环节或因素，其中花粉发育涉及到众多基因的表达调控，弄清其全过程和分子机理是研究植物雄性不育的基础和关键所在。上世纪90年代初，mariani等人利用来自烟草的花药绒毡层的特异启动子(ta29)和核糖核酸酶基因(barnase)重组表达盒转化烟草和油菜，并成功获得雄性不育系，开创了人工制备雄性不育系的新途径(denism,delourmer,gourretjp,etal.expressionofengineerednuclearmalesterilityinbrassicanapus(genetics,morphology,cytology,andsensitivitytotemperature)[j].plantphysiology,1993,101(4):1295-1304.)。表明利用其他功能基因通过基因工程方法创制转基因雄性不育植株具备可行性。

在花粉发育后期会在花粉粒中合成淀粉，为花粉萌发和花粉管延伸储备能量。因此，若花粉粒中的淀粉提前被降解，瓦解其能量来源，从而阻碍花粉正常发育及遏制花粉管的萌发与伸长，使其无法完成受精过程，将会导致植物雄性不育。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，在动植物、细菌和真菌中普遍存在。研究人员通过利用基因工程技术，获得了各种淀粉酶基因的cdna序列(崔锦,马向东(2009)淀粉酶基因的多样性.郑州牧业工程高等专科学校学报,29(2):21-23)。对其多样性研究表明，除来源多样性外，其基因结构和功能方面皆呈现多样性。根据其对淀粉的作用方式不同分为α-淀粉酶，β-淀粉酶，γ-淀粉酶和异淀粉酶等。其中α-淀粉酶属于内切型淀粉酶，可从淀粉分子的内部随机切割α-1，4糖苷键，使淀粉水解成麦芽糖、葡萄糖等，释放能量(maarel,m.j.e.c.v.d.,veen,b.v.d.,uitdehaag,j.c.m.,leemhuis,h.,&dijkhuizen,l.propertiesandapplicationsofstarch-convertingenzymesofthe-amylasefamily.journalofbiotechnology,2002,94(2).doi:10.1016/s0168-1656(01)00407-2)。在成熟花粉中，适量的淀粉酶可水解淀粉，为花粉的正常发育和花粉管的萌发、生长提供能量。相反，若在花粉形成过程中淀粉酶过表达和沉默表达，都会降低花粉能量代谢水平，导致淀粉积累量不足，产生败育花粉。

因此，本发明通过基因工程手段，特异性地调控淀粉酶的时空表达，获得转基因花粉败育植株，实现非转基因不育系的繁育及非转基因杂交种的生产，特别是在控制育性和转基因漂移等方面提供了新的选择。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种大麦α淀粉酶在导致花粉败育及制备转基因花粉败育植株中的应用。

为了达到以上目的，本发明提供的大麦α-淀粉酶，其氨基酸序列为：

a)seqidno.6所示的氨基酸序列；或

b)seqidno.6所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明提供了编码大麦α-淀粉酶的基因，是如下：

1)seqidno.1所示的核苷酸序，或

2)在seqidno.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与seqidno.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有80％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用与植物花粉败育基因α-淀粉酶核苷酸序列互补的dna分子，因此，具有启动子活性并在严格条件下与本发明败育基因α-淀粉酶序列或其片段杂交的分离序列包括在本发明中。

其中，所述核苷酸序列互补，是指在严格条件下能与α-淀粉酶杂交。

严格条件是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度短于大约1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。

典型地，严格条件是在ph值7.0-8.3下盐浓度低于大约1.5mna离子，典型地大约0.01-1.0mna离子浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10-50个核苷酸)至少大约30℃，对长探针(如超过50个核苷酸)至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低严格条件，例如，包括在30-35％甲酰胺、1mnacl、l％sds(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液中37℃杂交，在1×至2×ssc(20×ssc＝3.0mnacl/0.3m柠檬酸三钠)中50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45％甲酰胺、1.0mnacl、l％sds的缓冲溶液中37℃杂交，在0.5×至1×ssc中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50％甲酰胺、1mnacl、l％sds的缓冲溶液中37℃杂交，在0.1×ssc中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1％-1％的sds。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4-12小时。

特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于dna-dna杂交体，tm可以从meinkoth和wahl(1984)anal.biochem.138:267-284的方程估算:tm＝81.5℃+16.6(logm)+0.41(％gc)-0.61(％form)-500/l；其中m是单价阳离子的摩尔浓度，％gc是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在dna中的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，l是杂交体在碱基对中的长度。tm是50％互补靶序列与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和ph下)。每1％的错配需tm降低大约l℃；因此，tm杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥90％的同一性，tm可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(tm)大约5℃，且其在规定的离子强度和ph下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度(tm)1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度(tm)6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度(tm)11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。应用此方程、杂交和洗涤组合物和所需的tm，本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格度的变化而变化。如果所需的错配程度使tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加ssc浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于tijssen(1993)生物化学和分子生物学实验室技术应用核酸探针杂交，第i部分，第2章(elsevier，newyork)；和ausubel等人编辑(1995)分子生物学现代方法第2章(greenepublishingandwiley-interscience,newyork)。见sambrook等人(1989)分子克隆:实验室手册(第二版，coldspringharborlaboratorypress,plainview,newyork)。

所述严格条件优选为在6×ssc(柠檬酸钠)、0.5％sds(十二烷基磺酸钠)的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc、0.1％sds和1×ssc、0.1％sds各洗膜1次。

本发明提供了含有编码上述大麦α-淀粉酶基因的生物材料，其为重组表达载体、表达盒、重组菌或宿主细胞。

本发明提供的上述生物材料还含有转导肽和雄性配子优先型启动子。

进一步地，本发明提供的表达盒含有seqidno.1-3，或1，2，4或1，2，5所示的dna片段。

其中，seqidno.1所示的序列长度为1281bp的是大麦花粉败育基因α-淀粉酶正向dna片段；seqidno.2所示的序列长度为216bp的转导肽；seqidno.3所示的序列长度为2737bp的雄性配子优先型启动子pg47,seqidno.4所示的序列长度为2038bp的雄性配子优先型启动子pc32,seqidno.5所示的序列长度为1960bp的雄性配子优先型启动子pchf15。

本发明含有上述大麦α-淀粉酶重组表达载体可通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织获得独立的转基因细胞或组织，获得含转基因成分的花粉败育的转基因株系。

本发明提供了上述大麦α-淀粉酶或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在降解植物花粉中淀粉或扰乱植物花粉发育中的应用。

本发明提供了上述大麦α-淀粉酶或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在诱导植物雄性不育中的应用。

本发明提供了上述大麦α-淀粉酶或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在制备花粉败育转基因植株中的应用。

所述转基因植物为外源基因在花粉中特异表达的转基因植物，优选为授粉/受精能力增强/削弱的转基因植物，更优选为雄性不育转基因植物。

本发明提供了上述大麦α-淀粉酶或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在作物育种中的应用。

本发明提供了一种降解植物花粉中淀粉，从而阻止外源基因扩散的方法，将含有大麦α淀粉酶基因的表达盒导入植物中获得转基因花粉败育的转基因植株，使转基因植株花粉无法正常授粉，从而阻止植物花粉中外源基因扩散。

本发明提供了一种利用含有大麦α-淀粉酶基因的转基因植株生产非转基因种子的方法，是将含有大麦α-淀粉酶基因的转基因植株作为杂交作物中保持系授粉给植物雄性不育系，不育系结实收获种子，该种子为非转基因种子，实现不育系繁育或杂交种制种。

所述的大麦α淀粉酶基因的核苷酸序列为：

1)seqidno.1所示的核苷酸序列，或

2)在seqidno.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与seqidno.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

所述的植物为禾本科、豆科、锦葵科、十字花科植物。所述植物包括而不限于水稻、玉米、高梁、大麦、燕麦、小麦、粟、甘蔗、大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵。

本发明的有益效果在于：

(1)花粉败育基因α-淀粉酶分离自大麦，对水稻、玉米、小麦等基因工程十分有利，同时作为大麦的内源基因，对大麦的基因工程更是影响巨大。

(2)大麦α-淀粉酶花粉粒碘染实验表明，α-淀粉酶能在启动子pg47驱动下，能精确地作用于花粉粒，使得可育花粉和败育花粉的比例符合为1:1。

(3)本发明植物α-淀粉酶基因表达调控精确，可控制转基因扩散；可用于雄性不育系的保持和繁殖，同时在杂交制种过程中省去人工去雄步骤，应用前景广阔。

附图说明

图1是实施例2中花粉败育基因大麦α-淀粉酶hvaa1的重组表达载体dx2182-hvaa1构建流程图。

图2是实施例4中水稻花粉碘染照片。wt：野生型水稻中花11花粉碘染；hvaa1败育基因：转大麦α-淀粉酶水稻株系花粉碘染。

图3是实施例5中dx2182-hvaa1转基因水稻自交种子潮霉素筛选结果。zh11：非转基因对照；14-2(t1),40-2(t1)：均为转大麦α-淀粉酶水稻株系t1代；1/2ms：生根培养基；1/2ms+hn：生根培养基中添加筛选剂潮霉素。

图4是实施例6中dx2182-hvaa1转基因水稻杂交种子潮霉素筛选28d结果。zh11：非转基因对照；14-2(t2),40-2(t2)：均为转大麦α-淀粉酶水稻株系t2代；14-2*1907，40-2*1907：转大麦α-淀粉酶水稻株系t2代14-2、40-2授粉给非转基因水稻材料1907所获杂交种；1/2ms：生根培养基；1/2ms+hn：生根培养基中添加筛选剂潮霉素。

图5是实施例6中dx2182-hvaa1转基因水稻株系授粉获得杂交种转基因成分pcr检测电泳图。ck-：非转基因对照中花11；ck+：dx2182-hvaa1载体；1-10：随机挑选杂交种幼苗。hn：潮霉素引物(seqidno:11-12)，p1：跨pg47启动子与hvaa1引物(seqidno:13-14)，p2：跨hvaa1和终止子引物(seqidno:15-16)。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。

实施例1大麦α-淀粉酶获取

1、大麦rna的提取

利用biozolreagent方法提取大麦rna：称取0.1g大麦新鲜幼穗组织，加1mlbiozolreagent混匀，室温静置5min；按每1mlbiozolreagent加0.2ml氯仿，用力震荡15s，待溶液充分乳化后，再室温静置5min，12000rpm，4℃离心15min；从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中；向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10min,12000rpm，4℃离心10min；弃上清，管壁可现白色沉淀，加0.5ml75％乙醇(用rnase-free水配置)洗涤，颠倒混匀，10000rpm，4℃离心5min；重复一次，低温干燥，使乙醇挥发；加50μl的rnase-free水溶解沉淀，加入dnasei消化基因组dna，重复氯仿抽提、异丙醇沉淀至加水溶解过程(步骤同前)，置于-80℃保存。

2、大麦cdna合成

以大麦rna为模板，利用逆转录酶m-mlv逆转录，具体方法如下：(1)冰上配置

rna5-10μl

olig(dt)2μl

rnase-freeh2o至14.5μl

混匀

(2)70℃，5分钟，立刻置于冰上，打开二级结构。

(3)加入反转录酶等：

混匀

(4)42℃，延伸90分钟。70℃，15分钟。获得大麦的cdna，分装保存于-40℃。

注：所有实验用品均为rnase-free。

3.大麦α-淀粉酶扩增

通过ncbi数据库获得大麦的α-淀粉酶hvaa1(loc101768040)基因的核苷酸序列(如序列表中seqidno:1所示)，其氨基酸序列(如序列表中seqidno:6所示)。根据序列设计引物(如序列表中seqidno:7-8)，引物设计使用gibsonassembly方法，其中上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与载体相应连接位置重复，以便gibsonassembly连接。以大麦cdna为模板通过pcr扩增获得，扩增体系及程序如下：

pcr程序:预变性94℃3min，变性94℃30s，退火55-65℃40s，延伸68℃1min20s，35个循环，延伸68℃10min。

实施例2花粉败育基因植物双元表达载体dx2182-hvaa1构建

构建流程见图1，将实施例1扩增产物，即引物seqidno:7-8扩增pcr产物1％琼脂糖凝胶电泳回收1300bp左右产物，插入dx2182(已公开于中国专利cn106434673a，发明名称：一种植物花药特异性启动子pchf15及其应用)经mlui和saci的线性酶切载体中。其中dx2182载体已包含了pg47优化型启动子和终止子，并分别位于mlui和saci酶切位点的两侧，因此mlui和saci酶切载体dx2182，回收线性酶切载体，与实施例1扩增的pcr产物按一定的比例连接，最终构建获得包含hvaa1的花粉特异性的表达盒的双元载体。

2x连接试剂盒连接败育基因到dx2182，10μl体系如下：

α-淀粉酶pcr产物(50ng)2.5μ1

酶切载体(100ng)2.5μ1

ligationmix5μ1

连接程序：50℃60分钟。

转化：取上述连接产物2μ1电击转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于含卡那霉素抗性的lb平板，挑选阳性克隆测序，测序正确的重组载体命名为dx2182-hvaa1，其序列如seqidno:9所示。

实施例3hvaa1转基因水稻创制

取-70℃保存的农杆菌eha105于含rif(25μg/ml)+链霉素(50μg/ml)的yep平板划线，28℃培养。挑取单菌落接种于含上述抗生素的50mlyep液体培养基中，220rpm28℃振荡培养12-16h。取2ml菌液转接于100ml(含上述抗生素)yep液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至od600＝0.5。冰上预冷10分钟，5000rpm10min(冷冻离心机预冷到4℃)。无菌去离子水洗2次(每次10ml)，10％甘油洗1次溶于3ml10％甘油中。取100μl感受态细胞加1μl实施例2中得到的dx2182-hvaa1质粒，2.5kv电击转化。在含有卡那霉素、利福平和链霉素的yep培养板上培养，挑选阳性克隆，用dx2182-hvaa1载体特异性引物seqidno:11-12pcr验证。

验证正确的克隆，通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻中花11(hieiyohtas,komarit,kumashirot(1994)efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna.theplantjournal6:271-282)。经共培养、筛选、分化、生根等环节获取t0代转基因幼苗，提取dna，经pcr验证的转基因阳性植株，自交结实获得t1代，取t1植株进行后续分析。其中dx2182-hvaa1载体含有潮霉素抗性基因，其序列如seqidno:10所示，可用潮霉素筛选转基因，获得抗性植株；同时还可筛选转基因后代种子，获得其中抗性植株。

实施例4hvaa1转基因水稻花粉育性分析

配制碘化钾染色液(取2gki溶于5-10ml蒸馏水中，然后加入1gi2(用适量的无水乙醇溶解)，待全部溶解后，再加蒸馏水定容至300ml。贮于棕色瓶中备用，使用时按碘化钾：去离子水＝1:1的比例稀释成碘染工作液)。对hvaa1水稻转基因植株的成熟花粉进行染色镜检分析花粉粒育性，具体步骤如下：

1、花粉采集：取充分成熟将要散粉的花药，剥除颖壳，取出花药，置于载玻片上。

2、镜检：取约70μl的碘染工作液滴于花药上，用镊子将花药充分捣碎，使花粉粒释放，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察。凡被染成蓝黑色的花粉粒为可育花粉粒，呈浅黄色的为败育的花粉粒。

转基因植株的花粉粒经碘化钾染色分析表明可育花粉：败育花粉符合1:1的分离比例，即约50％花粉可染成蓝黑色，表现为正常育性；约50％花粉不能染成蓝黑色，表现为败育花粉(如图2.hvaa1败育基因所示)。而野生型花粉均可染成蓝黑色，是完全可育的(如图2.wt所示)。表明大麦α-淀粉酶能使水稻花粉粒中淀粉降解，使其在发育过程中能量供给不足，导致花粉败育。

实施例5hvaa1转基因水稻自交种子分离筛选

根据遗传规律，若可育花粉：败育花粉符合1:1的分离比例，自交结实种子即是一半为非转基因种子，一半为转基因种子，因此利用潮霉素对hvaa1转基因水稻株系14-2、40-2的t1代种子进行筛选验证，方案如下：

取野生型对照中花11(zh11)、转基因株系14-2和40-2(t1)种子，经次氯酸钠消毒后分别铺种于生根培养基(1/2ms培养基)和添加40mg/l潮霉素(sigma)的生根培养基中进行筛选，14d后观察并统计存活率(如图3)。统计结果显示：在生根培养基中zh11能正常生根发芽，存活率为96.00％，14-2和40-2也能正常生根发芽，存活率达到90.00％以上；在潮霉素筛选下zh11完全被抑制，而14-2株系自交种子部分可以正常生根发芽，存活率为49.00％，40-2株系与14-2株系类似，存活率为52.50％，分离比符合1:1(见表1)。

表1hvaa1转基因水稻自交种子筛选分离比

实施例6转基因花粉逃逸率检测

为进一步检测hvaa1导致的花粉败育效率，检测其转基因花粉是否逃逸，本实施例通过hvaa1转基因水稻株系授粉给非转基因水稻材料，收获杂交种子，经潮霉素筛选检测(方法同实施例5)是否有杂交种子具备潮霉素抗性，若是，则有转基因花粉逃逸；若无，则表明hvaa1工作效率良好，可防止转基因逃逸。

转基因株系授粉给不育系1907(14-2×1907和40-2×1907)，分别获得117、92粒杂交种子，用潮霉素筛选杂交种子，14d后观察发现，杂交种子发芽势较强，有一部分长成苗，但继续筛选培养至28天左右时，幼苗逐渐枯黄死亡，但14-2和40-2自交种子中具备抗性的植株可存活并长成植株(如图4)。因此28d统计存活率显示：在生根培养基中zh11能正常生根发芽，存活率96.00％，14-2和40-2也能正常生根发芽，存活率达到90.00％以上,`14-2×1907和40-2×1907的杂交种子因杂交优势，发芽率(存活率)也较高；在潮霉素筛选下zh11完全被抑制，而14-2自交种子存活率47.5％，40-2的存活率51％，分离比符合1:1(见表2)，而14-2×1907和40-2×1907的杂交种子均被抑制，无法存活。

表2转基因花粉逃逸率检测

为进一步检测杂交种子发芽幼苗为非转基因幼苗，随机选取部分杂交种幼苗，提取基因组dna，利用3对特异性引物,进行pcr扩增鉴定是否存在转基因元件，结果表明杂交种子幼苗未能扩出转基因区段条带，与阴性对照一致(如图5)，进一步表明没有转基因元件逃逸。

由此证明本发明的大麦α-淀粉酶基因能够降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉败育，可有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其他作物品种。

综上所述，本发明中影响植物雄性生育力α-淀粉酶来自大麦，为首次克隆，并且能够降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉不育，准确性高，效率好，有效阻止转基因作物花粉逃逸；可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态；同时省去了杂交制种过程中人工去雄的步骤，具备较高的实用价值。

序列表

<110>海南波莲水稻基因科技有限公司

<120>大麦α-淀粉酶及其编码基因与应用

<130>khp181114257.0

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1281

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gcgtccggccaccaagtcctctttcaggggttcaactgggagtcgtggaagcagagcggc60

gggtggtacaacatgatgatgggcaaggtcgacgacatcgccgctgccggagtcacccac120

gtctggctgccaccgccgtcgcactccgtctccaacgaaggttacatgcctggtcggctg180

tacgacatcgacgcgtccaagtacggcaacgcggcggagctcaagtcgctcatcggcgcg240

ctccacggcaagggcgtgcaggccatcgccgacatcgtcatcaaccaccgctgcgccgac300

tacaaggatagccgcggcatctactgcatcttcgagggcggcacctccgacggccgcctc360

gactggggcccccacatgatctgtcgcgacgacaccaaatactccgatggcaccgcaaac420

ctcgacaccggagccgacttcgccgccgcgcccgacatcgaccacctcaacgaccgggtc480

cagcgcgagctcaaggagtggctcctctggctcaagagcgacctcggcttcgacgcgtgg540

cgccttgacttcgctaggggctactcgccggagatggccaaggtgtacatcgacggcaca600

tccccgagcctcgccgtggccgaggtgtgggacaatatggccaccggcggcgacggcaag660

cccaactacgaccaggacgcgcaccggcagaatctggtgaactgggtggacaaggtgggc720

ggcgcggcctcggcaggcatggtgttcgacttcacgaccaaagggatactgaacgctgcc780

gtggagggcgagctgtggaggctgatcgacccgcaggggaaggcccccggcgtgatggga840

tggtggccggccaaggccgccaccttcgtcgacaaccacgatacaggctccacgcaggcc900

atgtggccattcccctccgacaaggtcatgcagggctacgcgtacatcctcacccacccc960

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