曼氏无针乌贼神经肽sCAP及其用途的制作方法

本发明涉及神经肽
技术领域：
，尤其是涉及曼氏无针乌贼神经肽scap及其用途。技术背景头足类属于软体动物，是海洋生态系统中的重要组成部分，同时对海洋生态平衡有着不可或缺的作用。神经肽是由神经系统内分泌组织分泌出来的小分子多肽，存在于各种动物体内，在生物体内的神经调节、发育、生殖等生理活动中扮演不可或缺的角色。随着分子克隆和免疫组化等实验技方法术的不断成熟，针对神经肽作用机制的研究也不断深入。截至目前已在头足类动物体内发现七种神经肽，其中心激肽对头足类的生殖调控具有重要的意义。心激肽scap首次是在长腕小章鱼(octopusminor)的脑组织中提取到的，得到了4种章鱼心激肽(octopuscardioactivepeptides，scap)，分别是ocp-1、ocp-2、ocp-3以及ocp-4，但没有对这4种多肽在体内的分布进行定位，据推测ocp-1和ocp-2可能是编码非洲大蜗牛(achatinafulica)achatin-ⅰ的相关基因的产物。kanda等人通过对真蛸的研究，发现了存在于该物种体内的一种scap类似物即oct-scprp。ncbi中包含真蛸oct-scprp(ab198190.1)和商乌贼scap(jx459945.1)基因序列信息。乌贼属于软体动物头足纲(cephalopoda)、蛸亚纲(coleoidea)、新蛸亚纲(neocoleoidea)、十腕总目(decapodiformes)、乌贼目(sepiida)、乌贼科(sepiidae)，广泛分布在各个海域，在生物系统演化中占有重要的地位。其肉质鲜美可口，具有很好的营养价值，蛋白含量极高。除了可以食用以外，还有很高的药用价值，墨囊可以促进血液凝固并且具有抑菌功能，海螵蛸可以药用，耳石可用来分析物种的年龄和海洋环境的时空变化。另外，乌贼还是海洋生态系统中十分重要的生物因子，在生态系统的食物链中扮演着十分重要的角色，对维持海洋生态系的生态平衡起着非常重要的作用。近年来，乌贼作为重要的经济头足类在海洋生态系统中起着关键的作用。但在上世纪70年代开始，由于过度捕捞和环境的变化乌贼资源衰退严重。基于此，我们的研究小组从2003至2008开始进行资源恢复工作，目前我们已掌握人工养殖乌贼的技术，可进行乌贼的繁育养殖工作。但是随之伴随的问题是，人工养殖的乌贼其性成熟期明显比野生乌贼要早。这一现象表明，经人工繁育的乌贼存在着“性早熟”的问题。郑小东等也报道了这一现象，他们发现一般在自然环境下，曼氏无针乌贼(sepiellajaponica)最少需要六至八个月才会到达性成熟时期，然在人工繁育养殖条件下的乌贼，仅仅需要不到4个月就到达性成熟时期，由于生长周期的缩短，人工繁育下的乌贼个体比野生乌贼要小很多，这一现象并不利于乌贼的人工养殖，严重影响养殖效益。因此，为解决这一棘手问题，开展与生殖发育相关的神经肽研究就显得尤为重要。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供通过rt-pcr以及race技术对曼氏无针乌贼scap基因进行克隆得到的曼氏无针乌贼神经肽scap，该肽属于细胞内分泌的蛋白，由细胞内分泌到细胞外发挥作用，通过中枢神经系统来控制乌贼活动。本发明的第二个目的是提供上述曼氏无针乌贼神经肽scap的用途，即在头足类养殖过程中进行生殖调控的用途。本发明针对
背景技术：
：中提到的问题，采取的技术方案为：曼氏无针乌贼神经肽scap，曼氏无针乌贼神经肽scap通过rt-pcr以及race技术对曼氏无针乌贼scap基因进行克隆得到；曼氏无针乌贼神经肽scap基因cdna全长696bp，具体为：gcacttgcattcttcctatttttttggaaagccgaaaaagacaccgttagcgaaatcagaaaactcacacacaccttgcttcaatctcgagccattctgcaaatatcaacaatgttctctcaaaatctgtctgtccttgccttctcagtctgcattcttcttactatggctaatacaagttatggctatctggtgttgccccgccagggtcgatctgatgaccgggcagaaccatcatgttgcggaatgccactaatgaaggctacaggcctttgcccaatcggaatggaatgctgcccaggtctgaagaaagttttacaaaaatccggacagaaaacagtttactctatctgtattgcggatctctactgaacaaaccaatcctgtgctacttcccaaattccagaatggaggttgcgatcctctgtgcaaggaaatgagacaaggagaaagagtaatgaattctttcttacttcttgaatgtggacgacgaatcgatcagaaagggattgttatgagatgagaaatcaaagaacattaaaatatatatatatataaataaataaaacacactatgaaacgaatgtttacaaaagttgatagatttaagcatgtttgtatcattcttacggtctaataaacaattatgaatggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。曼氏无针乌贼心激肽scap在视叶中的表达量最多，其次是脑组织，其他组织都有微量表达，心组织中表达量最少，通过中枢神经系统来控制乌贼活动，具有刺激心脏运动、控制肌肉收缩、刺激输卵管收缩、参与取食行为、增强后肠收缩、调节包括视觉和嗅觉在内的各种神经系统等功能。作为优选，scap基因包括111bp的5’非编码区序列以及324bp的3’非编码区序列；所述scap基因预测的开放阅读框共261bp，预测编码86个氨基酸。作为优选，scap编码的蛋白质相对分子质量9.331kda，等电点8.52，包括8个碱性氨基酸，5个酸性氨基酸，原子总数为1308。作为优选，scap具有成熟信号肽。进一步优选，信号肽位于1号及25号氨基酸之间，在25与26号氨基酸之间发生剪切。作为优选，scap有明显的跨膜区。据此我们可知道scap属于细胞内分泌的蛋白，由细胞内分泌到细胞外发挥作用。作为优选，scap中含有28个亲水性氨基酸，58个疏水性氨基酸，为亲水性蛋白。疏水性是氨基酸的一种重要性质，疏水性的氨基酸倾向于远离周围水分子，将自己包埋进蛋白质的内部，但scap则相反。作为优选，scap二级结构中含有17％螺旋结构、20％折叠结构、14％转角结构以及49％的无规则卷曲结构。通过疏水氨基酸出现的周期性预测scap蛋白质的二级结构，利用各种氨基酸的疏水值定位蛋白质的疏水区域，α螺旋中亲疏水氨基酸残基的出现位置也就有一定的规律性，亲水残基多出现在亲水侧面，而疏水残基则多出现在疏水侧面，反映在序列上就是一些特征的亲疏水残基间隔模式。作为优选，对所述曼氏无针乌贼scap前体蛋白进行保守性分析，发现曼氏无针乌贼scap基因与商乌贼相似性达到90％。其次是真蛸和加州双斑蛸，并与海兔以及太平洋牡蛎汇聚为一大支，而与果蝇属drosophilaficusphila(xp017052809.1)、drosophilabipectinata(xp017102156.1)、drosophilaeugracilis(xp017082748.1)、drosophilamiranda(xp017143023.1)、drosophilamelanogaster(np001262846.1)、drosophilasuzukii(xp016924913.1)、drosophilaelegans(xp017114485.1)、drosophilabusckii(xp017845032.1)、drosophilabiarmipes(xp016959934.1)、drosophilarhopaloa(xp016974476.1)、drosophilatakahashii(xp0170003765.1)的进化关系最远，说明曼氏无针乌贼scap基因的结构进化十分保守。scap基因通过中枢神经系统来控制乌贼活动的。通过scap基因的组织表达特异性分析发现，它在雄性个体的视叶中表达量最高，其次就是脑组织，其他组织中都有微量表达，但是在肌肉中最少。在雌性个体中也是视叶的表达量最高，其次是脑组织，其他各组织也都有表达，但是心脏最少，由此可以看出sj-scap不像正常所理解的那样是在心脏中发生作用的，而是通过中枢神经系统来控制乌贼活动的，此外原位杂交结果显示曼氏无针乌贼心激肽scap在视叶中杂交信号，在脑组织中也存在杂交信号。本发明还公开了上述曼氏无针乌贼神经肽scap的用途，曼氏无针乌贼神经肽scap在头足类养殖过程中进行生殖调控的用途。曼氏无针乌贼心激肽scap通过中枢神经系统来控制乌贼活动，具有刺激心脏运动、控制肌肉收缩、刺激输卵管收缩、参与取食行为、增强后肠收缩、调节包括视觉和嗅觉在内的各种神经系统等功能，进而对头足类的生殖进行调控，降低头足类增养殖过程中存在着养殖个体性早熟等问题的发生，为头足类的人工养殖和增殖放流做贡献。与现有技术相比，本发明的优点在于：1)本发明首次通过rt-pcr以及race技术对曼氏无针乌贼scap基因进行克隆，得到了总长度为696bp的cdna序列，包括111bp的5’非编码区序列以及324bp的3’非编码区序列，预测的开放阅读框共261bp，预测编码86个氨基酸，相对分子量为9.331kda，等电点8.52。信号肽以及跨膜区预测结果显示，scap中含有明显的信号肽序列，属于细胞内分泌的蛋白，由细胞内分泌到细胞外发挥作用；2)本发明曼氏无针乌贼心激肽scap通过中枢神经系统来控制乌贼活动，具有刺激心脏运动、控制肌肉收缩、刺激输卵管收缩、参与取食行为、增强后肠收缩、调节包括视觉和嗅觉在内的各种神经系统等功能，进而对头足类的生殖进行调控，降低头足类增养殖过程中存在着养殖个体性早熟等问题的发生，为头足类的人工养殖和增殖放流做贡献。附图说明图1是本发明实施例1中曼氏无针乌贼总rna提取电泳图；图2是本发明实施例1中scap基因pcr电泳结果；图3是本发明实施例1中5′race扩增电泳条带；图4是本发明实施例1中3′race扩增电泳条带；图5是本发明实施例1中scap基因cdna全长；图6是本发明实施例1中scap信号肽预测结果；图7是本发明实施例1中scap跨膜区预测结果；图8是本发明实施例1中scap蛋白的二级结构预测；图9是本发明实施例1中scap基因氨基酸序列同源比对；图10是本发明实施例1中基于scap同源氨基酸序列构建的进化树；图11是本发明实施例3中雄性曼氏无针乌贼scap不同组织表达特异性；图12是本发明实施例3中雌性曼氏无针乌贼scap不同组织表达特异性；图13是本发明实施例4中较为强烈的阳性杂交信号。具体实施方式下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1：曼氏无针乌贼神经肽scap，曼氏无针乌贼神经肽scap是通过rt-pcr以及race技术对曼氏无针乌贼scap基因进行克隆得到，其具体步骤为：1)从浙江温州苍南基地头足类苗种繁育基地取样，选择健康、活力强的曼氏无针乌贼，在基地活体解剖后取出组织放在rna保存液中保存，用干冰运回，把样品放置-80度冰箱；2)总rna的提取：①取无rna酶的2mlep管，用的枪头加入500ultrizol，用酒精泡过的镊子夹取脑组织样品溶于trizol液体中，电动匀浆器研磨直到组织完全溶解于液体中，补满trizol到1ml，4℃，12000rpm，10min离心；②取上清液放进1.5mlep管中，不能吸到杂质；③加入200ul的氯仿，剧烈震荡，室温静置5分钟，4℃，12000rpm，15min离心；④取三层中的最上层液体到新的1.5mlep管中，加入500ul异丙醇，室温10min或-20℃过夜；⑤4℃，12000rpm，10min离心，除去上清液，看到白色片状物即rna；⑥加入1ml的75％的乙醇，吹吸混匀，静置5min；⑦4℃，7500rpm，5min离心，除去上清液，通风橱干燥10min；⑧加入20uldepc水，4℃过夜或-20℃保存；⑨rna质量的检验：溶解于depc处理水的rna利用核酸蛋白检测仪测定其在260nm以及280nm处的吸收波长，根据有关资料，260/280值在1.8～2.0之间显示所提取的rna质量较纯，含有的杂蛋白以及多糖类物质含量较少，低于此范围的rna不建议使用，高于2.0则说明所提取的rna有较多降解，不适合下一步扩增基因全长cdna实验用。测定完成后，取2～3ml上样于1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件设定为135v和150ma，电泳15min，在凝胶成像分析仪中观察rna电泳条带，提取质量较好的rna能够观察到明显的28s和18s条带，亮度之比为2:1；3)cdna第一链的合成：使用m-mlv反转录试剂盒，具体操作步骤如下：a.0.2ml离心管中加入以下反应体系：总rna5.0uloligodt1.0ulb.混匀后离心，并置于pcr仪内，设置温度为70℃，反应10min后立即取出，冰浴2min结束。在上述反应体系中继续加入以下试剂：c.混匀后离心，于pcr仪内设定反应条件为42℃60min，70℃15min，结束后迅速取出冰浴15min，保存至-20℃备用，长期保存则放置于-80℃冰箱；4)曼氏无针乌贼心激肽scap核心序列的扩增：根据ncbi数据库中商乌贼scap的基因序列，分析氨基酸序列的保守区，使用primer5.0软件设计简并引物从而扩增出曼氏无针乌贼scap基因的核心序列，克隆所需引物信息见表1：表1克隆scap基因所需引物引物名称序列(5’to3’)scap-fatggmtayctkgsrttgccscap-raccwgggcarcwttccwttcc3′raceinnertgttgcggaatgccactaatgaag3′raceouteratggctatctggggttgcc5′raceinnerggcaaccccagatagccat5′raceouteraccagggcagctttcctttcca.以成熟的曼氏无针乌贼脑组织的cdna为模板，利用上述引物分别扩增得到不同长度的产物片段，该过程所涉及到的反应体系如下：b.pcr反应条件：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，反应35个循环；72℃7min；12℃5min结束。c.反应完成后的pcr扩增产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测，对存在目的条带的pcr产物进行纯化回收，具体操作如下：①用专门的琼脂糖配好1.2％的胶，25ul的pcr产物要全部点进去。②打开凝胶成像仪，打开紫外灯，切割目的条带，刀片提前用95％的酒精泡。③空管称重，加入胶后再称，若小于0.1g就加100ul的bindingbuffer。④提前打开水浴锅，水浴锅溶胶，温度在55-58℃。⑤把溶好的胶加到收集管里，离心1000g，1min。⑥弃废液，加spwwashbuffer700ul，离心1000g，1min。⑦弃废液，加spwwashbuffer700ul，离心1000g，1min。⑧弃废液，空离1min，换掉下面的管子。⑨加300ul的elutionbuffer，要加到棉花上，离心12000g，2min，-20℃保存，送测；5)race获得scap基因cdna的全长：a.3′racea.3′racecdna模板的制备①提取曼氏无针乌贼脑组织的总rna，根据smarttmracecdnaamplificationkit试剂盒建议的方法制备3′race模板cdna，具体操作如下：200ul微量离心管中加入以下试剂：脑组织总rna2ul3′raceadapter2ulh2o(rnase-)6ul②震荡混匀反应体系，离心后置于pcr仪内，设定条件为70℃2min，反应结束后立即取出，冰浴2min。向上一步的微量离心管中加入以下试剂：③震荡混匀反应体系，离心后置于pcr仪内，设定条件：42℃1.5小时，70℃7min，反应结束后立即取出冰浴2min，经过核酸蛋白检测仪测定浓度后，稀释至合适浓度后分装于-20℃保存备用。b.scap基因3′端扩增巢式一轮pcr①200ul离心管中加入以下反应体系：②混匀该体系离心后置于pcr仪内，设定反应条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，反应35个循环；72℃5min；12℃5min。巢式二轮pcr①以一轮pcr产物为模板，200ul离心管中加入以下反应体系：②混匀反应体系，离心后置于pcr仪内，设定反应条件如下：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，反应35个循环；72℃5min；12℃5min。③反应结束后电泳检测pcr产物，割取目的条带纯化回收，为提高pcr产物回收浓度，可以将多管pcr产物混合到一起，采用乙醇回收，具体方法：按照pcr产物与无水乙醇体积比1:9混合，静置5分钟后12000r/min，离心5min，弃上清，然后将沉淀用75％乙醇洗涤一次，离心后保留管底的沉淀并挥干乙醇，加适量水溶解即可。c.回收后的产物进行ta克隆①lb固体培养管，4g+100ml，液体25g+100ml，灭菌。②lb固体冷却至40-50℃时，加入40ul青霉素，倒平板。③pcr产物回收，5ul产物+4.25ulsolutionⅰ+0.75ulpmd-18tvector。10s离心，过夜。④取dh5a感受态细胞50ul/次，插入冰中，将③中液体全部加入到50ul的感受态中，轻轻吹吸5次，冰上30min，42℃热激90s，冰上3min。⑤各反应管中加入1mllb液体培养基，37℃，200r/min，1.5h培养。⑥将平板涂上80ulx-gal和3.5uliptg，涂布均匀，放置干燥，离心4000r/min，5min。⑦吸取培养液100ul涂布均匀，吸出500ul上清，保留500ul底液，吹吸均匀。⑧涂布后正置培养1h，倒置培养12h左右。⑨挑取白色菌落，接种到加入amp+液体培养基中，37℃，200r/min培养8小时左右。⑩菌液pcr：菌液1ul，mix5ul，引物各0.4ul，depc水3.2ul。结果送测。b.5′racea.5′race模板cdna制备①以曼氏无针乌贼脑组织总rna为模板，反转录方法同样适用于5′race的模板cdna制备，操作步骤如下：200ul离心管中加入以下试剂：脑组织总rna1ul5′raceadapter1ul水(rnase-)13.5ul②混匀反应体系后离心，放置于pcr仪内，设置反应条件为70℃10min，结束后迅速取出冰浴2min。向上一步反应结束的体系中加入以下试剂：③混匀反应体系后离心，将离心管置于pcr仪内，设置反应条件为：42℃1min；取出加入superscripttmiirt1ul混匀离心后，放回pcr仪内，42℃50min，70℃15min反应结束，取出加入rnasemix1ul后放回，37℃反应30min。④race模板cdna的纯化根据pcr产物纯化试剂盒操作方法向上一步反应结束的产物中加入5倍体积solutioni，混合均匀后转移至离心柱中，10000rpm条件下离心1min，除去收集管中的废液，向离心柱中加入350ul的solutionii，12000rpm离心1min，重复一次；更换新的收集管，向离心柱中加入25uldepc处理水，室温条件下孵育1min，最后12000rpm条件下离心5min，得到纯化后的cdna。⑤cdna加尾，反应体系如下：⑥混匀后离心，pcr反应条件设定为：94℃3min，结束后迅速取出置于冰上静置2min，加入1ultdt；37℃10min，65℃10min后结束反应，取出产物利用核酸蛋白检测仪测定浓度，并用h2o(rnase-)稀释至合适浓度，于-20℃保存备用。b.scap基因5′端扩增1)一轮pcr①200ul离心管中加入以下试剂：②混匀反应体系后离心，离心管置于pcr仪中，设定反应条件如下：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，反应35个循环；72℃5min，12℃5min，反应结束后取出。2)二轮pcr①向反应体系中加入以下试剂：②将反应体系混匀并离心，离心管置于pcr仪中，设定反应条件如下：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，反应35个循环；72℃5min，12℃5min，反应结束。③将以上反应结束的pcr产物电泳回收目的条带，纯化后的pcr产物连接至pmd18-t载体并转至dh5&感受态细胞中，涂板后挑取单克隆培养，菌液pcr验证后送上海生工测序6)序列信息分析方法：采用dnaman软件对克隆得到的目的片段进行序列拼接和分析，最终获得曼氏无针乌贼scap基因的全长cdna序列，orffinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffind-er/)预测基因的开放阅读框位置。expasy-protparam在线软件(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)预测蛋白的分子量和等电点。通过smart(http://smart.emblheidelbe-rg.de/)翻译为多肽序列。利用clustalx软件将曼氏无针乌贼scap氨基酸序列与其它物种的scap氨基酸序列进行同源性比对。并基于scap氨基酸序列分析曼氏无针乌贼与其它物种的亲缘关系，采用贝叶斯的方法构建分子进化树。以tmpred对曼氏无针乌贼scap蛋白的跨膜结构进行预测。用signalip预测scap蛋白质序列中的信号肽的剪切位点，并用scanprosite软件对该蛋白可能存在的修饰位点进行分析。7)结果与分析：曼氏无针乌贼总rna提取结果：用trizol试剂对曼氏无针乌贼脑组织提取总rna，获得的rna用琼脂糖凝胶电泳仪在135v、100ma条件下电泳20分钟，紫外凝胶成像分析系统中成像后条带如图1，经过浓度测定，a260/a280值在1.8-2.0之间，可作为模板进一步用于cdna第一链合成。曼氏无针乌贼scap核心序列扩增结果：比对ncbi中已发表的同源序列，找到各种物种之间的保守区域，设计简并引物并以曼氏无针乌贼组织cdna为模板，进行pcr扩增，获得一条长约为122bp左右的片段，如图2所示，与预期大小一致，经测定核心序列长度为122bp。scap基因5′端和3′端序列扩增结果：用已得到的scap的cdna核心序列设计引物来扩增5′端和3′端非编码区序列，扩增后的产物经过琼脂糖电泳后在成像系统中的条带如3和图4，其中5′race产物为261bp，3′race产物为459bp。曼氏无针乌贼scap的cdna序列全长及序列分析：曼氏无针乌贼神经肽scap基因cdna全长696bp，具体为：gcacttgcattcttcctatttttttggaaagccgaaaaagacaccgttagcgaaatcagaaaactcacacacaccttgcttcaatctcgagccattctgcaaatatcaacaatgttctctcaaaatctgtctgtccttgccttctcagtctgcattcttcttactatggctaatacaagttatggctatctggtgttgccccgccagggtcgatctgatgaccgggcagaaccatcatgttgcggaatgccactaatgaaggctacaggcctttgcccaatcggaatggaatgctgcccaggtctgaagaaagttttacaaaaatccggacagaaaacagtttactctatctgtattgcggatctctactgaacaaaccaatcctgtgctacttcccaaattccagaatggaggttgcgatcctctgtgcaaggaaatgagacaaggagaaagagtaatgaattctttcttacttcttgaatgtggacgacgaatcgatcagaaagggattgttatgagatgagaaatcaaagaacattaaaatatatatatatataaataaataaaacacactatgaaacgaatgtttacaaaagttgatagatttaagcatgtttgtatcattcttacggtctaataaacaattatgaatggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa，由111bp的5′非翻译区、编码86个氨基酸的261bp开放阅读框和324bp的3′非翻译区组成，编码的蛋白质相对分子质量9.331kda，等电点8.52，包括8个碱性氨基酸，5个酸性氨基酸，原子总数为1308，如图5，图中预测的氨基酸序列显示在碱基序列下方，推测的信号肽序列用黑色下划线标出，基本剪切位点用黑色圆框标示，用黑色线框分别标示了预测的起始密码子(atg)、终止密码子(tga)和多腺苷化信号(aataaa)。预测蛋白质序列中的信号肽的剪切位点，发现scap具有成熟信号肽，1-25号氨基酸为成熟信号肽所在位置，在25和26号氨基酸之间发生剪切，如图6。scap有明显的跨膜区，如图7。scap蛋白二级结构中含有17％螺旋结构、20％折叠结构、14％转角结构以及49％的无规则卷曲结构，如图8。亲水性分析显示该蛋白中含有28个亲水性氨基酸，58个疏水性氨基酸，为亲水性蛋白。scap基因氨基酸序列同源对比及系统进化分析：用clustalw2在线分析网站(http://wwwebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/)对曼氏无针乌贼scap前体蛋白进行保守性分析。选取商乌贼，真蛸和加州双斑蛸与曼氏无针乌贼进行对比，如图9，图中相同氨基酸残基用黑色标示，保守氨基酸残基用灰色标示，结果表明曼氏无针乌贼scap基因与商乌贼相似性达到90％，与其他软体动物相似性也较高。曼氏无针乌贼系统进化分析：选取55条氨基酸同源序列，基于bayesian进行进化树的构建。对55条scap同源氨基酸序列进行进化关系的分析，如图10，结果表明曼氏无针乌贼与商乌贼关系最近，其次是真蛸和加州双斑蛸，并与海兔以及太平洋牡蛎汇聚为一大支，与果蝇属的drosophilaficusphila(xp017052809.1)、drosophilabipectinata(xp017102156.1)、drosophilaeugracilis(xp017082748.1)、drosophilamiranda(xp017143023.1)、drosophilamelanogaster(np001262846.1)、drosophilasuzukii(xp016924913.1)、drosophilaelegans(xp017114485.1)、drosophilabusckii(xp017845032.1)、drosophilabiarmipes(xp016959934.1)、drosophilarhopaloa(xp016974476.1)、drosophilatakahashii(xp0170003765.1)的进化关系最远。实施例2：曼氏无针乌贼神经肽scap，曼氏无针乌贼神经肽scap通过rt-pcr以及race技术对曼氏无针乌贼scap基因进行克隆得到；曼氏无针乌贼神经肽scap基因cdna全长696bp。曼氏无针乌贼心激肽scap在视叶中的表达量最多，其次是脑组织，其他组织都有微量表达，心组织中表达量最少，通过中枢神经系统来控制乌贼活动，具有刺激心脏运动、控制肌肉收缩、刺激输卵管收缩、参与取食行为、增强后肠收缩、调节包括视觉和嗅觉在内的各种神经系统等功能。scap基因包括111bp的5’非编码区序列以及324bp的3’非编码区序列；scap基因预测的开放阅读框共261bp，预测编码86个氨基酸。scap编码的蛋白质相对分子质量9.331kda，等电点8.52，包括8个碱性氨基酸，5个酸性氨基酸，原子总数为1308。scap具有成熟信号肽，信号肽位于1号及25号氨基酸之间，在25与26号氨基酸之间发生剪切。scap有明显的跨膜区。据此我们可知道scap属于细胞内分泌的蛋白，由细胞内分泌到细胞外发挥作用。scap中含有28个亲水性氨基酸，58个疏水性氨基酸，为亲水性蛋白。疏水性是氨基酸的一种重要性质，疏水性的氨基酸倾向于远离周围水分子，将自己包埋进蛋白质的内部，但scap则相反。scap二级结构中含有17％螺旋结构、20％折叠结构、14％转角结构以及49％的无规则卷曲结构。通过疏水氨基酸出现的周期性预测scap蛋白质的二级结构，利用各种氨基酸的疏水值定位蛋白质的疏水区域，α螺旋中亲疏水氨基酸残基的出现位置也就有一定的规律性，亲水残基多出现在亲水侧面，而疏水残基则多出现在疏水侧面，反映在序列上就是一些特征的亲疏水残基间隔模式。对曼氏无针乌贼scap前体蛋白进行保守性分析，发现曼氏无针乌贼scap基因与商乌贼相似性达到90％。其次是真蛸和加州双斑蛸，并与海兔以及太平洋牡蛎汇聚为一大支，而与果蝇属drosophilaficusphila(xp017052809.1)、drosophilabipectinata(xp017102156.1)、drosophilaeugracilis(xp017082748.1)、drosophilamiranda(xp017143023.1)、drosophilamelanogaster(np001262846.1)、drosophilasuzukii(xp016924913.1)、drosophilaelegans(xp017114485.1)、drosophilabusckii(xp017845032.1)、drosophilabiarmipes(xp016959934.1)、drosophilarhopaloa(xp016974476.1)、drosophilatakahashii(xp0170003765.1)的进化关系最远，说明曼氏无针乌贼scap基因的结构进化十分保守。scap基因通过中枢神经系统来控制乌贼活动的。通过scap基因的组织表达特异性分析发现，它在雄性个体的视叶中表达量最高，其次就是脑组织，其他组织中都有微量表达，但是在肌肉中最少。在雌性个体中也是视叶的表达量最高，其次是脑组织，其他各组织也都有表达，但是心脏最少，由此可以看出sj-scap不像正常所理解的那样是在心脏中发生作用的，而是通过中枢神经系统来控制乌贼活动的，此外原位杂交结果显示曼氏无针乌贼心激肽scap在视叶中杂交信号，在脑组织中也存在杂交信号。上述曼氏无针乌贼神经肽scap的用途，曼氏无针乌贼神经肽scap在头足类养殖过程中进行生殖调控的用途。曼氏无针乌贼心激肽scap通过中枢神经系统来控制乌贼活动，具有刺激心脏运动、控制肌肉收缩、刺激输卵管收缩、参与取食行为、增强后肠收缩、调节包括视觉和嗅觉在内的各种神经系统等功能，进而对头足类的生殖进行调控，降低头足类增养殖过程中存在着养殖个体性早熟等问题的发生，为头足类的人工养殖和增殖放流做贡献。实施例3：曼氏无针乌贼神经肽scap组织特异性表达分析：a.不同组织总rna提取：选取雄性乌贼的组织：脑、视叶、心、鳃、肝、胃、胰、肠、肌肉、精巢；雌性乌贼的组织：脑、视叶、心、鳃、肝、胃、胰、肠、肌肉、卵巢、缠卵腺、副缠卵腺组织，总rna提取与脑组织总rna提取相同，具体步骤参考实施例1总rna提取；b.cdna模板合成：(1)将上一步已经提取的来自不同组织的总rna反转录制备real-timepcr实验所需的cdna模板，具体方法参照m-mlvreversetranscriptase试剂使用说明书。反转录之前需去除提取的总rna中基因组dna对于real-timepcr实验的干扰，具体步骤如下：(2)200ul离心管中加入以下反应体系：(3)混匀后稍许离心，离心管置于pcr仪内，设定反应条件为：42℃2min，反应结束后迅速取出置于冰浴中2min，接下来利用已经去除基因组dna污染的rna合成cdna第一链，这一步反应需要在离心管中加入以下反应体系：(4)反应体系混匀后离心，置于pcr仪内设定反应条件为：37℃15min，85℃5s，结束后取出反转录产物迅速置于冰浴中15min。产物保存至-20℃冰箱中备用，上机实验之前，已制备的曼氏无针乌贼不同组织cdna需要稀释到100ng/l的浓度，该过程需要借助于核酸蛋白检测仪测定cdna浓度，并计算稀释倍数；c.引物设计：根据已获得的曼氏无针乌贼scap基因cdna全长序列，设计用于scap基因荧光定量分析所用引物，使用曼氏无针乌贼β-actin基因(jn564496.1)作为实验的内参基因。设计引物时需要尽量保证scap基因特异性引物与内参基因引物的退火温度相近，不能形成引物二聚体，不存在互补情况。合成的引物进行常规pcr筛选，最终确定用于scap基因组织特异性分析的引物序列见表2：表2scap荧光定量pcr所需引物引物名称序列rt-scap-fcctgtgctacttcccaaatrt-scap-rtctcatctcataacaatccctactin-ftgagagggagattgtgcgtgactin-rgaacatagattctggagcacggd.荧光定量pcr：(1)该实验采用的是相对荧光定量的方法，选取表达量最少的组织作为参照，并使用曼氏无针乌贼β-actin基因(s.japonicajn564496.1)作为内参基因，比较scap基因在曼氏无针乌贼脑、视叶、心脏等不同组织中的表达量差异。按照sybrpermixextaqtmiikit试剂使用说明书，反应体系如下：(2)混匀后的反应体系离心后置于荧光定量pcr仪内，每个样品三个副孔。设定反应条件为：94℃30s；945s；60℃30s，反应40个循环；55℃～95℃，2min结束。c.数据处理：实验中的标准曲线，ct值等由abi7500realtimepcr仪自带的abi7500realtimepcrsystemdetection软件自动完成。使用2-△△ct方法测定不同组织scap基因的表达量水平。使用spss18.0统计软件进行单因素方差分析(onewayanova)，duncan法多重比较检验组间差异的显著性，p＜0.05检查差异显著。使用excel2010软件进行数据的统计和分析，使用软件sigmaplotⅰ2.5来制作相关柱形图，结果如图11和图12。结果显示，在雄性个体中，视叶中的表达量最高，其次是脑组织，其他组织中都有微量表达，肌肉中表达量最少；在雌性个体中，也是在视叶中的表达量最多，其次是脑组织，其他组织都有微量表达，心组织中表达量最少。实施例4：曼氏无针乌贼神经肽scap脑组织表达定位分析：原位杂交：(1)杂交探针模板制备①根据获得的scapcdna全长序列设计用于制备原位杂交探针模板的引物a1f以及a1r，并以乌贼脑组织cdna为模板进行普通pcr扩增，扩增产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测，存在目的片段的产物经过割胶回收，回收产物用作原位杂交探针制备的模板。pcr反应体系如下：混匀反应体系后置于pcr仪内，这顶反应条件为：94℃5min；94℃30s；60℃30s；72℃30s，30个循环；72℃8min结束后取出产物并置于-20℃保存备用。②pcr扩增产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测，含有目的片段的产物割胶回收。③纯化后的pcr产物使用相应的限制性内切酶ecori和hindiii进行双酶切，酶切体系如下：混匀体系后置于37℃孵育过夜。④pspt18载体也采用ecori和hindiii限制性内切酶进行双酶切，反应体系同上。⑤质粒酶切后的产物也使用e.z.n.a.tmgelextractionkit试剂盒进行割胶回收，酶切后的pcr产物以及酶切后的质粒回收产物使用solutioni进行连接，连接体系如下：⑥连接产物转化至dh5&感受态细胞后，进行涂板培养。⑦使用plasmidminikiti(100)质粒提取试剂盒抽提质粒。提取的质粒送至上海生工进行测序，检测目的片段是否插入。⑧正确的重组质粒使用ecori进行单酶切。单酶切反应体系如下：⑨用氯仿重新抽提重组质粒单酶切产物，并用75％乙醇沉淀，离心后除去上清，并挥干残留乙醇，然后将沉淀溶解于20ulh2o(rnase-)中，取2-3ul单酶切产物进行电泳检测。其它放置于-20℃保存备用。(2)探针的制备①标记反义探针的方法如下：混匀后的反应体系共10ul置于pcr仪内，设定反应条件为37℃2h，结束后取出加入1ul的edta溶液终止反应。②向离心管中加入75ul提前预冷的无水乙醇，充分混匀后置于-20℃静置2-3h。③取出离心管并于4℃，12000rpm条件下离心15min，保留吸附在管壁内侧的少量沉淀。④向上一步的离心管中加入100ul70％乙醇溶液，用枪头吹吸均匀，并于4℃，7500rpm条件下离心5min。⑤离心结束后除去上清，超净工作台中挥干残留的乙醇，加入20uldepc处理水溶解，取2ul用1％琼脂糖凝胶电泳检测，其余的保存到-20℃冰箱备用。(3)原位杂交实验①切片复水：将脑组织切片取出烘片机上43℃烘片30min，然后置于二甲苯以及100％、90％、80％、70％的乙醇溶液中复水各10min，最后1xpbs溶液中漂洗10min。②前处理：将脑组织切片浸入4％多聚甲醛溶液中于4℃环境下避光固定10min，然后依次用1xpbs、1m甘氨酸溶液、0.3％tritonx-100溶液、1xpbs溶液分别漂洗10min、5min、15min及10min，漂洗过程可轻微摇晃。③通透处理：将前一步处理的切片置于37℃的蛋白酶k溶液中处理20min，结束后取出经由0.1m甘氨酸溶液冲洗1min、1xpbs溶液漂洗10min、0.1m三乙醇胺溶液漂洗10min、最后用2×ssc溶液漂洗10min。④预杂交和杂交：切片滴加预杂交液于暗室中42℃预杂交1h，然后滴加使用与杂交液稀释的探针溶液适量于43℃条件下杂交孵育过夜。⑤杂交后处理：取出杂交过夜的切片，经由37℃4×ssc溶液漂洗1min、2×ssc漂洗30min、1×ssc漂洗30min。⑥二抗标记：使用10％blocking溶液室温封闭1h、然后滴加按照1:500稀释的二抗，并37℃孵育1h、结束后用1xpbs冲洗1min。⑦杂交后显色：载玻片上滴加显色底物nbt/bcip，暗处显色30min-24h、depc水冲洗3min终止显色，最后用甘油封片，拍照，如图13所示。途中ol：视叶(opticlobe)；oes：食道(oesophagea)；v：垂直叶(verticallobe)；sv：亚垂直叶(subverticallobe)；pl：脑脚叶(pedunclelobe)；dll：背外侧叶(dorsolaterallobe)；og：视腺(opticgland)。可发现scap在视叶中阳性杂交信号最为强烈，在食道上神经团的垂直叶、亚垂直叶、脑脚叶、背外侧叶、视腺也能观察到较为强烈的阳性杂交信号。本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>浙江海洋大学<120>曼氏无针乌贼神经肽scap及其用途<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>696<212>dna<213>曼氏无针乌贼(sepiellamaindroniderochebrune)<400>1gcacttgcattcttcctatttttttggaaagccgaaaaagacaccgttagcgaaatcaga60aaactcacacacaccttgcttcaatctcgagccattctgcaaatatcaacaatgttctct120caaaatctgtctgtccttgccttctcagtctgcattcttcttactatggctaatacaagt180tatggctatctggtgttgccccgccagggtcgatctgatgaccgggcagaaccatcatgt240tgcggaatgccactaatgaaggctacaggcctttgcccaatcggaatggaatgctgccca300ggtctgaagaaagttttacaaaaatccggacagaaaacagtttactctatctgtattgcg360gatctctactgaacaaaccaatcctgtgctacttcccaaattccagaatggaggttgcga420tcctctgtgcaaggaaatgagacaaggagaaagagtaatgaattctttcttacttcttga480atgtggacgacgaatcgatcagaaagggattgttatgagatgagaaatcaaagaacatta540aaatatatatatatataaataaataaaacacactatgaaacgaatgtttacaaaagttga600tagatttaagcatgtttgtatcattcttacggtctaataaacaattatgaatggcaaaaa660aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa696当前第1页12