一种快速检测绿脓杆菌强毒力菌株的方法、检测试剂盒和应用与流程

本发明所涉及的是一种快速检测绿脓杆菌强毒力菌株的方法、检测试剂盒和应用，属于细菌分子生物学领域。

背景技术：

绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)又称铜绿假单胞菌，广泛分布于土壤、水和空气中，在人与动物的肠道和皮肤上亦有存在，一般被认为是条件致病菌，在一定条件下，可感染人和动物。在兽医方面，绿脓杆菌可感染犬、猪、禽等多种动物，尤其是水貂出血性肺炎的重要病原之一。在人医上，绿脓杆菌是医院内感染最常见的革兰氏阴性杆菌之一，占医院内感染的10％，是造成医院内获得性肺炎的主要病原菌之一。

绿脓杆菌严重危害动物以及人类的健康。绿脓杆菌致病菌株具有广泛的毒力因子库，使其能够在宿主中存活并引起疾病，在其感染致病的过程中表达多种毒力因子、毒素、胞外粘液质、酯酶、卵磷脂酶、溶血素脂肪酶等。

水貂作为珍贵的皮毛动物，其经济利益促使水貂养殖业迅速发展。随着养殖规模不断扩大，养殖密度不断增加，但总体养殖水平低、饲养管理粗放，疾病的发病率越来越高，给水貂养殖业造成了很大的经济损失。绿脓杆菌是水貂出血性肺炎的重要病原之一，多发于温暖潮湿季节，以出血性肺炎、肺水肿和败血症为主要特征，发病急，死亡快，在我国水貂养殖区广泛流行，严重妨碍了水貂养殖业的健康发展。因此，需加强对水貂绿脓杆菌病的检测与防控。

目前在实际工作中，主要采用细菌分离培养、平板凝集、单重pcr等方法对绿脓杆菌进行鉴定，时间较长或因其他干扰因素易出现假阳性。申请号为201611160848.6、发明名称为一种用于检测绿脓杆菌的试剂盒与应用的发明专利申请，涉及一种用于检测绿脓杆菌的试剂盒，该试剂盒包括6条引物组成的lamp引物组，以所述的引物组进行lamp扩增，经显色后，根据显色结果判断样品是否含有绿脓杆菌。该发明提供的引物进行绿脓杆菌检测，准确性好，且无需提取样品的dna而直接进行扩增，进一步缩短了检测的时间、简化了操作，并且灵敏度好。然而，该发明专利申请可用于判断待测样品是否受到绿脓杆菌的污染，而不能检测样品所感染的绿脓杆菌是否是强毒力菌株。

因此，如能快速准确的诊断水貂是否感染绿脓杆菌及所感染的绿脓杆菌是否为强毒力菌株，将为水貂出血性肺炎的防治提供了更有效的途径。

技术实现要素：

为克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种非诊断目的快速检测绿脓杆菌强毒力菌株的方法及检测试剂盒，为检测绿脓杆菌强毒力菌株提供了一种新方法。

本发明采用的技术方案是，一种非诊断目的快速检测绿脓杆菌强毒力菌株的方法，采用三重pcr方法，同时检测绿脓杆菌exot、exos及toxa毒力基因，如果能同时扩增出exot、exos及toxa的基因片段，则所检绿脓杆菌为强毒力菌株；如果未能同时扩增出exot、exos及toxa的基因片段，则所检绿脓杆菌不是强毒力菌株。

所述三重pcr方法，采用三对可分别扩增exot基因片段、exos基因片段、toxa基因片段的特异性引物。优选地，扩增exot基因片段的特异性引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示；扩增exos基因片段的特异性引物序列如seqidno.3和seqidno.4所示；扩增toxa基因片段的特异性引物序列如seqidno.5和seqidno.6所示。

所述三重pcr方法，反应体系为：16.3μlddh2o(rnasefree)，2.5μlbuffer，2μldntps(10.0mm)，seq.id.no1和seq.id.no2各0.5μl，seq.id.no3和seq.id.no4各0.5μl，seq.id.no5和seq.id.no6各0.5μl，1μldna模板，0.2μltaq酶；

pcr反应条件为：95℃5min；95℃40s，69℃40s，72℃40s，32个循环；72℃10min；

具体三重pcr过程是：以绿脓杆菌dna为模板进行pcr反应，对得到的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：如果同时扩增出了506bp、317bp和233bp的产物，则该样品为阳性，并且所检绿脓杆菌为强毒力菌株；如果未同时扩增出506bp、317bp和233bp的产物，则所检绿脓杆菌不是强毒力菌株。

本发明人通过对45株貂源绿脓杆菌的exot、plch、algd、apra、exoy、exos、toxa、lasb、exou、lasa、phzs、phzm等毒力基因进行了克隆测序分析，同时选择代表菌株进行了致病性研究，结果表明携带exot、exos、toxa毒力基因的菌株致病力强。绿脓杆菌基因组中的exot、exos基因编码毒性蛋白exot、exos，toxa基因编码toxa。exot蛋白在增强细菌毒力方面起着重要作用，exos蛋白在细菌的侵染性方面起重要作用，toxa是该菌的主要免疫原性抗原，在感染宿主方面起重要作用。因此可以通过检测绿脓杆菌的毒力基因exot、exos及toxa对绿脓杆菌病进行检测。

在此基础上，本发明针对exot、exos、toxa毒力基因，设计并筛选了特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，最终建立了快速检测绿脓杆菌exot、exos及toxa毒力基因的三重pcr方法。本发明方法具有检测便捷快速、特异性强、敏感性高等优点，可以快速准确地进行绿脓杆菌病的检测。

用本发明建立的三重pcr方法对山东、河北、东北等地30个貂场送检的150只绿脓杆菌分离呈阳性的水貂器官组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与细菌分离培养检测结果符合率为100％，说明本发明建立的三重pcr方法适合于水貂绿脓杆菌病的快速检测。本发明的三重pcr方法最低可检测到10²个拷贝绿脓杆菌的dna，表明本发明方法具有很高的灵敏性。

目前，在我国水貂群中出血性肺炎普遍存在，检测方法也多种多样。但截至本发明申请日前，应用三重pcr方法检测绿脓杆菌强毒力菌株的方法还没有建立，本发明所建立的检测水貂绿脓杆菌病的三重pcr方法具有省时省力、特异性强、敏感性高等优点，为该病的检疫提供一种新的检测方法。

因此，本发明另一方面还提供用于快速检测绿脓杆菌强毒力菌株的pcr引物组及一种快速检测绿脓杆菌强毒力菌株的试剂盒。

所述引物组包括三对pcr引物，分别是：扩增exot基因片段的特异性引物对，序列如seqidno.1和seqidno.2所示；扩增exos基因片段的特异性引物对，序列如seqidno.3和seqidno.4所示；扩增toxa基因片段的特异性引物对，序列如seqidno.5和seqidno.6所示。

所述试剂盒包括上述引物组及taq酶、dntps、buffer及其他pcr所需成分。

本发明还提供所述试剂盒在检测貂源绿脓杆菌中的应用。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明首次通过对貂源绿脓杆菌的毒力基因进行了克隆测序、遗传进化分析，明确了exot、exos、toxa毒力基因的与菌株致病力强弱之间的关系，研究结果表明携带exot、exos、toxa毒力基因的菌株致病力强。

(2)本发明通过特异引物设计、优化了反应过程，最终建立了快速检测绿脓杆菌exot、exos及toxa毒力基因的三重pcr方法。本发明方法具有检测便捷快速、特异性强、敏感性高等优点，可以快速准确地实现绿脓杆菌强毒力菌株的检测。

(3)本发明方法及检测试剂盒尤其适用于检测貂源绿脓杆菌中，在水貂养殖业中可广泛推广应用，优化产业结构。

附图说明

图1为单重pcr的特异性检测结果。

m，dnamarkerdl1000；用seqidno.1/seqidno.2分别扩增：1.绿脓杆菌2.双球菌3.克雷伯氏菌4.健康水貂肺脏组织；用seqidno.3/seqidno.4分别扩增：5.绿脓杆菌6.双球菌7.克雷伯氏菌8.健康水貂肺脏组织；用seqidno.5/seqidno.6分别扩增：9.绿脓杆菌10.双球菌11.克雷伯氏菌12.健康水貂肺脏组织。

图2为三重pcr的特异性检测结果。

m，dnamarkerdl1000；1.用引物seqidno.1/seqidno.2、引物seqidno.3/seqidno.4及seqidno.5/seqidno.6三重pcr扩增绿脓杆菌；2.用引物seqidno.1/seqidno.2扩增绿脓杆菌；3.用引物seqidno.3/seqidno.4扩增绿脓杆菌；4.用引物seqidno.5/seqidno.6扩增绿脓杆菌；用引物seqidno.1/seqidno.2、引物seqidno.3/seqidno.4及seqidno.5/seqidno.6三重pcr分别扩增：5.双球菌，6.克雷伯氏菌，7.巴氏杆菌，8.大肠杆菌貂，9.犬瘟热病毒，10.貂细小病毒，11.健康水貂肺脏组织。

图3为单重及三重pcr针对绿脓杆菌感染水貂肺脏总dna的敏感性检测结果。

图3a为针对exot基因敏感性检测结果；图3b为针对exos基因敏感性检测结果；图3c为针对toxa基因敏感性检测结果；图3d为针对exot、exos、toxa基因敏感性检测结果；各图中m为dnamarkerdl1000；所提组织病料模板dna的浓度对应组织病料的量分别是，1.1mg/μl，2.100ng/μl，3.10ng/μl，4.1ng/μl，5.100pg/μl，6.10pg/μl，7.1pg/μl。

图4为三重pcr针对绿脓杆菌的dna模板exot、exos、toxa基因的敏感性检测结果。

m，dnamarkerdl1000；泳道1-11分别为10¹⁰-10⁰拷贝的绿脓杆菌的dna模板。

具体实施方式

下面结合具体的实验过程和实验方法对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明，下述方法如无特殊说明，为本领域常用方法；下述试剂如无特殊说明，均为本领域常用试剂，可以从市售途径获得。

实验一、貂源绿脓杆菌的强毒力基因筛选

发明人对本实验室分离的45株貂源绿脓杆菌的exot、plch、algd、apra、exoy、exos、toxa、lasb、exou、lasa、phzs、phzm等毒力基因进行了克隆测序分析，并已将部分序列提交genbank，序列号为mg506925-mg507043和mg515135-mg515144，遗传进化分析结果表明貂源绿脓杆菌携带的毒力基因与人源绿脓杆菌的毒力基因亲缘关系密切。选择代表菌株进行了致病性研究，结果表明携带exot、exos、toxa毒力基因的菌株致病力强。

实验二、三重pcr方法检测强毒力绿脓杆菌的建立

1.引物设计

通过参考genbank上已发表的绿脓杆菌序列进行比对，针对绿脓杆菌中的exot、exos基因及toxa基因，通过设计引物、摸索、控制引物的长度、退火温度、pcr反应条件等分别最终得到一对针对exot基因片段的特异性引物seqidno.1/seqidno.2，一对针对exos基因片段的特异性引物seqidno.3/seqidno.4和一对针对toxa基因片段的特异性引物seqidno.5/seqidno.6，利用常规方法对细菌样品进行扩增。引物序列如下：

seqidno.1：5’-ccaggcgccgctctcccgtc-3’；

seqidno.2：5’-ccgcctccagcccgaagtgc-3’；

seqidno.3：5’-ccacgacgacggctatctctc-3’；

seqidno.4：5’-cctgttcctggacctcacctg-3’；

seqidno.5：5’-cgagatgggcgacgagtt-3’；

seqidno.6：5’-gctgctgggcgaggtagt-3’。

eoxt基因片段引物扩增片段大小为506bp，eoxs基因片段引物扩增片段大小为317bp，toxa基因片段引物扩增片段大小为233bp。所有引物以无菌ddh2o(rnasefree)配成20pmol/μl的浓度备用。

2.单一pcr检测

(1)单重pcr：反应总体系为25μl，包括18.3μlddh2o(rnasefree)，2.5μl10×pcrbuffer，2.0μldntps(10.0mm)，eoxt或eoxs或toxa上下游引物各0.5μl，1.0μldna模板，0.2μltaq酶。pcr反应程序均为：95℃5min；95℃40s，69℃40s，72℃40s，32个循环；72℃10min。

(2)分别用引物用seqidno.1/seqidno.2、引物seqidno.3/seqidno.4及引物seqidno.5/seqidno.6，分别扩增绿脓杆菌、双球菌、克雷伯氏菌、健康水貂肺脏组织；进行上述单重pcr扩增，以检测引物的特异性。将pcr产物与dna电泳上样缓冲液混合，在1％浓度的琼脂糖凝胶中，以7～10v/cm电压在1×tae中进行电泳，在紫外灯下观察结果并用凝胶成像仪观察，照相。

结果表明，引物seqidno.1/seqidno.2只能扩增出绿脓杆菌的eoxt基因片段，pcr产物大小为506bp，而对其他模板双球菌、克雷伯氏菌、健康水貂肺脏组织扩增阴性；引物seqidno.3/seqidno.4只能扩增出绿脓杆菌的eoxs基因片段，pcr产物大小为317bp，而对其他模板双球菌、克雷伯氏菌、健康水貂肺脏组织扩增阴性；引物seqidno.5/seqidno.6只能扩增出绿脓杆菌的toxa基因片段，pcr产物大小为233bp，而对其他模板双球菌、克雷伯氏菌、健康水貂肺脏组织扩增阴性(见图1)。结果表明，引物seqidno.1/seqidno.2、引物seqidno.3/seqidno.4及seqidno.5/seqidno.6具有很强的特异性，只能分别针对绿脓杆菌进行特异性扩增。

3.三重pcr条件的优化

在单重pcr的基础上，对引物、dntps、buffer的浓度及退火温度等参数进行优化，得到三重pcr最佳反应体系和反应程序。

三重pcr：以细菌dna为模板，反应总体积为25μl，最佳反应体系为：16.3μlddh2o(rnasefree)，2.5μl10×pcrbuffer，2.0μldntpmixture(10.0mm)，eoxt上下游引物各0.5μl，eoxs上下游引物各0.5μl，toxa上下游引物各0.5μl，1.0μldna模板，0.2μltaq酶。

pcr反应程序为：95℃5min；95℃40s，69℃40s，72℃40s，32个循环；72℃10min。

4.特异性试验

绿脓杆菌、双球菌、克雷伯氏菌、巴氏杆菌、大肠杆菌貂、犬瘟热病毒、貂细小病毒、健康水貂肺脏组织为模板分别用上述优化的条件进行三重pcr反应。对三重pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明：用seqidno.1/seqidno.2、seqidno.3/seqidno.4及seqidno.5/seqidno.6三对引物建立的检测绿脓杆菌的三重pcr方法只能扩增出绿脓杆菌的eoxt、eoxs基因片段及toxa基因片段，而对双球菌、克雷伯氏菌、巴氏杆菌、大肠杆菌貂、犬瘟热病毒、貂细小病毒、健康水貂肺脏组织等扩增阴性。说明用seqidno.1/seqidno.2、seqidno.3/seqidno.4及seqidno.5/seqidno.6三对引物建立的检测绿脓杆菌的三重pcr方法具有很强的特异性。可作为特异性鉴定水貂绿脓杆菌病的快速方法(见图2)。

5.敏感性试验

提取感染水貂肺脏组织总dna，所提dna的浓度对应病料组织的量是1mg/μl，将所提dna进行10×梯度稀释，分别用来作为模板：进行单重和三重pcr对绿脓杆菌的检测灵敏度测定。所提组织病料模板dna的浓度对应组织病料的量分别是，1.1mg/μl，2.100ng/μl，3.10ng/μl，4.1ng/μl，5.100pg/μl，6.10pg/μl，7.1pg/μl。

结果可知，所建立三重pcr方法与单一pcr的敏感度一致，最低可检测到10pg/μl的组织总dna(见图3)。

用紫外分光光度计分别对本实验室构建的含有绿脓杆菌的eoxt基因片段、eoxs基因片段与toxa基因片段的质粒进行260nm/280nmod值的测定，计算出纯度和含量，并将含有eoxt基因片段、eoxs基因片段与toxa基因片段的质粒的浓度均调整10¹⁰拷贝/μl，然后分别对三种质粒进行10×梯度稀释释(即10¹⁰-10⁰个拷贝)，取每个稀释度分别进行三重pcr反应。结果表明，所建立检测绿脓杆菌的三重pcr方法最低可检测到10²个拷贝的细菌dna(见图4)。

6.临床样本检测验证

用建立的三重pcr方法对山东、河北、东北等地30个水貂养殖场场送检的150只分离到绿脓杆菌的水貂组织进行检测，结果发现所有样品的检测结果与细菌分离培养检测结果符合率为100％，说明本发明建立的三重pcr方法适合于水貂绿脓杆菌病的快速检测。

序列表

<110>山东农业大学

<120>一种快速检测绿脓杆菌强毒力菌株的方法、检测试剂盒和应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccaggcgccgctctcccgtc20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccgcctccagcccgaagtgc20

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ccacgacgacggctatctctc21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cctgttcctggacctcacctg21

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cgagatgggcgacgagtt18

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gctgctgggcgaggtagt18