基于LAMP原理的铜绿假单胞菌检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于lamp原理的铜绿假单胞菌检测方法及试剂盒。

背景技术：

铜绿假单胞菌是血流感染的常见细菌，2016年中国细菌耐药性检测网(chinet)对20366株血液标本主要菌种菌株分布进行分析，铜绿假单胞菌占3.2％。铜绿假单胞菌作为一种条件致病菌，分布十分广泛，在免疫功能受损的病人中能够引起严重感染。铜绿假单胞菌已成为院内感染的主要病原菌之一，此菌可由感染病灶进入血流而导致血流感染，铜绿假单胞菌血流感染患者病情重，病死率高，给临床诊治带来极大的挑战。

目前，临床上诊断病原菌感染的主要依靠细菌培养和一系列生化反应。通常细菌培养至少需要2至3天，如果做药敏检测，所需时间更长。许多苛养菌血培养阳性率极低，尤其是患者使用抗生素后留取的标本往往出现假阴性结果。再有血培养如果混有污染菌，往往会影响致病菌的分离。因此，血培养方法作为病原学的诊断手段之一，还存在许多不足之处。传统生化鉴定法一般需要3-4d，检测周期长，试剂种类多，对人员操作要求高。因此，通过传统生化培养鉴定的方法来检测铜绿假单胞菌在时效性上难以满足致病菌快速检测的需求。随着分子生物学技术的发展，以检测核酸为基础的分子生物学技术如pcr再生式序列复制以及链置换扩增技术等广泛应用于医学和生物学等领域，在医学诊断和传染病病原体的检测方面发挥了重要的作用。但由于核酸的分子生物学技术需要昂贵的仪器设备，复杂的操作程序等缺点，大大限制了其作为快速诊断方法的使用。环介导等温扩增技术的问世，解决了核酸诊断的诸多难题，由于其特异型好、检测周期短、灵敏度高、设备简单、产物检测便捷等优点，使疾病的准确、快速、廉价诊断成为可能。

环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是2000年日本学者notomi发明的一种新的核酸扩增技术，包括三个步骤：①起始反应物模板的合成。即先由外引物扩增出内引物扩增所需的模板，起始阶段时间很短；②循环扩增阶段。即由内引物引导合成靶基因dna片段。由于内引物扩增的dna片段含有5’端dna片段的反向互补序列，因而反向互补序列之间可通过杂交形成茎环结构，另外一条内引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应，在扩增的dna片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑铃结构，如此往复循环，最后形成菜花样结构；扩增循环阶段占全面扩增时间的95％以上；③延伸和再循环。该技术具有以下优点：1.特异性高。环介导等温扩增技术(lamp)过程中有2对引物确保反应的特异性，利用一种链置换dna聚合酶在等温条件(60℃～65℃左右)1h左右即可完成核酸扩增反应。而传统pcr只有一对引物，因此lamp法扩增产物的特异性更高。2.灵敏度高。等温扩增反应过程中不需历经温度反复变化，从而扩增酶能保持更好的活性，有助于反应的发生，这些优点有利于此方法的灵敏度提高。3.检测时间短。整个反应时间约为1小时，比传统pcr过程要缩短近1小时，比血培养缩短至少24小时，有利于快速为患者提供服务。4.易操作和污染风险低。只需将dna模板加入反应体系即可检测，加样后反应孔封闭，检测完成后不需要对产物进行再次分析可避免产物污染的风险。5.成本低，因为反应过程简单，故相对于rt-pcr来说对仪器性能要求没那么高，因此也降低了设备的费用，适合基层医院做出病原菌的快速诊断。6.技术门槛相对较低。整个操作过程中只涉及核酸提取和扩增，而这两步操作均可实现自动化操作，因此对人员的要求相对降低，也降低了此技术的门槛，有利于技术在临床的推广。目前的lamp检测的预混液已经商品化，如warmstart公司的colorimetriclamp2×mastermix，其中包含lamp所需的所有缓冲液，无需实验人员自己准备，并且其中含有ph指示剂，在lamp的反应过程中，dna聚合酶发挥聚合作用，改变质子数量进而改变ph值，使粉红色反应液变成黄色，整个反应过程快速，颜色改变清晰，肉眼可见。该产品可以用于任何lamp或者rt-lamp反应，只需提供样品和加热装置，在15-40分钟内就可以用肉眼读取阳性扩增的结果。

现有的铜绿假单胞菌血流感染的诊断方法主要是传统生化鉴定法，但检测周期长，试剂种类多，对人员操作要求高；以检测核酸为基础的分子生物学技术如pcr再生式序列复制以及链置换扩增技术等在铜绿假单胞菌血流感染的诊断中逐渐发挥了重要作用，但需要仪器设备昂贵，操作程序复杂；lamp技术的问世，解决了核酸诊断的诸多难题，由于其特异型好、检测周期短、灵敏度高、设备简单、产物检测便捷等优点，使疾病的准确、快速、廉价诊断成为可能，但是现有的lamp病原体检测试剂盒仅包括warmstartcolorimetriclamp2xmastermix等实验必须试剂，进行lamp检测时首先要对微生物进行核酸提取，实验人员必须额外准备核酸提取试剂，这为实验带来不便。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了基于lamp原理的铜绿假单胞菌检测方法及试剂盒，该方法简单易实施，试剂盒包含所有所需试剂，大大缩短现有的血液铜绿假单胞菌检测时间。

基于lamp原理的铜绿假单胞菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

引物设计：采用primerexplorerv5设计lamp引物，将铜绿假单胞菌特异性基因导入，生成4组引物，每套引物包含f3、b3、fip、bip和lb或lf，上述引物组分别命名为xd1、xd2、xd3、xd4；

模板制备：在待检测血液样本中加入红细胞裂解液，放置5min，使红细胞裂解；

转速为3000rpm/min，时间为5min进行离心，使白细胞沉积；

取上清液，转速为14000rpm/min，时间为10min进行离心，保留200μl上清与细菌沉渣混匀，用核酸提取试剂和核酸提取仪提取dna后进行lamp检测；

扩增反应：反应体系的体积共25μl，包括warmstartcolorimetriclamp2xmastermix12.5μl、四组lamp引物组中的一组2.5μl、dna模板5ul、去离子水补足到25μl；反应条件：65℃进行15-40分钟；

阳性结果反应液由红色变为黄色，阴性结果反应液一直都为红色，根据颜色对比判断样本中是否含有铜绿假单胞菌。

进一步，所述的基于lamp原理的铜绿假单胞菌检测方法，其特征为：所述四套lamp引物组序列分别为：

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进一步，所述的基于lamp原理的铜绿假单胞菌检测方法,其特征为：所述lamp引物组的混合方式为：根据序列合成每条引物后，分别将不同引物进行稀释：fip、bip稀释成40pmol/ul，f3、b3稀释成5pmol/ul，lb或lf稀释成20pmol/ul，等体积混合每组引物中的各条引物，所得混合物即为引物组混合物。

本发明还提供基于lamp原理的铜绿假单胞菌检测试剂盒，其特征是：包括红细胞裂解液、核酸提取试剂、lamp检测试剂和lamp引物；

进一步，所述的基于lamp原理的铜绿假单胞菌检测试剂盒，其特征为：所述lamp引物是xd2引物组。

有益效果：

本发明可大幅度提高检测血液样本中铜绿假单胞菌的时间，本发明的铜绿假单胞菌lamp检测方法的基因扩增步骤仅需15-40min就能完成，结果通过肉眼就可判断，简单直观。本发明设计了4组lamp引物，通过准确性及特异性实验，编号为xd2的引物组特异性最好，在检测的16种外周血常见菌株中，xd2仅能引起铜绿假单胞菌的dna的大量扩增。本方法的核酸提取是利用核酸提取试剂和核酸提取仪进行，大大减少人工成本，节约实验人员操作时间。

本发明的铜绿假单胞菌lamp检测试剂盒内不仅包含lamp检测所需的试剂，还包含了核酸提取试剂和红细胞裂解液，试剂盒包含有所有该实验所需的试剂，为实验人员提供便利。使用xd2作为试剂盒引物组，检测样本体积为2ml时，铜绿假单胞菌的dna的最低检测线为500cfu/ml，大大提高检测的特异性，降低假阳性检出率。

附图说明

图1是lamp引物准确性评价结果图(反应液红色为阴性结果，黄色为阳性结果)；

图2是lamp引物特异性评价结果图(菌株与对应编号为：1-溶血性葡萄球菌；2-屎肠球菌；3-肺炎克雷伯菌；4-产酸克雷伯菌；5-鲍曼不动杆菌；6-草绿色链球菌；7-阴沟肠杆菌；8-弗劳地柠檬酸杆菌；9-粘质沙雷菌；10-奇异变形杆菌；11-嗜麦芽窄食单胞菌；12-表皮葡萄球菌；13-铜绿假单胞菌；14-粪肠球菌；15-大肠埃希菌；16-金黄色葡萄球菌；阴性对照：去离子水；阳性对照：铜绿假单胞菌标准菌株atcc-27853)；

图3是细菌10倍梯度稀释方法示意图；

图4是200ul全血提取核酸灵敏度检测结果(图中数字表示重复检测)；

图5是2ml全血提取核酸灵敏度检测结果(图中数字表示重复检测)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

一种基于lamp原理的铜绿假单胞菌检测方法

1.引物设计

lamp引物设计采用http://primerexplorer.jp/e/中primerexplorerv5进行设计，将铜绿假单胞菌特异性基因导入，生成共4套引物。在合成过程中先生成两条外引物f3、b3，两条内引物fip、bip，同时生成引物信息文件，之后将引物信息文件放入合成软件，生成lb或lf，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物合成后，分别将不同引物进行稀释：fip、bip稀释成40pmol/ul，f3、b3稀释成5pmol/ul，lb或lf稀释成20pmol/ul。每套引物中的各条引物各取相同体积进行混合，生成各套引物的混合引物，充分混匀后作为lamp反应体系中的引物备用。4套引物名称为是xd1、xd2、xd3和xd4，序列分别为：

xd1：

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2.dna模板制备

2.1全血样本处理

取血液样本加入红细胞裂解液，放置5min，使红细胞裂解。转速3000rpm/min，离心5min，使白细胞沉积在试管底部。取上清液，转速14000rpm/min，离心10min，吸掉上清液，留200μl与细菌沉渣混匀。

2.2核酸的提取

用核酸提取试剂进行核酸提取，核酸提取试剂为苏州天隆科技有限公司产品，包括核酸提取试剂1、核酸提取试剂2和核酸提取试剂3。

核酸提取试剂2的配制：在核酸提取试剂2中加入500ul核酸提取试剂3，颠倒混匀10次，使其完全溶解，即可使用。取核酸提取槽，在1/7排孔中加入20μl核酸提取试剂1和20μl提取试剂2，之后加200μl前述细菌的生理盐水菌液，置于天隆核酸提取仪，按以下程序进行自动化提取，见表1。

表1核酸提取仪提取核酸程序

核酸提取好后，用移液枪从病毒核酸提取仪的6/12孔转移各细菌的核酸至干净的无核酸酶的离心管中，-20℃冰箱保存备用。

2.3lamp反应扩增

表2lamp法反应体系

反应温度为65℃，反应时间为15min-40min。所用引物混合物为xd1、xd2、xd3和xd4中的一组。

2.4结果观察

阳性结果反应体系由红色变为黄色，阴性结果反应体系一直都为红色，根据颜色对比判断样本中是否含有铜绿假单胞菌。

实施例一是本发明中基于lamp原理检测血液中铜绿假单胞菌的方法过程，所用试剂均来自本发明的检测试剂盒，本实施例也是本发明基于lamp原理的铜绿假单胞菌检测试剂盒的使用方法说明。本发明能快速有效的判断血液样本中铜绿假单胞菌的有无，具有实用性。

实施例二：

lamp引物准确性和特异性评价

1.lamp引物准确性评价

以按照实施例一所展示的方法获得铜绿假单胞标准株(actt-27853)的dna作为lamp反应体系的模板，以去离子水为阴性模板对照，阳性对照为铜绿假单胞标准株，引物组分别为xd1、xd2、xd3和xd4，按照lamp反应体系加样后在65℃进行反应，分别验证4种引物组的准确性。阳性结果反应体系由红色变为黄色，阴性结果反应体系一直都为红色。根据颜色的变化来判断样本中是否含有铜绿假单胞菌的目的基因。

如图1所示，阴性自始至终都是红色液体，阳性对照由红色变为黄色液体，加入的引物组分别为xd1、xd2、xd3和xd4的体系反应后液体都变为黄色，表明分别加入这四组引物后，都可以引起铜绿假单胞菌的扩增。

2.lamp引物特异性评价

收集溶血葡萄球菌、屎肠球菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、草绿色链球菌、阴沟肠杆菌、弗劳地柠檬酸杆菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌16种细菌菌株，菌株用于核酸提取，以铜绿假单胞标准株的(actt-27853)dna为阳性对照，以去离子水为阴性对照进行lamp检测。每种菌株lamp反应体系中都分别加入xd1、xd2、xd3或xd4引物组，验证四种引物组的特异性。

部分菌株检测结果如图2所示，菌株与对应编号为：1-溶血性葡萄球菌；2-屎肠球菌；3-肺炎克雷伯菌；4-产酸克雷伯菌；5-鲍曼不动杆菌；6-草绿色链球菌；7-阴沟肠杆菌；8-弗劳地柠檬酸杆菌；9-粘质沙雷菌；10-奇异变形杆菌；11-嗜麦芽窄食单胞菌；12-表皮葡萄球菌；13-铜绿假单胞菌；14-粪肠球菌；15-大肠埃希菌；16-金黄色葡萄球菌；阴性对照：去离子水；阳性对照：铜绿假单胞菌标准菌株atcc-27853。xd4号引物使溶血性葡萄球菌、屎肠球菌、鲍曼不动杆菌、粘质沙雷菌、嗜麦芽窄食单胞菌呈阳性反应，存在交叉反应，因此xd4号引物特异性差。xd3号铜绿假单胞菌引物与上述6种细菌均存在交叉反应；xd1号铜绿假单胞菌引物与上述鲍曼不动杆菌存在交叉反应；xd2号引物检测所有细菌dna，结果显示，只有13号铜绿假单胞菌dna与阳性结果相同，其余细菌dna反应与阴性结果相同，xd2特异性表现最好，可以从外周血的16种细菌中检出铜绿假单胞菌。

实施例二的实验表明，运用实施例一所设计得到的四组引物都具有准确性，都能引起铜绿假单胞菌的扩增，但是特异性最好的是xd2引物，xd2对于所检测的16种外周血常见菌株中，只对铜绿假单胞菌有特异性，故本发明的铜绿假单胞菌检测试剂盒中的lamp引物组优选xd2。

实施例三：

基于lamp原理检测血液中铜绿假单胞菌试剂盒灵敏度评价

1.lamp全血中的灵敏度

1.1生理盐水菌液稀释

挑取铜绿假单胞菌标准菌株(atcc-27853)加入生理盐水中，在细菌比浊仪上测定细菌浓度，使其为1麦氏单位，将其用生理盐水10倍梯度稀释后，得到一系列浓度的样本，见图3。取各个浓度的生理盐水菌液加入到排除细菌感染的全血中配制全血菌液，用天隆核酸自动提取仪反应体系进行加样，提取全血菌液中铜绿假单胞菌的dna进行lamp扩增。取检测结果为阳性的最低检测浓度上下的样本进行平行测定，每个浓度样本平行测定10次，以10次检测结果均为阳性的最低浓度为最低检测限(cfu/ml)，以此为全血中的灵敏度。

1.2血平板菌落计数

取上述6号(稀释倍数为10⁵)的生理盐水菌液各20ul分别涂2个血平板，24h后观察血平板上菌落数，从而估算原始菌液的浓度。1麦氏单位菌液细菌数(cfu/ml)＝菌落数/体积×稀释倍数×1000。

1.3200ul全血提取核酸灵敏度检测

上述4号生理盐水菌液按如下方法加入到全血中配制全血菌液，见表3。

表3全血菌液配制方法

以上4-1、4-2全血菌液各取200ul，用天隆核酸提取试剂盒提取dna后进行lamp检测，所用引物为xd2。

结果如图4所示，样本量为200ul，10份标本均为阳性的最低检测浓度为20000cfu/ml。

1.42ml全血提取核酸灵敏度检测

将上述5号生理盐水菌液按如下方法加入到全血中配制全血菌液，见表4。

表4全血菌液配制方法

以上血5-1、血5-2、血5-3、血5-4全血菌液各取菌液2ml+4ml红细胞裂解液，放置5min，使红细胞裂解。低速离心3000rpm/min，离心5min，使白细胞沉积在试管底部。取上清液，ep管分装，高速离心机14000rpm/min，离心10min，吸掉上清液，留200μl与细菌沉渣混匀，用天隆核酸提取试剂盒提取dna后进行lamp检测，所用引物为xd2。

图5结果表明(图中数字编号表示重复检测编号)，样本量为2ml，10份标本均为阳性的最低浓度为500cfu/ml。因此，lamp检测外周血中铜绿假单胞菌的dna的最低检测线为500cfu/ml。

本实施例对本发明的基于lamp原理的铜绿假单胞菌检测试剂盒的灵敏度进行了评价，实验发现，当使用全血样本为2ml时，试剂盒的灵敏度最高，最低检出线为500cfu/ml。试剂盒包含了检测外周血铜绿假单胞菌所需的所有试剂，方便简单。