精确测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种精确测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列方法以及由该方法测得的中华绒螯蟹线粒体全基因组序列。

背景技术：

线粒体具有双层膜结构以及独特的dna分子，也是动物细胞中唯一具有“染色体外”基因组的半自主性细胞器，同时其也具有完整遗传信息传递与表达系统的能力。近年来，线粒体基因组已经成为非常有特点的分子标记，因为其具有一些独特的性质，比如：分子量较小、结构简单、母系遗传、无内含子、进化率高以及无基因重组等等。由于线粒体结构功能和遗传的重要性和特殊性，线粒体dna在系统发育学、分子进化学和遗传学等方面得到了广泛的应用。

目前，对线粒体dna序列进行测序主要分为三大类方法：第一代测序、第二代测序和第三代测序。第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999％，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。第二代测序技术(又称“高通量测序技术”)大大降低了测序成本，并且大幅提高了测序速度，但是读取片段(200bp–500bp)让其应用有所受限，且准确性也比一代测序技术低，主要原因就是来源于碱基的替换。第三代测序技术与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序速度很快，每秒可读10个dntp，但是其测序错误率比较高，达到15％，这几乎是目前单分子测序技术的通病。

对线粒体基因组进行测序时，①如果使用第一代测序技术，会造成测序成本过高，工作量太大等问题，严重影响了其真正大规模的应用，因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法；②如果使用第二代测序技术(又称“高通量测序技术”)，会造成其测序的准确性降低，而影响最终结果。③第三代测序技术与前两代相比，其也存在测序错误率比较高的缺点。可见，这些测序技术都不能非常理想地获得线粒体基因组。

目前，绒螯蟹分类在学术界依然有很大争议，对绒螯蟹的线粒体dna进行准确测定以准确定位其分类是很有必要的。为此，开发一种快速且准确性高的测序方法也是很有必要的。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种精准测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法，该方法基于高通量测序，具有快速、准确性高的优点。

本发明的另一目的是提供一种中华绒螯蟹线粒体全基因组dna序列，根据该序列可准确定位中华绒螯蟹的生物学分类。

作为本发明的第一方面，本发明提供了一种精确测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法，该方法基于高通量测序，包括以下步骤：

(1)提取所述中华绒螯蟹肌肉组织中的全基因组dna，构建基因文库，利用第二代测序技术(高通量测序技术)进行测序；

(2)通过参考近缘物种线粒体全基因组序列对高质量的测序读段进行筛选，除去核dna片段，然后进行线粒体基因组的拼接，选取最优的拼接结果，再对拼接好的线粒体基因组的编码蛋白基因、rrna和trna进行预测注释；

(3)将拼装好的线粒体基因组序列和近缘物种线粒体基因组序列比对，根据保守区，再参考所述近缘物种线粒体全基因组序列设计引物，对对应的第二代测序样品进行pcr扩增测序，pcr产物利用第一代测序技术进行，最后对拼接的线粒体基因组序列进行校正，即可获得中华绒螯蟹线粒体全基因组序列。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(1)中提取所述中华绒螯蟹肌肉组织中的全基因组dna使用的是苯酚/氯仿法。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(2)中所述近缘物种是日本绒螯蟹(eriocheirjaponica)、肉球近方蟹(hemigrapsussanguineus)、伍氏厚蟹(helicanawuana)和中华绒螯蟹(eriocheirsinensis)。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(2)中线粒体基因组的拼接是利用novoplasty拼接软件进行多kmer参数的拼接。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(2)中对线粒体基因组的编码蛋白基因、rrna和trna进行预测注释分别利用blast软件、barrnap0.4.2和trnascan-sev1.3.1软件。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(3)中所述pcr扩增所用引物包括以下19对引物：

第1对引物：f:seqidno.1和r:seqidno.2，

第2对引物：f:seqidno.3和r:seqidno.4，

第3对引物：f:seqidno.5和r:seqidno.6，

第4对引物：f:seqidno.7和r:seqidno.8，

第5对引物：f:seqidno.9和r:seqidno.10，

第6对引物：f:seqidno.11和r:seqidno.12，

第7对引物：f:seqidno.13和r:seqidno.14，

第8对引物：f:seqidno.15和r:seqidno.16，

第9对引物：f:seqidno.17和r:seqidno.18，

第10对引物：f:seqidno.19和r:seqidno.20，

第11对引物：f:seqidno.21和r:seqidno.22，

第12对引物：f:seqidno.23和r:seqidno.24，

第13对引物：f:seqidno.25和r:seqidno.26，

第14对引物：f:seqidno.27和r:seqidno.28，

第15对引物：f:seqidno.29和r:seqidno.30，

第16对引物：f:seqidno.31和r:seqidno.32，

第17对引物：f:seqidno.33和r:seqidno.34，

第18对引物：f:seqidno.35和r:seqidno.36，

第19对引物：f:seqidno.37和r:seqidno.38。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(3)中所述pcr扩增的体系总体积为50μl，其中包括正反向引物各2μl，dna模板2μl(浓度为50ng/μl)，dnase-free去离子水19μl，taqpcrmastermix25μl。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(3)中所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；循环结束后，72℃在延伸10分钟，10℃终止反应。

作为本发明的第二方面，本发明提供了一种中华绒螯蟹线粒体全基因组dna序列，如seqidno.58所示。

本发明还提供了一种用于扩增中华绒螯蟹线粒体全基因组dna的引物，该引物包括以下19对引物：

第1对引物：f:seqidno.1和r:seqidno.2，

第2对引物：f:seqidno.3和r:seqidno.4，

第3对引物：f:seqidno.5和r:seqidno.6，

第4对引物：f:seqidno.7和r:seqidno.8，

第5对引物：f:seqidno.9和r:seqidno.10，

第6对引物：f:seqidno.11和r:seqidno.12，

第7对引物：f:seqidno.13和r:seqidno.14，

第8对引物：f:seqidno.15和r:seqidno.16，

第9对引物：f:seqidno.17和r:seqidno.18，

第10对引物：f:seqidno.19和r:seqidno.20，

第11对引物：f:seqidno.21和r:seqidno.22，

第12对引物：f:seqidno.23和r:seqidno.24，

第13对引物：f:seqidno.25和r:seqidno.26，

第14对引物：f:seqidno.27和r:seqidno.28，

第15对引物：f:seqidno.29和r:seqidno.30，

第16对引物：f:seqidno.31和r:seqidno.32，

第17对引物：f:seqidno.33和r:seqidno.34，

第18对引物：f:seqidno.35和r:seqidno.36，

第19对引物：f:seqidno.37和r:seqidno.38。

本发明的方法是在第二代测序的基础上，快速测定中华绒螯蟹线粒体基因组。将拼装好的线粒体全基因组序列和参考物种(即，近缘物种线粒体全基因组序列)线粒体全基因组序列比对，然后使用第一代测序技术对异常序列片段修正，最终获得非常精确的获得中华绒螯蟹线粒体基因组序列。

本发明的方法结合了第一代和第二代测序技术的优点，该方法克服了第一代测序技术的工作量大、成本高、耗时长等缺陷，并且克服了第二代测序技术的读取片段受限、测序错误率高等缺陷，解决了其不能真正大规模的应用的缺陷。利用第一代测序技术的优点针对性地修正异常中华绒螯蟹线粒体基因组序列，显著提高了测序的准确率。

与现有技术相比，本发明具有如下优势：

本发明的中华绒螯蟹线粒体全基因组dna的序列准确性高，为中华绒螯蟹进行准确的生物学分类奠定了基础；

采用本发明的引物可以准确定位所需线粒体基因片段，来修正线粒体基因组序列，克服了利用第二代测序技术会经常产生的overlap、gap以及错误序列；

减少引物设计等繁琐步骤和设计成本；

相较于第一代测序，本发明的测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法省去了大量的人力资源和物力资源，并且也节省了大量的时间；

相较于第二代测序，本发明的测定中华绒螯蟹线粒体全基因组序列的方法测序准确率要更高，达到了第一代测序的准确率，且可以准确定位和修正错误序列，科研结果更加准确可信。

附图说明

图1是本发明的中华绒螯蟹全基因组dna环状图。

图2是本发明采用illuminahiseqtm平台测序的原始数据碱基组成分布例图。

图3是本发明采用illuminahiseqtm平台测序的原始数据碱基质量分布例图。

具体实施方式

本申请发明人在获得该dna序列过程中，首先利用第二代测序技术对构建的中华绒螯蟹全基因组dna的基因文库进行测序，然后通过参考近缘物种线粒体全基因组序列对高质量的测序读段进行筛选，除去核dna片段后进行线粒体基因组的拼接，选取最优的拼接结果，再对拼接好的线粒体基因组的编码蛋白基因、rrna和trna进行预测注释；最后将拼装好的线粒体基因组序列和近缘物种线粒体基因组序列比对，根据保守区，再参考所述近缘物种的线粒体全基因组序列设计引物，对对应的第二代测序样品进行扩增，pcr产物利用第一代测序技术进行测序，最后对拼接的线粒体基因组序列进行校正。本发明的方法可快速、准确地获得中华绒螯蟹线粒体基因组序列，为准确定位其生物学分类奠定了基础。

中华绒螯蟹线粒体全基因组dna的序列如seqidno.58所示。

ttacatgcaacggaattgcaccgtttcttaaaagatcaaaacttcttatgctctttacatcagcatataaattattttcaaaccctagtgatttacacatctttaaacttgcaatttaatattatttttatactatagggcctaataaaggaatctcattcgtctacagatttacaatctgccgcttacaactcagccactttattaatttttaaataaatagtatactcgatgactgaaaggtaagtatagatcttttaaatctaatatagtaatttaacatttacttcgagtaaggaattagttaaaatataataacatttgcttgtcatgcaaaagtcatctttaagatactccttaaatttcagttttatttgttttatggtgtagataacacattgtattttcgttacaaaaccgaaactaatgtttctagaacattataatactttgcccacagataatatttatctcttttgcagcttcaatgcaatattctatataaattatataagctacttatattaatctagctttacgttatacgccattaactaaatttaaatttaaaattaacatatttaaaggaaatcaatgtaaaaatagaactaaatattctcgaacttttcctgacctacaagaatataaactactgacgaaaatcccatgctgacttaaactatatatgtataaagtataagctgctctgaaaaaagaaagaaatataattcccattactgtaaatgtccttcaccttattaaactaataatcaacctaatctccccgaatagatttaaagtagggggagcagccatattacccactctaaataaaaatcatcacaaacctatcctaggtataaaatttaataaacccttactaactaaaagactacgcctaccaactcgctcgtatactatattagccaaacaaaataatccagaagaacataacccgtgtccgactattactacaacagctcctattagtcctcatcatctaaaaatcattagaccacatagtactattctcatatgaacaaccgaagaataagcaatcaaggactttatatctacctggcgtagacacaaaagactcactactactccccctactaaactaattctaacccataacgacgaaaaattcaagctaattttctgaaatatcaataacacccgaatcaaaccatacccgcctaactttaataaaactcctgctaaaattatagaaccagcaaccggggcttctacgtgagcttttggcaaccataaatgaaatatatatatcggtaatttaactaaaaaagccatcacccttctaaaatatcaaatactgtttgcccagctaacttctaaaataagatttcttaatattataactaacctatattcttttatataaatatacaataaagaccccaataaaggtaaagatagtgacaaagtataaaaaagtatataaactccagcttgaattcgttcaggttgatatccccatccaagaatcaaaattaaagtgggaattaacgatatttcaaatataatataaaacaacaaataatttaatgaagaaaatgttactaaaagcctaaataaaagtactaaatttaccaagataaacatacccctaaaattatttattatttttactcgctccctcgaaataacaataagaaatataattcaaacacttaaataaactataatataactgacataatctattcctaaattaaatcccaaactatatatatatatattatgaaaacatcttaaaccaactaaaaatcttaataatcctaatcctatctgagctgactttcagtcatcctttaattttatcaatagaactacaggtaacaaaaactttaacattccagaagattaaatcttttaaaataatcatttccatgcctacgaacaataagaactaataaagataaaccaagagctccttcacatacagctaaagttaaaaaaaataaagaaatgtaaatttccctaccaactatagacaactgtaaccttaataatcaaaaaactccaagcattataaattctaatcttaacaacgaatttaataaatgtttattataagaaataaatctccataaaccacaaaaaattataaataccgccccaaacactctcaaaaatctaaaatttatcattagttttaatagttaatttaaaaaactaaaacattggtgttaaaatcctaaacatgaaattttttcttaaaactcaagagaattattatctctattatttttatattaacaatccccttattaattgtttcttccttcttttttatacaactctctcaccctttggcaataggccttatattatttattcaaacagtcttaatttcaattacaattggagtttccaacttttctttttgattttcttatattctgtttttagtgtttttaggaggaatactagttttattcatttatattgcttctttagcttcaaatgaatcattttctttttctttaattacttttttctttgctattattttaacaggtttaattatctttattttattatttttagatcctatcttaatttctcctaattcttcatccctttcaacatcatcattaaaatatttagtctcgaccccattcattgttaattgagtttataataccccatctataatatttactatttttattgtctcctatctactacttatattaattgttgttgttaaaattattaatttgtttaaaggcccacttcgtcttatattataatgacaacacctatacgcaaatcccaccctttatttaaaattgccaatggagcattagtagatatacctttaccaagtaacatttccacattttgaaactttggttccttgctaggcctttgtttagttatccaaatcgcgacagggttattcttagctatacactactctgctcacgtagatctagctttttctagagttgcccacatttgtcgtgacgtaaattacggttgaatactacgaacccttcacgctaatggggcctctttcttctttatttgcctctaccttcatattggacgaggcatctactttagatcttatataaaccttcatgcttgaatagtaggggtagtaattttatttataattatagcgactgcatttttaggctatgttctaccatgaggacaaatatctttttgaggcgctacagttattacaaatttattttccgctatcccatttatcggtaccgacctagtacaatgaatctgaggagggttttctgttgataatgccactttaactcgatttttttcattccattttattttacctttagtagcatcagcattttctataattcacattctatttttacaccaaacaggagctaataaccccttaggtatttcaagacaaactgataaagtaccatttcatccttactttacatttaaagatattgttggatttgtagttatattaacagccctaattttattaactcttctagccccatattttctaggagatccagataattttattcctgcaaaccctttagtaacccctcctcatatccaaccagaatggtattttctttttgcttacgctattttacgatcaattcctaataaattaggaggagttgtagcattagccgcttcagtggccattcttataattttaccatttacacacacttcaaaatttcaaagattagcattttaccccattaatcaaatgttattctgaacctttgtagtcattgtagtactattgacctgaattggagcacgcccggttgaagacccttatgtcattactggacagattttaaccgtatcctatttcttgttctatattattaatcctcttattcttatttgatgagataacatacttaaatgactatttagtttaaaaaaaacaaatgttttgaaaacattaaataagaataaattcttaatagtcgagtgtttcttaaataactatttacatttataaaattttaatatcttcctataaacttaatttttactcccattacttctaatatagtgcctgataaaaggatagttttgatagaactaattatgtaatttccagttacctatgttattaaaatctttattaaaaagataagctaaataagctaatgggctcataccccgtaaatgaaagtttaatctctctctttttaatcgcttttcctacctcttatttctttttcctaataacactaatctcagggtcaattatctctatttcctcaacttcctgatttggagcttgaattggattagaactaaatctcatatcatttattcctcttattgcttttaaaataaacccacttttttctgaagcagctttaaaatattttcttattcaggcattaggatctgtgctatttatttcttcaagattccttttaatgtctttttattcttttagacttttatctatttttttagccctcttattaaaactaggaggagcccctttccacttctgatttcctcaagttatagaaggtctaaaatgaccacaaatcttccttctatctacaattcaaaaactagcccccttaaccttaatttcttacctaataaacaacgaaatcttaattaaaattacaattttttcagctattttatcagctttaatcggaagacttggtggtttaaacttaaccctattacgaaaaattattgccttttcttcaattaatcacttatcttgaatattaatagcaatctcaattagagactcctcatgacttttttatttttttatttattcccttattgtactttctattaccagagtatttcataaattacaaaccttctccctttctatactaattcaatctgatcaaaatagaacacttcacgctactattatttcacttaattttttatccttgagtggtcttccacctataacaggatttattcccaaatgaattgttattcaagttatattaaatttaaatatatttatccccttattttttcttcttgtttctgctttgattactttatatttttatttgcgaatcatcattaccataatcttaatattcaaccctattttaaattttaatatgaaatataaatctctaacagattccccatcttctctattttttaaatcctccttcaacttttttggtcttctactaccagtatatttcacctttatctagaattttaagttatttaaactaaaagccttcaaagctttctaaaaaagtattaaccttttaaattctatattttaattattatgcaacgatgacttttttctacaaatcataaagatattggaacattatattttattttcggtgcttgggccggaatagtaggaacatcattaagattaattattcgagctgaattaagacaaccaggcagactaattggtaacgatcaaatttataatgtagttgtaacagctcacgcttttgtaataattttttttatagtaatgcccattataattggtggatttggcaactgacttgtccctcttatactaggggccccagatatagctttcccacgaataaacaatataagattctgacttttacccccttctctctctcttttacttacaagaagaatagtagaaagaggagttggtactgggtggactgtctacccacctttagcagcagccatcgctcatgctggagcatcagttgatcttggtatcttctctctacatcttgccggagtttcctcaattttaggagctgttaatttcataacaacagttattaacatacgatcatatggaataacaatggatcaaatacctctttttgtttgagctgtatttattactgctattttacttctcttatcccttccagttttagctggagctattaccatactgcttacagatcgtaacctaaatacgtcatttttcgacccagcagggggaggtgacccagttctataccagcacttattctgatttttcggtcacccagaagtttatattctaattttgcctgccttcggtataatctctcatattgtaagtcaagaatcaggtaaaaaggaatcttttggaactttaggtataatttacgctatactagctattggaattttgggctttgtagtatgagctcatcatatatttacagtaggtatagacgtagatacccgagcttactttacctcagccactataattattgctatccccaccggaattaaaatctttagatgactaaggaccttacatggaactcaaataaattattcaccatctcttctatgagctttagggtttatctttttatttactattggaggtctgacaggagtagttttagctaattcctcaattgatattattctccatgatacttattatgttgttgcccactttcattatgtactctctatgggagcagttttcggaatctttgctggagttgctcactgattttctctaataacaggtttatctttcaaccctaaatgactaaaaattcactttttagtaactttcgtcggagtcaatttaacattttttccccaacactttttaggattaaacggcataccacgacgatactctgattatcctgacgcctatgcaacttgaaatattgtatcatctataggttctataatttcttttgtagccgcattaggattcttattaatcgtttgagaagcatttgtttctaatcgcccagtaatcttttctccttttctgccctcttctattgaatggaaacatgcttatcctccagccgaccattcatatatggaaatcccactaattactaacttctaaaatggcagacagatgtgtaggatttaagctcctataaggaagaataatttcttcttttagaataacttatggcaacatgagcgtatttaaattttcaagacagagcttctcctcttatagaacaattaattttttttcacgatcatattatattagtgattgtgttaattgtaacatttgttggttatataatagcaacattgtttttcaactccctcattaaccgctatatattagaaaatcaaccaatcgaagtaatttgaacatcagttccagcttttattttaatctttattgctttaccatcccttcgcttactttatcttttagatgaagtaaacaatccttctataactcttaaaacaattggccaccaatgatattgaaggtatgaatattcagatttccttcaagtagaatttgactcatatatagtaccatctaatgagctggaagtatcagggttccggctactagacgtagacaatcgtaccgttcttccaataaatactcaaatccgagttctaattacagctgcagatgtcatccattcctggacagtcccatccttaggtattaaagccgatgcaattcccgggcggctaaatcaatcaaggtttttaatcaaccgacctggactattttacggtcaatgttcagaaatttgcggggcaaaccacagatttatgcccattgttattgaaagaacttctattaactcatttctaaattgaatttctctatcaattgaagcgtcaccctaactcatccttagttttactaatttttgggtgaaacaattccttctgtgaattactatttatgccacaaatagcacctatttattgactatttatatttttcttttttttagccagattcctattatttttcgctcttaattacttcattaaacctttttataaagttaattttcttcaagataataaaaaacctttaatttataaacattgaaaattataacaaatttattctcaatttttgaaccttcttcaagaatctttaatttatcgataaattgaatctcaactatcctaggattgatattcttaccttatatatactgagcatccccttctcgttgatctttactttggggaaaaattatttcaaccttgcataaagaatttaaagctcttttacagccttcacataatggagcttctatagtattcattgctttatttaggttaattgtatttaataattttctaggcttattaccttatgtatttactagctctagtcatatggtaataacattatctttatctttgcccttgtgaattactttaataacatttgggtgaattaaacacactaaacatatatttgcccatttagttccccaagggacgcctttcgctttaatgccatttatagtgttaattgaaaccattagaaatgtaattcggcctggtaccttagcaattcggctagccgctaatataattgccggtcatttacttttaaccttattaggaaatactggcccttcattatcaacctccatcctattcattttattgtcagctcaaatactcctactaatcttagaatctgccgtagctattattcaatcttatgttttcgctgttttaagaactctctacactagagaaattaactaatgacatcatcacacggctttcatccttatcatttagtagatattagaccctgaccaattactgggtctattagagctataatactaaccactggtttagtaaaatgatttcaccaacacaatataaaccttttaattttaagatttattgcaactttgttaactataattcaatgatggcgagatattacccgtgaaggtacttaccaaggatcacacactttaacagtaataaaggggctacgctgaggtataattttatttattgtatcagaagttttatttttcttttcttttttttgagcttttttccatagaagactatctcctgctgtagaaattgggatatattggccgccattaggtattcaaccttttaaccctttccaaatcccccttctaaacactacgattcttctatcgtcaggtgctacagttacttgggctcatcacgcaattctagagggtaactactctcaagctgtacaaagactaggtttaactattatcctaggtatttattttacaatgctccaagcatttgaatatattgaagcttctttcactattgccgactcagtctttggttcaacattttttgtagcaactgggttccatggattacacgttatcattggaacttcatttttatttgtttgttttattcgactttataaatgtcacttttcttcttctcatcatttaggatttgaggcagctgcttgatactgacactttgttgatgttgtttgattattcttatatattttcatttattgatgaggcggataatttttttaatataataagtatatctgatttccaatcagaaagtctaacttttagaaaaaataatctttacaatattgacaatttcagttattactctcatggtttcatatatcgttataactttagcgaccctcttatctaaaaagacaattatagatcgagaaaaaaattctccgtatgaatgtggattcgatcccaaaggatccgcccgtctacctttttctctacgcttttttttaattgccgtaattttcctaatctttgatgtagaaattacacttctgctgcctattgcttctacattaaacctaaccaatatgttttcttgattttttacaagtttaatttttttattaattttgttatttggtctttattatgaatgatcacaaagtgctctagattgatcttagtaagaccatagtcaatatatgacgtatgagttgcattcataaagagttttctaaactggttttaaaaattagaaagcgaataattgcatttagtttcgacctaaattttagactttagtcttctaattttggtggaaaccaaaaagaggtatatcactgttaatgataaaattgagttcaaactcctaccaagaagggatattatgctaaaggcagaaagcttctaactttttactaagcggttaaattccgtttatatccctttgttatatatatgtacatatctatcaacctagccctagcactttgtttttatagtttaaaccaacccaaaacattggtcttgtaaaccaataatgaattattttctaaaaactttcagaaaaaaagagtaactctttatctttaattcccaaaattaatattttttaaactatttcctgaatttattactctaaattttatgctgctagacaaaaacaaaacattttaaatctaacaaaaaaaatcaaataattaatagaaacaggaagataactttttcatgctaaatatatcaatttatcataccgcagtcgaggtaaagtacctcggactcatacaaacccaaaagctactattacactcttaaaataaaacattactctgaacggccccctacccaaaaaaaaaataacaaataaaaccctcatgaatagaatacttgcgtattcagctataaaaattaatgcaaacccgccagccccgtactctgtattaaagccagagactagctcagattcaccttcagaaaaatcaaatggagttcgattagtctcagctaaacatgacctaaatcacaccattcttaaaggaaatctaattacaacaaatcaaaaataattttgatatttattaaacaactctaaattaaatccaccaattaatattacaaaagataataaaattaaagctaacctaacttcataagaaatagtttgagctaccgctcgcaaagaacctaataaagaatatttacaatttgatgatcatcccgccactatagttgaatacacccctacacttaaacaacacaaaaaaaacagaattctcagattaaaccttattaatccagtttcataaggtaaaactgatcatactaataaagaaataaacaaactaaatacaggacataaatagtaaactaaaaagtttgatatagtaggaataatttgttccttagtgaaaagctttactgcatcagaaaaaggctgtaaaattcctatatagcctactttatttgggcctttacgaatttgaatataacctaaaatttttcgttcaagtaaagttacaaaagccacgccaattaaaacacacactattaataccaaaaaattaactatctctacaattattaaagtcacaaaacaattagattactaataatttaactatttatagaattgctctattttataggatcctaaatccaacacatattatctgccaaaatagtaatcattatataaaataattttaattatttaatcctttcgtactaaaataatttttctttattaaaagatagaaaccaacctggcttacgccggtttgaactcaaatcatgtaaaattttaaaggtcgaacagacctacttatataactgctacaattataaagatattttaattcaacatcgaggtcgcaaacttttctttcgataagtactcttaagaaaaataacgctgttatccctaaagtaacttaaacttttaatctttaattaggatcatttaaaattttaatcacatataagtgtacttaatgttaagcagttaataatcattttactcttatcgccccaataaaataaattcaatttacaaaatctttataacctaaaatttgactatataaaatttaatattaagctttatagggtcttatcgtccctttaatacatttaagccttttcacttaaaagtaaaattcaataaacaatataaagacagatcttcttttgtccaaccattcatacaagattccaattaaaaaactaacgattatgctacctttgcacggtcaaaataccgcggccatttaatactatcaatcagtgggcaggttaaactttttataacttcaaacagacatgtttttgataaacaggcaaagaagttatttttgccgagttcctttattccgccctatcaattttaaacaatatttattatttaaatgttttgctttaataaaaaacttttactaataaaatcattataacttaactctttatatttaaattaattttttaatactccaaaaaagtttatataaatattatccaattttaatttagctagaacactttataaatatagctacttttaagcctaattcaccaattaaactattttaaactatttatcattttaattataagaagctaatccctcctacacttaaattttacatcttatcaacgtaaaaattaaattaaatttactttttaaaaaactagatataataaaactcgactagcgtttcacctttaattttatattaaaaatttattttctacaaaaaattttttataaaattagctatattttatttcgagatatttaatttttattaacttatataaattttccctgatacacaaggtacaatatttaaaattttttacttcaaattttcttgctttcctttacagtactcttaactatagtttataaattgtgtttattaaaaattactagcatgaacaaattacaaattatttttcataaatataaaattttcaaatttatttaacaagtcattaataaatagatgggtaattattaatttataaagaaaatatacatatcctcatctttactagatacactttccagtacatctactatgttacgacttatttcacttataaatgaaagcgacgggcgatatgtacacaatttagaacttatatcttgttagcttattaaactaaaaatacaatcaaatccatctttataataatattatcttattaatccgcagtaaagtaatttactgtaacccattttaccttgcttattggctgcaccatgatctaattttactaaacaactaaatttaataatttttcctttaagaattatctgataatgatggtatacaaactgttagaattactaaagcaagtaagatttttcgtggtttatcgattctaaaacaggttcctctgaatagattaaattgccgccaaattttttaaattttaagtatttatcttttactaattcagttttatattaaatttattttagaataatagggtatctaatcctagtttatttctaaacttttttagcttcaattataattttactccatacataataatatcctaattttaccttttattacctgtatgagatttttaatttaatcatctaactataaccttagaatttttactcaatcttaaagtataaccgcgaatgctggcacaaatatatatcagattttaatattattactatatcacaccttcatgtataattttataatattttatgctgagacaataaaggtttataattttatttcactcgaataccaatttaatatttaattaaattgtttaaatcacactttaattttcatacaattttaataataatgtaaaaacttaagccaaaatcaaacatttgtcgtgattgcaaataataactttaaaaaacttaaatatactatatataacataaaaatgagaataagcttatacttaaagtataacttatacatcttaagcgccacaagctaacgttttaatattttaaactatttaagttttgttataactaatattgctacaaatatatttattatctacacaaaaacaaacaatataatcaccaacccaaccacaaaaatttttataaacactttaatattattaagttgtaactcatttaacaacctaaaatatttcttaaacaaaaaatacatcccctggccaccaaaatattcaaatcaccctttgtctcctaatttttcaacacctaccccactaatgagactagaccctctaattttttttgtcctaagaaaaggtataaatcatatagacccccttattactactatcttataattattaatagattttaaattgtaacttacatttaataaattaaatatataacctataactccccctgctaatcttacccccaacactatatttttcattattacattcaaacaaattatataaggctctgggaaaataacccaagatagaacagctcctataaaaatagctcttacacctagtaaaatcatagaatttcttataattttatcctcatccctaatatttattataactcttaaatttgaattacctcttaacctataaaaaattagacgtatagtatacataactgttaaccctgtagctaaaatatataacagtaaagaaataaaattaatccatctcataaaagccacctctaaaattatatctttagaataaaaccctgctaaaaaagggaacccacataaggctaaatttgaaactcttataaaagacactcttaacggcataaatttaattaaaccacctatacatcgaatatcctgataattgccaaccctatggataataatacctgcgcatataaataacaatgctttaaataatgcatgactcagcagatgaaaaaaagaaagatcagggtatcctaaagctaaaatacttaacataacccccaattgacttaacgttgataaggcaataattttttttaaatcatattcaaaattggcccctaatcccgccataaatatagttaagcaagaaataattaataatattccttggattttagaaccttctaacgcaccactaaatcgaattattaaatacaccccagcagttactaaagtagaagaatgtactaaagcagaaacaggagtaggagctgctatagcggcaggaagccatgctgagaaaggaatttgagcacttttagtcatagctcttaacattaacaaaaacttaaacaaaattcactcagtatctataatatagtaagaataaataacaaaatttcatctacctaacctggccattagtccaatactaagtaaaatagcaacatcacctactcgattagataagatagttaacatcccagcattagcagacttttcattttgataaaaaattactaaagcataagaaactaaacctaatccatcccatcctaaaagaatacttaccaagttaggtcttaaaactattatagccatagataaaacaaacattaaaactaaatatataaatcgattaaagtttttatcctccttcatatatctacctctataatacatcacacttccagaaataagcaatacaaaacacaaaaaaagtatcgaaattcaatcaaaaattaaaacaaacaccactgataatgaatttaatcttgctaaatcccattcaattacactagtaacaccactaaataattttattaaagaaactgttccacaaactaaagaccccgctcatagcccaagtattctaatcttatgtatataaattattcaaaccattatttaaatattaaattattaatttaatacaaaatacagtaacatttctaccaatggtacaaaacaattagtagtaattaaatctaaataaatcaaagcaaatcgatttgcacgataaatcttttcaacgtaactgaaatgctgttctattttagctctgctttgacactatcatattatatttccaatctactttacatttaaataatttattaaaaaaagctactaaaaatattaagaaatgataatactattatattatacaattttatttttctttatttatacggaggtatataaggtatatataaatatatcacattagatataagtaaataatataaacaaatcaaatatataaaaattaaatatgtatattcgcctccacaattataccccatccaatataatacaggatagataaaacattaaaattataaaagggtaaaattataaataaatagaagtatataatgtcttagtttatatggaacattgaaacattttatataaaagtaaaaattatatgtaacttcattatataaatatatgatttatactatttttatttattctatgggttgaaaaaaagtagtagtctcaaccctagaccctaattcctctagaggggaaacgggtctagaccgttgagactactactataataggggcaaagaacattatattatatttaggtaaatataaattaaatatttaattatactaacaaataatttaacattaatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatgtatatatgtatatgtatatatgtatatgtatatatgtatatgtatatatgtatatgtatatatgtatatgctttgtactctacaatatataatatctactatatac(seqidno.58)。

引物1的上游引物序列如seqidno:1所示：

catgcaacggaattgcac(seqidno:1)。

引物1的下游引物序列如seqidno:2所示：

gggtatggtttgattcgg(seqidno:2)。

引物2的上游引物序列如seqidno:3所示：

ggactttatatctacctggcg(seqidno:3)。

引物2的下游引物序列如seqidno:4所示：

gtatgtgaaggagctcttgg(seqidno:4)。

引物3的上游引物序列如seqidno:5所示：

gagctgactttcagtcatcc(seqidno:5)。

引物3的下游引物序列如seqidno:6所示：

gctaagaataaccctgtcgc(seqidno:6)。

引物4的上游引物序列如seqidno:7所示：

tctcgaccccattcattg(seqidno:7)。

引物4的下游引物序列如seqidno:8所示：

gtgctccaattcaggtcaa(seqidno:8)。

引物5的上游引物序列如seqidno:9所示：

ccccatattttctaggagac(t)c(seqidno:9)。

引物5的下游引物序列如seqidno:10所示：

agtacagatcctaatgcctg(seqidno:10)。

引物6的上游引物序列如seqidno:11所示：

aagctaatgggctcataccc(seqidno:11)。

引物6的下游引物序列如seqidno:12所示：

taggtggaagaccactcaagg(seqidno:12)。

引物7的上游引物序列如seqidno:13所示：

ccttgagtggtcttccaccta(seqidno:13)。

引物7的下游引物序列如seqidno:14所示：

ccaagatcaactgatgctcc(seqidno:14)。

引物8的上游引物序列如seqidno:15所示：

tattttcggtgcttgggc(seqidno:15)。

引物8的下游引物序列如seqidno:16所示：

agattataccgaaggcaggc(seqidno:16)。

引物9的上游引物序列如seqidno:17所示：

ctacatcttgccggagtttc(seqidno:17)。

引物9的下游引物序列如seqidno:18所示：

acgctcaggttgccataaa(g)(seqidno:18)。

引物10的上游引物序列如seqidno:19所示：

tggcagacagatt(g)tgtagga(seqidno:19)。

引物10的下游引物序列如seqidno:20所示：

aagatcaacgagaaggggag(t)(seqidno:20)。

引物11的上游引物序列如seqidno:21所示：

c(a)tccccttctcgttgatctt(seqidno:21)。

引物11的下游引物序列如seqidno:22所示：

taactgtagcaccg(t)gacgat(seqidno:22)。

引物12的上游引物序列如seqidno:23所示：

ttga(g)ccgccattaggtattc(seqidno:23)。

引物12的下游引物序列如seqidno:24所示：

gaccaatgttttgggttgg(seqidno:24)。

引物13的上游引物序列如seqidno:25所示：

caaactcctaccaagaaggg(seqidno:25)。

引物13的下游引物序列如seqidno:26所示：

gtgtgttttaattggt(c)gtggc(seqidno:26)。

引物14的上游引物序列如seqidno:27所示：

ctgcatcagaaaaaggctg(seqidno:27)。

引物14的下游引物序列如seqidno:28所示：

acctgcccactgattgatag(seqidno:28)。

引物15的上游引物序列如seqidno:29所示：

gaaaccaacctggcttacg(seqidno:29)。

引物15的下游引物序列如seqidno:30所示：

ttgtgtacatatcgcccgtc(seqidno:30)。

引物16的上游引物序列如seqidno:31所示：

ctcgactagcgtttcacctt(seqidno:31)。

引物16的下游引物序列如seqidno:32所示：

ccagcattcgcggttata(seqidno:32)。

引物17的上游引物序列如seqidno:33所示：

tataaccgcgaatgctgg(seqidno:33)。

引物17的下游引物序列如seqidno:34所示：

tagccttatgtgggttccct(seqidno:34)。

引物18的上游引物序列如seqidno:35所示：

agggaacccacataaggct(seqidno:35)。

引物18的下游引物序列如seqidno:36所示：

cggggtctttagtttgtgga(seqidno:36)。

引物19的上游引物序列如seqidno:37所示：

catgcctgaatagtaggagt(seqidno:37)。

引物19的下游引物序列如seqidno:38所示：

gtgctccaattcaggtcaat(seqidno:38)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。具体实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施的，给出了详细的实施方式和操作过程。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。除非另有说明，百分比和份数按重量计。

实施例1

本实施例所使用的中华绒螯蟹样品于2017年10月至2017年12月间采自长江流域，具体地点：江苏省镇江市，经纬度：119.27°e，32.11°n。样品采集方式为地笼抓捕或者人工捕捞。取出肌肉组织，避免其他组织污染，并保存于–40℃的冰箱中待用。

1.1dna的提取：本实验采取经典的酚氯法进行dna提取，具体步骤如下(以下试剂均购自国药集团化学试剂有限公司)：

①取样品肌肉组织50mg左右，晾干酒精，剪碎处理，并放置1.5ml的离心管中；

②向离心管加入500μl缓冲液(100mmol/lnacl；10mmol/ltris-cl，ph8.0；1mmol/ledta，ph8.0)，50μl10％sds溶液及10μl20mg/μl的蛋白酶k，然后立刻使用研磨棒磨碎大块肌肉组织，56℃水浴消化(一般3个小时左右)，直至离心管中溶液清澈；

③向离心管中加入250μl的饱和苯酚和250μl的氯仿/异戊醇的混合液(体积比为24:1)，然后轻摇10分钟，室温13000r/min离心8分钟；

④吸取上清液至新离心管中，并重复步骤③一次；

⑤吸取上清液至新离心管中，向离心管中加入500μl的氯仿/异戊醇的混合液(体积比为24:1)，然后轻摇10分钟，室温13000r/min离心8分钟；

⑥吸取上清液至新离心管中，并重复步骤⑤一次；

⑦吸取上清液至新离心管中，加入50μl3mol/lnaac溶液和1ml的冰无水乙醇，放置于-20℃冰箱1小时，取出离心13000r/min离心8分钟，得到核酸沉淀；

⑧使用75％的冰乙醇洗涤沉淀两次；

⑨最后，使用冰无水乙醇洗涤沉淀，待沉淀自然干燥后，加入50μl的te缓冲液溶解，并加入0.2μl的核糖核酸酶a(浓度为0.05mg/ml)去除rna。

1.2dna的质量检测：

按照1.1的方法从肌肉中提取dna，取2μldna样本在紫外分光光度计q5000(美国quawell公司)上进行浓度测定。测得dna浓度要求od260/od280比值在1.8～2.0之间，od260/od230比值在1.8～2.2之间，以上两个比值可以判断所提取dna纯度的优劣。如果超出上述范围，则可认为提取dna纯度不符合要求，需要重新提取或再纯化。将质量检测合格的dna样本根据测定的浓度，用dna溶解缓冲液进一步稀释到浓度50ng/μl，备用。

1.3基因文库构建，高通量测序：

样品基因组dna检测合格后，用物理方法(超声波)将dna打断，然后对打断后的dna进行纯化构建测序文库，步骤依次为：dna末端修复，3’端加a，连接测序接头，琼脂糖凝胶电泳法回收目的片段，对目的片段进行pcr扩增，最终建成测序文库。测序前对构建好的文库进行质检，质检合格后采用illuminahiseqtm平台测序。

1.4原始测序数据质量评估：

利用生物信息统计学方法，对所有测序reads的碱基分布和质量波动进行统计，从宏观上可以直观的反映出测序样本测序质量。图1是原始数据下机的碱基分布图，该反映了高通量测序的a、t、g、c4种碱基的分布情况，碱基越均匀代表测序结果好。图2为原始数据碱基质量分布图，一般来说，质量值超过30(测序错误率小于千分之一)的碱基比例越多，高通量测序的数据质量越好。

1.5线粒体基因组的拼接和注释

基于参考物种线粒基因组序列(日本绒螯蟹(eriocheirjaponica)(fj455505.1)、肉球近方蟹(hemigrapsussanguineus)(kx456205.1)、伍氏厚蟹(helicanawuana)(kx344898.1)、中华绒螯蟹线粒体基因组序列(eriocheirsinensis)(kp126617.1))，对于高质量的测读段进行过滤，除去核dna片段序列；利用novoplasty(https://github.com/ndierckx/novoplasty)拼接软件进行多kmer参数的拼接，选取最优的组装结果；利用blast软件对每个个体的线粒体基因组的编码蛋白基因进行预测，利用专业的barrnap0.4.2和trnascan-sev1.3.1软件分别对rrna和trna在线粒体基因组范围内进行查收与预测。

1.6中华绒螯蟹线粒体基因组特异性引物设计：

参照近缘物种线粒基因组序列(日本绒螯蟹(eriocheirjaponica)(fj455505.1)、肉球近方蟹(hemigrapsussanguineus)(kx456205.1)、伍氏厚蟹(helicanawuana)(kx344898.1)、中华绒螯蟹线粒体基因组序列(eriocheirsinensis)(kp126617.1))，使用primerpremierversion6，结合发明人自身经验设计出19对覆盖中华绒螯蟹线粒体全基因组dna序列的引物(参见表1)，引物序列长度范围均在1.2kb以内，相邻片段一定的重叠区域。

表1.pcr扩增所用引物：

注：以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成

1.7利用以上引物进行pcr扩增：

pcr扩增使用eppendorf热循环仪，pcr反应总体积为50μl，其中包括正反向引物各2μl，dna模板2μl(浓度为50ng/μl)，dnase-free去离子水19μl，taqpcrmastermix25μl(购买于novoproteinbiotech公司)。pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；循环结束后，72℃在延伸10分钟，10℃终止反应。实际得到的序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。各个引物pcr扩增所得序列参见表2。

1.8pcr产物序列预处理：

为确保序列的可靠性，序列拼接时，需对测序质量进行评估，去除测序结果两端的低质量部分，序列方向应与pcr扩增正向引物方向一致。

1.9对拼接的线粒体基因组进行校正

与已公布的中华绒螯蟹线粒体基因组序列(kp126617.1)对比后，第二代测序获得的中华绒螯蟹线粒体基因组中经常会出现overlap、gap以及错误序列，此时通过第一代测序可准确定位相关序列，并使用mega5软件进行人工修正，最后可获得完整的中华绒螯蟹线粒体基因序列(seqidno:58)。

本发明使用的第二代测序除了线粒体控制区的基因序列外，线粒体基因组其他序列的错误率为0.0173％(控制区的基因序列，本发明使用第一代测序修补)，将第二代测序获得的原始序列与参考序列对比之后，用第一代测序技术对pcr扩增的产物进行测序，并以该序列为准，对第二代测序序列的异常位点进行了人工修正，具体为：首先切除多余的1-369和16808-17028片段，获得16438bp的序列，然后对拼接好的序列进行人工修正，其中，第373个位点的“g”，人工修改为“a”，第6442个位点的“a”修改为“g”；第9181个位点的“t”修改为“c”，修正后的序列具体参见seqidno:58。。

根据本发明测序所得的中华绒螯蟹线粒体基因组dna序列对该中华绒螯蟹进行生物学分类，得出该中华绒螯蟹隶属于节肢动物门(arthropoda)、甲壳纲(crustacea)、十足目(decapoda)、方蟹科(grapsidae)，绒螯蟹属(eriocheir)。

本发明的方法还适用于科研和生产单位使用，可快速且准确的测出中华绒螯蟹属物种的线粒体全基因组序列，提高科研以及生产单位的遗传标记开发、种质资源评估和人工育苗等方面的效率，对科研和产业有着重要的意义。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110>上海海洋大学

<120>基于高通量测序测定中华绒螯蟹线粒体全基因组的方法

<130>2018

<160>58

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

catgcaacggaattgcac18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>2

gggtatggtttgattcgg18

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列()

<400>3

ggactttatatctacctggcg21

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>4

gtatgtgaaggagctcttgg20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>5

gagctgactttcagtcatcc20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>6

gctaagaataaccctgtcgc20

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>7

tctcgaccccattcattg18

<210>8

<211>19

<212>dna

<213>人工序列()

<400>8

gtgctccaattcaggtcaa19

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列()

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(20)

<223>n=c或t

<400>9

ccccatattttctaggaganc21

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>10

agtacagatcctaatgcctg20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>11

aagctaatgggctcataccc20

<210>12

<211>21

<212>dna

<213>人工序列()

<400>12

taggtggaagaccactcaagg21

<210>13

<211>21

<212>dna

<213>人工序列()

<400>13

ccttgagtggtcttccaccta21

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>14

ccaagatcaactgatgctcc20

<210>15

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>15

tattttcggtgcttgggc18

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>16

agattataccgaaggcaggc20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>17

ctacatcttgccggagtttc20

<210>18

<211>19

<212>dna

<213>人工序列()

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(19)

<223>n=a或g

<400>18

acgctcaggttgccataan19

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(13)

<223>n=t或g

<400>19

tggcagacagatntgtagga20

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(20)

<223>n=g或t

<400>20

aagatcaacgagaaggggan20

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>n=c或a

<400>21

ntccccttctcgttgatctt20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(14)

<223>n=g或t

<400>22

taactgtagcaccngacgat20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>n=a或g

<400>23

ttgnccgccattaggtattc20

<210>24

<211>19

<212>dna

<213>人工序列()

<400>24

gaccaatgttttgggttgg19

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>25

caaactcctaccaagaaggg20

<210>26

<211>21

<212>dna

<213>人工序列()

<220>

<221>misc_feature

<222>(16)..(16)

<223>n=t或c

<400>26

gtgtgttttaattggngtggc21

<210>27

<211>19

<212>dna

<213>人工序列()

<400>27

ctgcatcagaaaaaggctg19

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>28

acctgcccactgattgatag20

<210>29

<211>19

<212>dna

<213>人工序列()

<400>29

gaaaccaacctggcttacg19

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>30

ttgtgtacatatcgcccgtc20

<210>31

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>31

ctcgactagcgtttcacctt20

<210>32

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>32

ccagcattcgcggttata18

<210>33

<211>18

<212>dna

<213>人工序列()

<400>33

tataaccgcgaatgctgg18

<210>34

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>34

tagccttatgtgggttccct20

<210>35

<211>19

<212>dna

<213>人工序列()

<400>35

agggaacccacataaggct19

<210>36

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>36

cggggtctttagtttgtgga20

<210>37

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>37

catgcctgaatagtaggagt20

<210>38

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>38

gtgctccaattcaggtcaat20

<210>39

<211>1194

<212>dna

<213>人工序列()

<400>39

catgcaacggaattgcaccgtttcttaaaagatcaaaacttcttatgctctttacatcag60

catataaattattttcaaaccctagtgatttacacatctttaaacttgcaatttaatatt120

atttttatactatagggcctaataaaggaatctcattcgtctacagatttacaatctgcc180

gcttacaactcagccactttattaatttttaaataaatagtatactcgatgactgaaagg240

taagtatagatcttttaaatctaatatagtaatttaacatttacttcgagtaaggaatta300

gttaaaatataataacatttgcttgtcatgcaaaagtcatctttaagatactccttaaat360

ttcagttttatttgttttatggtgtagataacacattgtattttcgttacaaaaccgaaa420

ctaatgtttctagaacattataatactttgcccacagataatatttatctcttttgcagc480

ttcaatgcaatattctatataaattatataagctacttatattaatctagctttacgtta540

tacgccattaactaaatttaaatttaaaattaacatatttaaaggaaatcaatgtaaaaa600

tagaactaaatattctcgaacttttcctgacctacaagaatataaactactgacgaaaat660

cccatgctgacttaaactatatatgtataaagtataagctgctctgaaaaaagaaagaaa720

tataattcccattactgtaaatgtccttcaccttattaaactaataatcaacctaatctc780

cccgaatagatttaaagtagggggagcagccatattacccactctaaataaaaatcatca840

caaacctatcctaggtataaaatttaataaacccttactaactaaaagactacgcctacc900

aactcgctcgtatactatattagccaaacaaaataatccagaagaacataacccgtgtcc960

gactattactacaacagctcctattagtcctcatcatctaaaaatcattagaccacatag1020

tactattctcatatgaacaaccgaagaataagcaatcaaggactttatatctacctggcg1080

tagacacaaaagactcactactactccccctactaaactaattctaacccataacgacga1140

aaaattcaagctaattttctgaaatatcaataacacccgaatcaaaccataccc1194

<210>40

<211>905

<212>dna

<213>人工序列()

<400>40

ggactttatatctacctggcgtagacacaaaagactcactactactccccctactaaact60

aattctaacccataacgacgaaaaattcaagctaattttctgaaatatcaataacacccg120

aatcaaaccatacccgcctaactttaataaaactcctgctaaaattatagaaccagcaac180

cggggcttctacgtgagcttttggcaaccataaatgaaatatatatatcggtaatttaac240

taaaaaagccatcacccttctaaaatatcaaatactgtttgcccagctaacttctaaaat300

aagatttcttaatattataactaacctatattcttttatataaatatacaataaagaccc360

caataaaggtaaagatagtgacaaagtataaaaaagtatataaactccagcttgaattcg420

ttcaggttgatatccccatccaagaatcaaaattaaagtgggaattaacgatatttcaaa480

tataatataaaacaacaaataatttaatgaagaaaatgttactaaaagcctaaataaaag540

tactaaatttaccaagataaacatacccctaaaattatttattatttttactcgctccct600

cgaaataacaataagaaatataattcaaacacttaaataaactataatataactgacata660

atctattcctaaattaaatcccaaactatatatatatatattatgaaaacatcttaaacc720

aactaaaaatcttaataatcctaatcctatctgagctgactttcagtcatcctttaattt780

tatcaatagaactacaggtaacaaaaactttaacattccagaagattaaatcttttaaaa840

taatcatttccatgcctacgaacaataagaactaataaagataaaccaagagctccttca900

catac905

<210>41

<211>1123

<212>dna

<213>人工序列()

<400>41

gagctgactttcagtcatcctttaattttatcaatagaactacaggtaacaaaaacttta60

acattccagaagattaaatcttttaaaataatcatttccatgcctacgaacaataagaac120

taataaagataaaccaagagctccttcacatacagctaaagttaaaaaaaataaagaaat180

gtaaatttccctaccaactatagacaactgtaaccttaataatcaaaaaactccaagcat240

tataaattctaatcttaacaacgaatttaataaatgtttattataagaaataaatctcca300

taaaccacaaaaaattataaataccgccccaaacactctcaaaaatctaaaatttatcat360

tagttttaatagttaatttaaaaaactaaaacattggtgttaaaatcctaaacatgaaat420

tttttcttaaaactcaagagaattattatctctattatttttatattaacaatcccctta480

ttaattgtttcttccttcttttttatacaactctctcaccctttggcaataggccttata540

ttatttattcaaacagtcttaatttcaattacaattggagtttccaacttttctttttga600

ttttcttatattctgtttttagtgtttttaggaggaatactagttttattcatttatatt660

gcttctttagcttcaaatgaatcattttctttttctttaattacttttttctttgctatt720

attttaacaggtttaattatctttattttattatttttagatcctatcttaatttctcct780

aattcttcatccctttcaacatcatcattaaaatatttagtctcgaccccattcattgtt840

aattgagtttataataccccatctataatatttactatttttattgtctcctatctacta900

cttatattaattgttgttgttaaaattattaatttgtttaaaggcccacttcgtcttata960

ttataatgacaacacctatacgcaaatcccaccctttatttaaaattgccaatggagcat1020

tagtagatatacctttaccaagtaacatttccacattttgaaactttggttccttgctag1080

gcctttgtttagttatccaaatcgcgacagggttattcttagc1123

<210>42

<211>1169

<212>dna

<213>人工序列()

<400>42

tctcgaccccattcattgttaattgagtttataataccccatctataatatttactattt60

ttattgtctcctatctactacttatattaattgttgttgttaaaattattaatttgttta120

aaggcccacttcgtcttatattataatgacaacacctatacgcaaatcccaccctttatt180

taaaattgccaatggagcattagtagatatacctttaccaagtaacatttccacattttg240

aaactttggttccttgctaggcctttgtttagttatccaaatcgcgacagggttattctt300

agctatacactactctgctcacgtagatctagctttttctagagttgcccacatttgtcg360

tgacgtaaattacggttgaatactacgaacccttcacgctaatggggcctctttcttctt420

tatttgcctctaccttcatattggacgaggcatctactttagatcttatataaaccttca480

tgcttgaatagtaggggtagtaattttatttataattatagcgactgcatttttaggcta540

tgttctaccatgaggacaaatatctttttgaggcgctacagttattacaaatttattttc600

cgctatcccatttatcggtaccgacctagtacaatgaatctgaggagggttttctgttga660

taatgccactttaactcgatttttttcattccattttattttacctttagtagcatcagc720

attttctataattcacattctatttttacaccaaacaggagctaataaccccttaggtat780

ttcaagacaaactgataaagtaccatttcatccttactttacatttaaagatattgttgg840

atttgtagttatattaacagccctaattttattaactcttctagccccatattttctagg900

agatccagataattttattcctgcaaaccctttagtaacccctcctcatatccaaccaga960

atggtattttctttttgcttacgctattttacgatcaattcctaataaattaggaggagt1020

tgtagcattagccgcttcagtggccattcttataattttaccatttacacacacttcaaa1080

atttcaaagattagcattttaccccattaatcaaatgttattctgaacctttgtagtcat1140

tgtagtactattgacctgaattggagcac1169

<210>43

<211>899

<212>dna

<213>人工序列()

<400>43

ccccatattttctaggagatccagataattttattcctgcaaaccctttagtaacccctc60

ctcatatccaaccagaatggtattttctttttgcttacgctattttacgatcaattccta120

ataaattaggaggagttgtagcattagccgcttcagtggccattcttataattttaccat180

ttacacacacttcaaaatttcaaagattagcattttaccccattaatcaaatgttattct240

gaacctttgtagtcattgtagtactattgacctgaattggagcacgcccggttgaagacc300

cttatgtcattactggacagattttaaccgtatcctatttcttgttctatattattaatc360

ctcttattcttatttgatgagataacatacttaaatgactatttagtttaaaaaaaacaa420

atgttttgaaaacattaaataagaataaattcttaatagtcgagtgtttcttaaataact480

atttacatttataaaattttaatatcttcctataaacttaatttttactcccattacttc540

taatatagtgcctgataaaaggatagttttgatagaactaattatgtaatttccagttac600

ctatgttattaaaatctttattaaaaagataagctaaataagctaatgggctcatacccc660

gtaaatgaaagtttaatctctctctttttaatcgcttttcctacctcttatttctttttc720

ctaataacactaatctcagggtcaattatctctatttcctcaacttcctgatttggagct780

tgaattggattagaactaaatctcatatcatttattcctcttattgcttttaaaataaac840

ccacttttttctgaagcagctttaaaatattttcttattcaggcattaggatctgtgct899

<210>44

<211>796

<212>dna

<213>人工序列()

<400>44

aagctaatgggctcataccccgtaaatgaaagtttaatctctctctttttaatcgctttt60

cctacctcttatttctttttcctaataacactaatctcagggtcaattatctctatttcc120

tcaacttcctgatttggagcttgaattggattagaactaaatctcatatcatttattcct180

cttattgcttttaaaataaacccacttttttctgaagcagctttaaaatattttcttatt240

caggcattaggatctgtgctatttatttcttcaagattccttttaatgtctttttattct300

tttagacttttatctatttttttagccctcttattaaaactaggaggagcccctttccac360

ttctgatttcctcaagttatagaaggtctaaaatgaccacaaatcttccttctatctaca420

attcaaaaactagcccccttaaccttaatttcttacctaataaacaacgaaatcttaatt480

aaaattacaattttttcagctattttatcagctttaatcggaagacttggtggtttaaac540

ttaaccctattacgaaaaattattgccttttcttcaattaatcacttatcttgaatatta600

atagcaatctcaattagagactcctcatgacttttttatttttttatttattcccttatt660

gtactttctattaccagagtatttcataaattacaaaccttctccctttctatactaatt720

caatctgatcaaaatagaacacttcacgctactattatttcacttaattttttatccttg780

agtggtcttccaccta796

<210>45

<211>798

<212>dna

<213>人工序列()

<400>45

ccttgagtggtcttccacctataacaggatttattcccaaatgaattgttattcaagtta60

tattaaatttaaatatatttatccccttattttttcttcttgtttctgctttgattactt120

tatatttttatttgcgaatcatcattaccataatcttaatattcaaccctattttaaatt180

ttaatatgaaatataaatctctaacagattccccatcttctctattttttaaatcctcct240

tcaacttttttggtcttctactaccagtatatttcacctttatctagaattttaagttat300

ttaaactaaaagccttcaaagctttctaaaaaagtattaaccttttaaattctatatttt360

aattattatgcaacgatgacttttttctacaaatcataaagatattggaacattatattt420

tattttcggtgcttgggccggaatagtaggaacatcattaagattaattattcgagctga480

attaagacaaccaggcagactaattggtaacgatcaaatttataatgtagttgtaacagc540

tcacgcttttgtaataattttttttatagtaatgcccattataattggtggatttggcaa600

ctgacttgtccctcttatactaggggccccagatatagctttcccacgaataaacaatat660

aagattctgacttttacccccttctctctctcttttacttacaagaagaatagtagaaag720

aggagttggtactgggtggactgtctacccacctttagcagcagccatcgctcatgctgg780

agcatcagttgatcttgg798

<210>46

<211>704

<212>dna

<213>人工序列()

<400>46

tattttcggtgcttgggccggaatagtaggaacatcattaagattaattattcgagctga60

attaagacaaccaggcagactaattggtaacgatcaaatttataatgtagttgtaacagc120

tcacgcttttgtaataattttttttatagtaatgcccattataattggtggatttggcaa180

ctgacttgtccctcttatactaggggccccagatatagctttcccacgaataaacaatat240

aagattctgacttttacccccttctctctctcttttacttacaagaagaatagtagaaag300

aggagttggtactgggtggactgtctacccacctttagcagcagccatcgctcatgctgg360

agcatcagttgatcttggtatcttctctctacatcttgccggagtttcctcaattttagg420

agctgttaatttcataacaacagttattaacatacgatcatatggaataacaatggatca480

aatacctctttttgtttgagctgtatttattactgctattttacttctcttatcccttcc540

agttttagctggagctattaccatactgcttacagatcgtaacctaaatacgtcattttt600

cgacccagcagggggaggtgacccagttctataccagcacttattctgatttttcggtca660

cccagaagtttatattctaattttgcctgccttcggtataatct704

<210>47

<211>1182

<212>dna

<213>人工序列()

<400>47

ctacatcttgccggagtttcctcaattttaggagctgttaatttcataacaacagttatt60

aacatacgatcatatggaataacaatggatcaaatacctctttttgtttgagctgtattt120

attactgctattttacttctcttatcccttccagttttagctggagctattaccatactg180

cttacagatcgtaacctaaatacgtcatttttcgacccagcagggggaggtgacccagtt240

ctataccagcacttattctgatttttcggtcacccagaagtttatattctaattttgcct300

gccttcggtataatctctcatattgtaagtcaagaatcaggtaaaaaggaatcttttgga360

actttaggtataatttacgctatactagctattggaattttgggctttgtagtatgagct420

catcatatatttacagtaggtatagacgtagatacccgagcttactttacctcagccact480

ataattattgctatccccaccggaattaaaatctttagatgactaaggaccttacatgga540

actcaaataaattattcaccatctcttctatgagctttagggtttatctttttatttact600

attggaggtctgacaggagtagttttagctaattcctcaattgatattattctccatgat660

acttattatgttgttgcccactttcattatgtactctctatgggagcagttttcggaatc720

tttgctggagttgctcactgattttctctaataacaggtttatctttcaaccctaaatga780

ctaaaaattcactttttagtaactttcgtcggagtcaatttaacattttttccccaacac840

tttttaggattaaacggcataccacgacgatactctgattatcctgacgcctatgcaact900

tgaaatattgtatcatctataggttctataatttcttttgtagccgcattaggattctta960

ttaatcgtttgagaagcatttgtttctaatcgcccagtaatcttttctccttttctgccc1020

tcttctattgaatggaaacatgcttatcctccagccgaccattcatatatggaaatccca1080

ctaattactaacttctaaaatggcagacagatgtgtaggatttaagctcctataaggaag1140

aataatttcttcttttagaataacttatggcaacatgagcgt1182

<210>48

<211>1108

<212>dna

<213>人工序列()

<400>48

tggcagacagatgtgtaggatttaagctcctataaggaagaataatttcttcttttagaa60

taacttatggcaacatgagcgtatttaaattttcaagacagagcttctcctcttatagaa120

caattaattttttttcacgatcatattatattagtgattgtgttaattgtaacatttgtt180

ggttatataatagcaacattgtttttcaactccctcattaaccgctatatattagaaaat240

caaccaatcgaagtaatttgaacatcagttccagcttttattttaatctttattgcttta300

ccatcccttcgcttactttatcttttagatgaagtaaacaatccttctataactcttaaa360

acaattggccaccaatgatattgaaggtatgaatattcagatttccttcaagtagaattt420

gactcatatatagtaccatctaatgagctggaagtatcagggttccggctactagacgta480

gacaatcgtaccgttcttccaataaatactcaaatccgagttctaattacagctgcagat540

gtcatccattcctggacagtcccatccttaggtattaaagccgatgcaattcccgggcgg600

ctaaatcaatcaaggtttttaatcaaccgacctggactattttacggtcaatgttcagaa660

atttgcggggcaaaccacagatttatgcccattgttattgaaagaacttctattaactca720

tttctaaattgaatttctctatcaattgaagcgtcaccctaactcatccttagttttact780

aatttttgggtgaaacaattccttctgtgaattactatttatgccacaaatagcacctat840

ttattgactatttatatttttcttttttttagccagattcctattatttttcgctcttaa900

ttacttcattaaacctttttataaagttaattttcttcaagataataaaaaacctttaat960

ttataaacattgaaaattataacaaatttattctcaatttttgaaccttcttcaagaatc1020

tttaatttatcgataaattgaatctcaactatcctaggattgatattcttaccttatata1080

tactgagcatccccttctcgttgatctt1108

<210>49

<211>1000

<212>dna

<213>人工序列()

<400>49

atccccttctcgttgatctttactttggggaaaaattatttcaaccttgcataaagaatt60

taaagctcttttacagccttcacataatggagcttctatagtattcattgctttatttag120

gttaattgtatttaataattttctaggcttattaccttatgtatttactagctctagtca180

tatggtaataacattatctttatctttgcccttgtgaattactttaataacatttgggtg240

aattaaacacactaaacatatatttgcccatttagttccccaagggacgcctttcgcttt300

aatgccatttatagtgttaattgaaaccattagaaatgtaattcggcctggtaccttagc360

aattcggctagccgctaatataattgccggtcatttacttttaaccttattaggaaatac420

tggcccttcattatcaacctccatcctattcattttattgtcagctcaaatactcctact480

aatcttagaatctgccgtagctattattcaatcttatgttttcgctgttttaagaactct540

ctacactagagaaattaactaatgacatcatcacacggctttcatccttatcatttagta600

gatattagaccctgaccaattactgggtctattagagctataatactaaccactggttta660

gtaaaatgatttcaccaacacaatataaaccttttaattttaagatttattgcaactttg720

ttaactataattcaatgatggcgagatattacccgtgaaggtacttaccaaggatcacac780

actttaacagtaataaaggggctacgctgaggtataattttatttattgtatcagaagtt840

ttatttttcttttcttttttttgagcttttttccatagaagactatctcctgctgtagaa900

attgggatatattggccgccattaggtattcaaccttttaaccctttccaaatccccctt960

ctaaacactacgattcttctatcgtcaggtgctacagtta1000

<210>50

<211>1198

<212>dna

<213>人工序列()

<400>50

ttggccgccattaggtattcaaccttttaaccctttccaaatcccccttctaaacactac60

gattcttctatcgtcaggtgctacagttacttgggctcatcacgcaattctagagggtaa120

ctactctcaagctgtacaaagactaggtttaactattatcctaggtatttattttacaat180

gctccaagcatttgaatatattgaagcttctttcactattgccgactcagtctttggttc240

aacattttttgtagcaactgggttccatggattacacgttatcattggaacttcattttt300

atttgtttgttttattcgactttataaatgtcacttttcttcttctcatcatttaggatt360

tgaggcagctgcttgatactgacactttgttgatgttgtttgattattcttatatatttt420

catttattgatgaggcggataatttttttaatataataagtatatctgatttccaatcag480

aaagtctaacttttagaaaaaataatctttacaatattgacaatttcagttattactctc540

atggtttcatatatcgttataactttagcgaccctcttatctaaaaagacaattatagat600

cgagaaaaaaattctccgtatgaatgtggattcgatcccaaaggatccgcccgtctacct660

ttttctctacgcttttttttaattgccgtaattttcctaatctttgatgtagaaattaca720

cttctgctgcctattgcttctacattaaacctaaccaatatgttttcttgattttttaca780

agtttaatttttttattaattttgttatttggtctttattatgaatgatcacaaagtgct840

ctagattgatcttagtaagaccatagtcaatatatgacgtatgagttgcattcataaaga900

gttttctaaactggttttaaaaattagaaagcgaataattgcatttagtttcgacctaaa960

ttttagactttagtcttctaattttggtggaaaccaaaaagaggtatatcactgttaatg1020

ataaaattgagttcaaactcctaccaagaagggatattatgctaaaggcagaaagcttct1080

aactttttactaagcggttaaattccgtttatatccctttgttatatatatgtacatatc1140

tatcaacctagccctagcactttgtttttatagtttaaaccaacccaaaacattggtc1198

<210>51

<211>1181

<212>dna

<213>人工序列()

<400>51

caaactcctaccaagaagggatattatgctaaaggcagaaagcttctaactttttactaa60

gcggttaaattccgtttatatccctttgttatatatatgtacatatctatcaacctagcc120

ctagcactttgtttttatagtttaaaccaacccaaaacattggtcttgtaaaccaataat180

gaattattttctaaaaactttcagaaaaaaagagtaactctttatctttaattcccaaaa240

ttaatattttttaaactatttcctgaatttattactctaaattttatgctgctagacaaa300

aacaaaacattttaaatctaacaaaaaaaatcaaataattaatagaaacaggaagataac360

tttttcatgctaaatatatcaatttatcataccgcagtcgaggtaaagtacctcggactc420

atacaaacccaaaagctactattacactcttaaaataaaacattactctgaacggccccc480

tacccaaaaaaaaaataacaaataaaaccctcatgaatagaatacttgcgtattcagcta540

taaaaattaatgcaaacccgccagccccgtactctgtattaaagccagagactagctcag600

attcaccttcagaaaaatcaaatggagttcgattagtctcagctaaacatgacctaaatc660

acaccattcttaaaggaaatctaattacaacaaatcaaaaataattttgatatttattaa720

acaactctaaattaaatccaccaattaatattacaaaagataataaaattaaagctaacc780

taacttcataagaaatagtttgagctaccgctcgcaaagaacctaataaagaatatttac840

aatttgatgatcatcccgccactatagttgaatacacccctacacttaaacaacacaaaa900

aaaacagaattctcagattaaaccttattaatccagtttcataaggtaaaactgatcata960

ctaataaagaaataaacaaactaaatacaggacataaatagtaaactaaaaagtttgata1020

tagtaggaataatttgttccttagtgaaaagctttactgcatcagaaaaaggctgtaaaa1080

ttcctatatagcctactttatttgggcctttacgaatttgaatataacctaaaatttttc1140

gttcaagtaaagttacaaaagccacgccaattaaaacacac1181

<210>52

<211>874

<212>dna

<213>人工序列()

<400>52

ctgcatcagaaaaaggctgtaaaattcctatatagcctactttatttgggcctttacgaa60

tttgaatataacctaaaatttttcgttcaagtaaagttacaaaagccacgccaattaaaa120

cacacactattaataccaaaaaattaactatctctacaattattaaagtcacaaaacaat180

tagattactaataatttaactatttatagaattgctctattttataggatcctaaatcca240

acacatattatctgccaaaatagtaatcattatataaaataattttaattatttaatcct300

ttcgtactaaaataatttttctttattaaaagatagaaaccaacctggcttacgccggtt360

tgaactcaaatcatgtaaaattttaaaggtcgaacagacctacttatataactgctacaa420

ttataaagatattttaattcaacatcgaggtcgcaaacttttctttcgataagtactctt480

aagaaaaataacgctgttatccctaaagtaacttaaacttttaatctttaattaggatca540

tttaaaattttaatcacatataagtgtacttaatgttaagcagttaataatcattttact600

cttatcgccccaataaaataaattcaatttacaaaatctttataacctaaaatttgacta660

tataaaatttaatattaagctttatagggtcttatcgtccctttaatacatttaagcctt720

ttcacttaaaagtaaaattcaataaacaatataaagacagatcttcttttgtccaaccat780

tcatacaagattccaattaaaaaactaacgattatgctacctttgcacggtcaaaatacc840

gcggccatttaatactatcaatcagtgggcaggt874

<210>53

<211>1376

<212>dna

<213>人工序列()

<400>53

gaaaccaacctggcttacgccggtttgaactcaaatcatgtaaaattttaaaggtcgaac60

agacctacttatataactgctacaattataaagatattttaattcaacatcgaggtcgca120

aacttttctttcgataagtactcttaagaaaaataacgctgttatccctaaagtaactta180

aacttttaatctttaattaggatcatttaaaattttaatcacatataagtgtacttaatg240

ttaagcagttaataatcattttactcttatcgccccaataaaataaattcaatttacaaa300

atctttataacctaaaatttgactatataaaatttaatattaagctttatagggtcttat360

cgtccctttaatacatttaagccttttcacttaaaagtaaaattcaataaacaatataaa420

gacagatcttcttttgtccaaccattcatacaagattccaattaaaaaactaacgattat480

gctacctttgcacggtcaaaataccgcggccatttaatactatcaatcagtgggcaggtt540

aaactttttataacttcaaacagacatgtttttgataaacaggcaaagaagttatttttg600

ccgagttcctttattccgccctatcaattttaaacaatatttattatttaaatgttttgc660

tttaataaaaaacttttactaataaaatcattataacttaactctttatatttaaattaa720

ttttttaatactccaaaaaagtttatataaatattatccaattttaatttagctagaaca780

ctttataaatatagctacttttaagcctaattcaccaattaaactattttaaactattta840

tcattttaattataagaagctaatccctcctacacttaaattttacatcttatcaacgta900

aaaattaaattaaatttactttttaaaaaactagatataataaaactcgactagcgtttc960

acctttaattttatattaaaaatttattttctacaaaaaattttttataaaattagctat1020

attttatttcgagatatttaatttttattaacttatataaattttccctgatacacaagg1080

tacaatatttaaaattttttacttcaaattttcttgctttcctttacagtactcttaact1140

atagtttataaattgtgtttattaaaaattactagcatgaacaaattacaaattattttt1200

cataaatataaaattttcaaatttatttaacaagtcattaataaatagatgggtaattat1260

taatttataaagaaaatatacatatcctcatctttactagatacactttccagtacatct1320

actatgttacgacttatttcacttataaatgaaagcgacgggcgatatgtacacaa1376

<210>54

<211>966

<212>dna

<213>人工序列()

<400>54

ctcgactagcgtttcacctttaattttatattaaaaatttattttctacaaaaaattttt60

tataaaattagctatattttatttcgagatatttaatttttattaacttatataaatttt120

ccctgatacacaaggtacaatatttaaaattttttacttcaaattttcttgctttccttt180

acagtactcttaactatagtttataaattgtgtttattaaaaattactagcatgaacaaa240

ttacaaattatttttcataaatataaaattttcaaatttatttaacaagtcattaataaa300

tagatgggtaattattaatttataaagaaaatatacatatcctcatctttactagataca360

ctttccagtacatctactatgttacgacttatttcacttataaatgaaagcgacgggcga420

tatgtacacaatttagaacttatatcttgttagcttattaaactaaaaatacaatcaaat480

ccatctttataataatattatcttattaatccgcagtaaagtaatttactgtaacccatt540

ttaccttgcttattggctgcaccatgatctaattttactaaacaactaaatttaataatt600

tttcctttaagaattatctgataatgatggtatacaaactgttagaattactaaagcaag660

taagatttttcgtggtttatcgattctaaaacaggttcctctgaatagattaaattgccg720

ccaaattttttaaattttaagtatttatcttttactaattcagttttatattaaatttat780

tttagaataatagggtatctaatcctagtttatttctaaacttttttagcttcaattata840

attttactccatacataataatatcctaattttaccttttattacctgtatgagattttt900

aatttaatcatctaactataaccttagaatttttactcaatcttaaagtataaccgcgaa960

tgctgg966

<210>55

<211>1085

<212>dna

<213>人工序列()

<400>55

tataaccgcgaatgctggcacaaatatatatcagattttaatattattactatatcacac60

cttcatgtataattttataatattttatgctgagacaataaaggtttataattttatttc120

actcgaataccaatttaatatttaattaaattgtttaaatcacactttaattttcataca180

attttaataataatgtaaaaacttaagccaaaatcaaacatttgtcgtgattgcaaataa240

taactttaaaaaacttaaatatactatatataacataaaaatgagaataagcttatactt300

aaagtataacttatacatcttaagcgccacaagctaacgttttaatattttaaactattt360

aagttttgttataactaatattgctacaaatatatttattatctacacaaaaacaaacaa420

tataatcaccaacccaaccacaaaaatttttataaacactttaatattattaagttgtaa480

ctcatttaacaacctaaaatatttcttaaacaaaaaatacatcccctggccaccaaaata540

ttcaaatcaccctttgtctcctaatttttcaacacctaccccactaatgagactagaccc600

tctaattttttttgtcctaagaaaaggtataaatcatatagacccccttattactactat660

cttataattattaatagattttaaattgtaacttacatttaataaattaaatatataacc720

tataactccccctgctaatcttacccccaacactatatttttcattattacattcaaaca780

aattatataaggctctgggaaaataacccaagatagaacagctcctataaaaatagctct840

tacacctagtaaaatcatagaatttcttataattttatcctcatccctaatatttattat900

aactcttaaatttgaattacctcttaacctataaaaaattagacgtatagtatacataac960

tgttaaccctgtagctaaaatatataacagtaaagaaataaaattaatccatctcataaa1020

agccacctctaaaattatatctttagaataaaaccctgctaaaaaagggaacccacataa1080

ggcta1085

<210>56

<211>1019

<212>dna

<213>人工序列()

<400>56

agggaacccacataaggctaaatttgaaactcttataaaagacactcttaacggcataaa60

tttaattaaaccacctatacatcgaatatcctgataattgccaaccctatggataataat120

acctgcgcatataaataacaatgctttaaataatgcatgactcagcagatgaaaaaaaga180

aagatcagggtatcctaaagctaaaatacttaacataacccccaattgacttaacgttga240

taaggcaataattttttttaaatcatattcaaaattggcccctaatcccgccataaatat300

agttaagcaagaaataattaataatattccttggattttagaaccttctaacgcaccact360

aaatcgaattattaaatacaccccagcagttactaaagtagaagaatgtactaaagcaga420

aacaggagtaggagctgctatagcggcaggaagccatgctgagaaaggaatttgagcact480

tttagtcatagctcttaacattaacaaaaacttaaacaaaattcactcagtatctataat540

atagtaagaataaataacaaaatttcatctacctaacctggccattagtccaatactaag600

taaaatagcaacatcacctactcgattagataagatagttaacatcccagcattagcaga660

cttttcattttgataaaaaattactaaagcataagaaactaaacctaatccatcccatcc720

taaaagaatacttaccaagttaggtcttaaaactattatagccatagataaaacaaacat780

taaaactaaatatataaatcgattaaagtttttatcctccttcatatatctacctctata840

atacatcacacttccagaaataagcaatacaaaacacaaaaaaagtatcgaaattcaatc900

aaaaattaaaacaaacaccactgataatgaatttaatcttgctaaatcccattcaattac960

actagtaacaccactaaataattttattaaagaaactgttccacaaactaaagaccccg1019

<210>57

<211>875

<212>dna

<213>人工序列()

<400>57

cctctataatacatcacacttccagaaataagcaatacaaaacacaaaaaaagtatcgaa60

attcaatcaaaaattaaaacaaacaccactgataatgaatttaatcttgctaaatcccat120

tcaattacactagtaacaccactaaataattttattaaagaaactgttccacaaactaaa180

gaccccgctcatagcccaagtattctaatcttatgtatataaattattcaaaccattatt240

taaatattaaattattaatttaatacaaaatacagtaacatttctaccaatggtacaaaa300

caattagtagtaattaaatctaaataaatcaaagcaaatcgatttgcacgataaatcttt360

tcaacgtaactgaaatgctgttctattttagctctgctttgacactatcatattatattt420

ccaatctactttacatttaaataatttattaaaaaaagctactaaaaatattaagaaatg480

ataatactattatattatacaattttatttttctttatttatacggaggtatataaggta540

tatataaatatatcacattagatataagtaaataatataaacaaatcaaatatataaaaa600

ttaaatatgtatattcgcctccacaattataccccatccaatataatacaggatagataa660

aacattaaaattataaaagggtaaaattataaataaatagaagtatataatgtcttagtt720

tatatggaacattgaaacattttatataaaagtaaaaattatatgtaacttcattatata780

aatatatgatttatactatttttatttattctatgggttgaaaaaaagtagtagtctcaa840

ccctagaccctaattcctctagaggggaaacgggt875

<210>58

<211>16438

<212>dna

<213>人工序列()

<400>58

ttacatgcaacggaattgcaccgtttcttaaaagatcaaaacttcttatgctctttacat60

cagcatataaattattttcaaaccctagtgatttacacatctttaaacttgcaatttaat120

attatttttatactatagggcctaataaaggaatctcattcgtctacagatttacaatct180

gccgcttacaactcagccactttattaatttttaaataaatagtatactcgatgactgaa240

aggtaagtatagatcttttaaatctaatatagtaatttaacatttacttcgagtaaggaa300

ttagttaaaatataataacatttgcttgtcatgcaaaagtcatctttaagatactcctta360

aatttcagttttatttgttttatggtgtagataacacattgtattttcgttacaaaaccg420

aaactaatgtttctagaacattataatactttgcccacagataatatttatctcttttgc480

agcttcaatgcaatattctatataaattatataagctacttatattaatctagctttacg540

ttatacgccattaactaaatttaaatttaaaattaacatatttaaaggaaatcaatgtaa600

aaatagaactaaatattctcgaacttttcctgacctacaagaatataaactactgacgaa660

aatcccatgctgacttaaactatatatgtataaagtataagctgctctgaaaaaagaaag720

aaatataattcccattactgtaaatgtccttcaccttattaaactaataatcaacctaat780

ctccccgaatagatttaaagtagggggagcagccatattacccactctaaataaaaatca840

tcacaaacctatcctaggtataaaatttaataaacccttactaactaaaagactacgcct900

accaactcgctcgtatactatattagccaaacaaaataatccagaagaacataacccgtg960

tccgactattactacaacagctcctattagtcctcatcatctaaaaatcattagaccaca1020

tagtactattctcatatgaacaaccgaagaataagcaatcaaggactttatatctacctg1080

gcgtagacacaaaagactcactactactccccctactaaactaattctaacccataacga1140

cgaaaaattcaagctaattttctgaaatatcaataacacccgaatcaaaccatacccgcc1200

taactttaataaaactcctgctaaaattatagaaccagcaaccggggcttctacgtgagc1260

ttttggcaaccataaatgaaatatatatatcggtaatttaactaaaaaagccatcaccct1320

tctaaaatatcaaatactgtttgcccagctaacttctaaaataagatttcttaatattat1380

aactaacctatattcttttatataaatatacaataaagaccccaataaaggtaaagatag1440

tgacaaagtataaaaaagtatataaactccagcttgaattcgttcaggttgatatcccca1500

tccaagaatcaaaattaaagtgggaattaacgatatttcaaatataatataaaacaacaa1560

ataatttaatgaagaaaatgttactaaaagcctaaataaaagtactaaatttaccaagat1620

aaacatacccctaaaattatttattatttttactcgctccctcgaaataacaataagaaa1680

tataattcaaacacttaaataaactataatataactgacataatctattcctaaattaaa1740

tcccaaactatatatatatatattatgaaaacatcttaaaccaactaaaaatcttaataa1800

tcctaatcctatctgagctgactttcagtcatcctttaattttatcaatagaactacagg1860

taacaaaaactttaacattccagaagattaaatcttttaaaataatcatttccatgccta1920

cgaacaataagaactaataaagataaaccaagagctccttcacatacagctaaagttaaa1980

aaaaataaagaaatgtaaatttccctaccaactatagacaactgtaaccttaataatcaa2040

aaaactccaagcattataaattctaatcttaacaacgaatttaataaatgtttattataa2100

gaaataaatctccataaaccacaaaaaattataaataccgccccaaacactctcaaaaat2160

ctaaaatttatcattagttttaatagttaatttaaaaaactaaaacattggtgttaaaat2220

cctaaacatgaaattttttcttaaaactcaagagaattattatctctattatttttatat2280

taacaatccccttattaattgtttcttccttcttttttatacaactctctcaccctttgg2340

caataggccttatattatttattcaaacagtcttaatttcaattacaattggagtttcca2400

acttttctttttgattttcttatattctgtttttagtgtttttaggaggaatactagttt2460

tattcatttatattgcttctttagcttcaaatgaatcattttctttttctttaattactt2520

ttttctttgctattattttaacaggtttaattatctttattttattatttttagatccta2580

tcttaatttctcctaattcttcatccctttcaacatcatcattaaaatatttagtctcga2640

ccccattcattgttaattgagtttataataccccatctataatatttactatttttattg2700

tctcctatctactacttatattaattgttgttgttaaaattattaatttgtttaaaggcc2760

cacttcgtcttatattataatgacaacacctatacgcaaatcccaccctttatttaaaat2820

tgccaatggagcattagtagatatacctttaccaagtaacatttccacattttgaaactt2880

tggttccttgctaggcctttgtttagttatccaaatcgcgacagggttattcttagctat2940

acactactctgctcacgtagatctagctttttctagagttgcccacatttgtcgtgacgt3000

aaattacggttgaatactacgaacccttcacgctaatggggcctctttcttctttatttg3060

cctctaccttcatattggacgaggcatctactttagatcttatataaaccttcatgcttg3120

aatagtaggggtagtaattttatttataattatagcgactgcatttttaggctatgttct3180

accatgaggacaaatatctttttgaggcgctacagttattacaaatttattttccgctat3240

cccatttatcggtaccgacctagtacaatgaatctgaggagggttttctgttgataatgc3300

cactttaactcgatttttttcattccattttattttacctttagtagcatcagcattttc3360

tataattcacattctatttttacaccaaacaggagctaataaccccttaggtatttcaag3420

acaaactgataaagtaccatttcatccttactttacatttaaagatattgttggatttgt3480

agttatattaacagccctaattttattaactcttctagccccatattttctaggagatcc3540

agataattttattcctgcaaaccctttagtaacccctcctcatatccaaccagaatggta3600

ttttctttttgcttacgctattttacgatcaattcctaataaattaggaggagttgtagc3660

attagccgcttcagtggccattcttataattttaccatttacacacacttcaaaatttca3720

aagattagcattttaccccattaatcaaatgttattctgaacctttgtagtcattgtagt3780

actattgacctgaattggagcacgcccggttgaagacccttatgtcattactggacagat3840

tttaaccgtatcctatttcttgttctatattattaatcctcttattcttatttgatgaga3900

taacatacttaaatgactatttagtttaaaaaaaacaaatgttttgaaaacattaaataa3960

gaataaattcttaatagtcgagtgtttcttaaataactatttacatttataaaattttaa4020

tatcttcctataaacttaatttttactcccattacttctaatatagtgcctgataaaagg4080

atagttttgatagaactaattatgtaatttccagttacctatgttattaaaatctttatt4140

aaaaagataagctaaataagctaatgggctcataccccgtaaatgaaagtttaatctctc4200

tctttttaatcgcttttcctacctcttatttctttttcctaataacactaatctcagggt4260

caattatctctatttcctcaacttcctgatttggagcttgaattggattagaactaaatc4320

tcatatcatttattcctcttattgcttttaaaataaacccacttttttctgaagcagctt4380

taaaatattttcttattcaggcattaggatctgtgctatttatttcttcaagattccttt4440

taatgtctttttattcttttagacttttatctatttttttagccctcttattaaaactag4500

gaggagcccctttccacttctgatttcctcaagttatagaaggtctaaaatgaccacaaa4560

tcttccttctatctacaattcaaaaactagcccccttaaccttaatttcttacctaataa4620

acaacgaaatcttaattaaaattacaattttttcagctattttatcagctttaatcggaa4680

gacttggtggtttaaacttaaccctattacgaaaaattattgccttttcttcaattaatc4740

acttatcttgaatattaatagcaatctcaattagagactcctcatgacttttttattttt4800

ttatttattcccttattgtactttctattaccagagtatttcataaattacaaaccttct4860

ccctttctatactaattcaatctgatcaaaatagaacacttcacgctactattatttcac4920

ttaattttttatccttgagtggtcttccacctataacaggatttattcccaaatgaattg4980

ttattcaagttatattaaatttaaatatatttatccccttattttttcttcttgtttctg5040

ctttgattactttatatttttatttgcgaatcatcattaccataatcttaatattcaacc5100

ctattttaaattttaatatgaaatataaatctctaacagattccccatcttctctatttt5160

ttaaatcctccttcaacttttttggtcttctactaccagtatatttcacctttatctaga5220

attttaagttatttaaactaaaagccttcaaagctttctaaaaaagtattaaccttttaa5280

attctatattttaattattatgcaacgatgacttttttctacaaatcataaagatattgg5340

aacattatattttattttcggtgcttgggccggaatagtaggaacatcattaagattaat5400

tattcgagctgaattaagacaaccaggcagactaattggtaacgatcaaatttataatgt5460

agttgtaacagctcacgcttttgtaataattttttttatagtaatgcccattataattgg5520

tggatttggcaactgacttgtccctcttatactaggggccccagatatagctttcccacg5580

aataaacaatataagattctgacttttacccccttctctctctcttttacttacaagaag5640

aatagtagaaagaggagttggtactgggtggactgtctacccacctttagcagcagccat5700

cgctcatgctggagcatcagttgatcttggtatcttctctctacatcttgccggagtttc5760

ctcaattttaggagctgttaatttcataacaacagttattaacatacgatcatatggaat5820

aacaatggatcaaatacctctttttgtttgagctgtatttattactgctattttacttct5880

cttatcccttccagttttagctggagctattaccatactgcttacagatcgtaacctaaa5940

tacgtcatttttcgacccagcagggggaggtgacccagttctataccagcacttattctg6000

atttttcggtcacccagaagtttatattctaattttgcctgccttcggtataatctctca6060

tattgtaagtcaagaatcaggtaaaaaggaatcttttggaactttaggtataatttacgc6120

tatactagctattggaattttgggctttgtagtatgagctcatcatatatttacagtagg6180

tatagacgtagatacccgagcttactttacctcagccactataattattgctatccccac6240

cggaattaaaatctttagatgactaaggaccttacatggaactcaaataaattattcacc6300

atctcttctatgagctttagggtttatctttttatttactattggaggtctgacaggagt6360

agttttagctaattcctcaattgatattattctccatgatacttattatgttgttgccca6420

ctttcattatgtactctctatgggagcagttttcggaatctttgctggagttgctcactg6480

attttctctaataacaggtttatctttcaaccctaaatgactaaaaattcactttttagt6540

aactttcgtcggagtcaatttaacattttttccccaacactttttaggattaaacggcat6600

accacgacgatactctgattatcctgacgcctatgcaacttgaaatattgtatcatctat6660

aggttctataatttcttttgtagccgcattaggattcttattaatcgtttgagaagcatt6720

tgtttctaatcgcccagtaatcttttctccttttctgccctcttctattgaatggaaaca6780

tgcttatcctccagccgaccattcatatatggaaatcccactaattactaacttctaaaa6840

tggcagacagatgtgtaggatttaagctcctataaggaagaataatttcttcttttagaa6900

taacttatggcaacatgagcgtatttaaattttcaagacagagcttctcctcttatagaa6960

caattaattttttttcacgatcatattatattagtgattgtgttaattgtaacatttgtt7020

ggttatataatagcaacattgtttttcaactccctcattaaccgctatatattagaaaat7080

caaccaatcgaagtaatttgaacatcagttccagcttttattttaatctttattgcttta7140

ccatcccttcgcttactttatcttttagatgaagtaaacaatccttctataactcttaaa7200

acaattggccaccaatgatattgaaggtatgaatattcagatttccttcaagtagaattt7260

gactcatatatagtaccatctaatgagctggaagtatcagggttccggctactagacgta7320

gacaatcgtaccgttcttccaataaatactcaaatccgagttctaattacagctgcagat7380

gtcatccattcctggacagtcccatccttaggtattaaagccgatgcaattcccgggcgg7440

ctaaatcaatcaaggtttttaatcaaccgacctggactattttacggtcaatgttcagaa7500

atttgcggggcaaaccacagatttatgcccattgttattgaaagaacttctattaactca7560

tttctaaattgaatttctctatcaattgaagcgtcaccctaactcatccttagttttact7620

aatttttgggtgaaacaattccttctgtgaattactatttatgccacaaatagcacctat7680

ttattgactatttatatttttcttttttttagccagattcctattatttttcgctcttaa7740

ttacttcattaaacctttttataaagttaattttcttcaagataataaaaaacctttaat7800

ttataaacattgaaaattataacaaatttattctcaatttttgaaccttcttcaagaatc7860

tttaatttatcgataaattgaatctcaactatcctaggattgatattcttaccttatata7920

tactgagcatccccttctcgttgatctttactttggggaaaaattatttcaaccttgcat7980

aaagaatttaaagctcttttacagccttcacataatggagcttctatagtattcattgct8040

ttatttaggttaattgtatttaataattttctaggcttattaccttatgtatttactagc8100

tctagtcatatggtaataacattatctttatctttgcccttgtgaattactttaataaca8160

tttgggtgaattaaacacactaaacatatatttgcccatttagttccccaagggacgcct8220

ttcgctttaatgccatttatagtgttaattgaaaccattagaaatgtaattcggcctggt8280

accttagcaattcggctagccgctaatataattgccggtcatttacttttaaccttatta8340

ggaaatactggcccttcattatcaacctccatcctattcattttattgtcagctcaaata8400

ctcctactaatcttagaatctgccgtagctattattcaatcttatgttttcgctgtttta8460

agaactctctacactagagaaattaactaatgacatcatcacacggctttcatccttatc8520

atttagtagatattagaccctgaccaattactgggtctattagagctataatactaacca8580

ctggtttagtaaaatgatttcaccaacacaatataaaccttttaattttaagatttattg8640

caactttgttaactataattcaatgatggcgagatattacccgtgaaggtacttaccaag8700

gatcacacactttaacagtaataaaggggctacgctgaggtataattttatttattgtat8760

cagaagttttatttttcttttcttttttttgagcttttttccatagaagactatctcctg8820

ctgtagaaattgggatatattggccgccattaggtattcaaccttttaaccctttccaaa8880

tcccccttctaaacactacgattcttctatcgtcaggtgctacagttacttgggctcatc8940

acgcaattctagagggtaactactctcaagctgtacaaagactaggtttaactattatcc9000

taggtatttattttacaatgctccaagcatttgaatatattgaagcttctttcactattg9060

ccgactcagtctttggttcaacattttttgtagcaactgggttccatggattacacgtta9120

tcattggaacttcatttttatttgtttgttttattcgactttataaatgtcacttttctt9180

cttctcatcatttaggatttgaggcagctgcttgatactgacactttgttgatgttgttt9240

gattattcttatatattttcatttattgatgaggcggataatttttttaatataataagt9300

atatctgatttccaatcagaaagtctaacttttagaaaaaataatctttacaatattgac9360

aatttcagttattactctcatggtttcatatatcgttataactttagcgaccctcttatc9420

taaaaagacaattatagatcgagaaaaaaattctccgtatgaatgtggattcgatcccaa9480

aggatccgcccgtctacctttttctctacgcttttttttaattgccgtaattttcctaat9540

ctttgatgtagaaattacacttctgctgcctattgcttctacattaaacctaaccaatat9600

gttttcttgattttttacaagtttaatttttttattaattttgttatttggtctttatta9660

tgaatgatcacaaagtgctctagattgatcttagtaagaccatagtcaatatatgacgta9720

tgagttgcattcataaagagttttctaaactggttttaaaaattagaaagcgaataattg9780

catttagtttcgacctaaattttagactttagtcttctaattttggtggaaaccaaaaag9840

aggtatatcactgttaatgataaaattgagttcaaactcctaccaagaagggatattatg9900

ctaaaggcagaaagcttctaactttttactaagcggttaaattccgtttatatccctttg9960

ttatatatatgtacatatctatcaacctagccctagcactttgtttttatagtttaaacc10020

aacccaaaacattggtcttgtaaaccaataatgaattattttctaaaaactttcagaaaa10080

aaagagtaactctttatctttaattcccaaaattaatattttttaaactatttcctgaat10140

ttattactctaaattttatgctgctagacaaaaacaaaacattttaaatctaacaaaaaa10200

aatcaaataattaatagaaacaggaagataactttttcatgctaaatatatcaatttatc10260

ataccgcagtcgaggtaaagtacctcggactcatacaaacccaaaagctactattacact10320

cttaaaataaaacattactctgaacggccccctacccaaaaaaaaaataacaaataaaac10380

cctcatgaatagaatacttgcgtattcagctataaaaattaatgcaaacccgccagcccc10440

gtactctgtattaaagccagagactagctcagattcaccttcagaaaaatcaaatggagt10500

tcgattagtctcagctaaacatgacctaaatcacaccattcttaaaggaaatctaattac10560

aacaaatcaaaaataattttgatatttattaaacaactctaaattaaatccaccaattaa10620

tattacaaaagataataaaattaaagctaacctaacttcataagaaatagtttgagctac10680

cgctcgcaaagaacctaataaagaatatttacaatttgatgatcatcccgccactatagt10740

tgaatacacccctacacttaaacaacacaaaaaaaacagaattctcagattaaaccttat10800

taatccagtttcataaggtaaaactgatcatactaataaagaaataaacaaactaaatac10860

aggacataaatagtaaactaaaaagtttgatatagtaggaataatttgttccttagtgaa10920

aagctttactgcatcagaaaaaggctgtaaaattcctatatagcctactttatttgggcc10980

tttacgaatttgaatataacctaaaatttttcgttcaagtaaagttacaaaagccacgcc11040

aattaaaacacacactattaataccaaaaaattaactatctctacaattattaaagtcac11100

aaaacaattagattactaataatttaactatttatagaattgctctattttataggatcc11160

taaatccaacacatattatctgccaaaatagtaatcattatataaaataattttaattat11220

ttaatcctttcgtactaaaataatttttctttattaaaagatagaaaccaacctggctta11280

cgccggtttgaactcaaatcatgtaaaattttaaaggtcgaacagacctacttatataac11340

tgctacaattataaagatattttaattcaacatcgaggtcgcaaacttttctttcgataa11400

gtactcttaagaaaaataacgctgttatccctaaagtaacttaaacttttaatctttaat11460

taggatcatttaaaattttaatcacatataagtgtacttaatgttaagcagttaataatc11520

attttactcttatcgccccaataaaataaattcaatttacaaaatctttataacctaaaa11580

tttgactatataaaatttaatattaagctttatagggtcttatcgtccctttaatacatt11640

taagccttttcacttaaaagtaaaattcaataaacaatataaagacagatcttcttttgt11700

ccaaccattcatacaagattccaattaaaaaactaacgattatgctacctttgcacggtc11760

aaaataccgcggccatttaatactatcaatcagtgggcaggttaaactttttataacttc11820

aaacagacatgtttttgataaacaggcaaagaagttatttttgccgagttcctttattcc11880

gccctatcaattttaaacaatatttattatttaaatgttttgctttaataaaaaactttt11940

actaataaaatcattataacttaactctttatatttaaattaattttttaatactccaaa12000

aaagtttatataaatattatccaattttaatttagctagaacactttataaatatagcta12060

cttttaagcctaattcaccaattaaactattttaaactatttatcattttaattataaga12120

agctaatccctcctacacttaaattttacatcttatcaacgtaaaaattaaattaaattt12180

actttttaaaaaactagatataataaaactcgactagcgtttcacctttaattttatatt12240

aaaaatttattttctacaaaaaattttttataaaattagctatattttatttcgagatat12300

ttaatttttattaacttatataaattttccctgatacacaaggtacaatatttaaaattt12360

tttacttcaaattttcttgctttcctttacagtactcttaactatagtttataaattgtg12420

tttattaaaaattactagcatgaacaaattacaaattatttttcataaatataaaatttt12480

caaatttatttaacaagtcattaataaatagatgggtaattattaatttataaagaaaat12540

atacatatcctcatctttactagatacactttccagtacatctactatgttacgacttat12600

ttcacttataaatgaaagcgacgggcgatatgtacacaatttagaacttatatcttgtta12660

gcttattaaactaaaaatacaatcaaatccatctttataataatattatcttattaatcc12720

gcagtaaagtaatttactgtaacccattttaccttgcttattggctgcaccatgatctaa12780

ttttactaaacaactaaatttaataatttttcctttaagaattatctgataatgatggta12840

tacaaactgttagaattactaaagcaagtaagatttttcgtggtttatcgattctaaaac12900

aggttcctctgaatagattaaattgccgccaaattttttaaattttaagtatttatcttt12960

tactaattcagttttatattaaatttattttagaataatagggtatctaatcctagttta13020

tttctaaacttttttagcttcaattataattttactccatacataataatatcctaattt13080

taccttttattacctgtatgagatttttaatttaatcatctaactataaccttagaattt13140

ttactcaatcttaaagtataaccgcgaatgctggcacaaatatatatcagattttaatat13200

tattactatatcacaccttcatgtataattttataatattttatgctgagacaataaagg13260

tttataattttatttcactcgaataccaatttaatatttaattaaattgtttaaatcaca13320

ctttaattttcatacaattttaataataatgtaaaaacttaagccaaaatcaaacatttg13380

tcgtgattgcaaataataactttaaaaaacttaaatatactatatataacataaaaatga13440

gaataagcttatacttaaagtataacttatacatcttaagcgccacaagctaacgtttta13500

atattttaaactatttaagttttgttataactaatattgctacaaatatatttattatct13560

acacaaaaacaaacaatataatcaccaacccaaccacaaaaatttttataaacactttaa13620

tattattaagttgtaactcatttaacaacctaaaatatttcttaaacaaaaaatacatcc13680

cctggccaccaaaatattcaaatcaccctttgtctcctaatttttcaacacctaccccac13740

taatgagactagaccctctaattttttttgtcctaagaaaaggtataaatcatatagacc13800

cccttattactactatcttataattattaatagattttaaattgtaacttacatttaata13860

aattaaatatataacctataactccccctgctaatcttacccccaacactatatttttca13920

ttattacattcaaacaaattatataaggctctgggaaaataacccaagatagaacagctc13980

ctataaaaatagctcttacacctagtaaaatcatagaatttcttataattttatcctcat14040

ccctaatatttattataactcttaaatttgaattacctcttaacctataaaaaattagac14100

gtatagtatacataactgttaaccctgtagctaaaatatataacagtaaagaaataaaat14160

taatccatctcataaaagccacctctaaaattatatctttagaataaaaccctgctaaaa14220

aagggaacccacataaggctaaatttgaaactcttataaaagacactcttaacggcataa14280

atttaattaaaccacctatacatcgaatatcctgataattgccaaccctatggataataa14340

tacctgcgcatataaataacaatgctttaaataatgcatgactcagcagatgaaaaaaag14400

aaagatcagggtatcctaaagctaaaatacttaacataacccccaattgacttaacgttg14460

ataaggcaataattttttttaaatcatattcaaaattggcccctaatcccgccataaata14520

tagttaagcaagaaataattaataatattccttggattttagaaccttctaacgcaccac14580

taaatcgaattattaaatacaccccagcagttactaaagtagaagaatgtactaaagcag14640

aaacaggagtaggagctgctatagcggcaggaagccatgctgagaaaggaatttgagcac14700

ttttagtcatagctcttaacattaacaaaaacttaaacaaaattcactcagtatctataa14760

tatagtaagaataaataacaaaatttcatctacctaacctggccattagtccaatactaa14820

gtaaaatagcaacatcacctactcgattagataagatagttaacatcccagcattagcag14880

acttttcattttgataaaaaattactaaagcataagaaactaaacctaatccatcccatc14940

ctaaaagaatacttaccaagttaggtcttaaaactattatagccatagataaaacaaaca15000

ttaaaactaaatatataaatcgattaaagtttttatcctccttcatatatctacctctat15060

aatacatcacacttccagaaataagcaatacaaaacacaaaaaaagtatcgaaattcaat15120

caaaaattaaaacaaacaccactgataatgaatttaatcttgctaaatcccattcaatta15180

cactagtaacaccactaaataattttattaaagaaactgttccacaaactaaagaccccg15240

ctcatagcccaagtattctaatcttatgtatataaattattcaaaccattatttaaatat15300

taaattattaatttaatacaaaatacagtaacatttctaccaatggtacaaaacaattag15360

tagtaattaaatctaaataaatcaaagcaaatcgatttgcacgataaatcttttcaacgt15420

aactgaaatgctgttctattttagctctgctttgacactatcatattatatttccaatct15480

actttacatttaaataatttattaaaaaaagctactaaaaatattaagaaatgataatac15540

tattatattatacaattttatttttctttatttatacggaggtatataaggtatatataa15600

atatatcacattagatataagtaaataatataaacaaatcaaatatataaaaattaaata15660

tgtatattcgcctccacaattataccccatccaatataatacaggatagataaaacatta15720

aaattataaaagggtaaaattataaataaatagaagtatataatgtcttagtttatatgg15780

aacattgaaacattttatataaaagtaaaaattatatgtaacttcattatataaatatat15840

gatttatactatttttatttattctatgggttgaaaaaaagtagtagtctcaaccctaga15900

ccctaattcctctagaggggaaacgggtctagaccgttgagactactactataatagggg15960

caaagaacattatattatatttaggtaaatataaattaaatatttaattatactaacaaa16020

taatttaacattaatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatata16080

tatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatata16140

tatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatata16200

tatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatata16260

tatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatata16320

tatatatatatgtatatatgtatatgtatatatgtatatgtatatatgtatatgtatata16380

tgtatatgtatatatgtatatgctttgtactctacaatatataatatctactatatac16438