Zm-Remorin基因在玉米茎腐病防治中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种zm-remorin基因在玉米茎腐病防治中的应用。

背景技术：

玉米是世界上最为广泛栽培的粮食作物之一。一方面，玉米为人类和动物提供了大量的食物来源，但另一方面，玉米病害的发生可导致巨大的经济损失。尤其是近年来玉米病害发生日益频繁，病害种类日益增多，严重影响了玉米产业的发展。化学农药的使用在一定程度上提高了对玉米病害的控制作用，但是农药的使用不仅污染了环境，长期使用还会使玉米产生耐药性，同时，造成的药物残留对人类的生命安全也有潜在的威胁。因此，在对玉米抗病的研究中，人们致力于寻找既不影响环境又对玉米病害能够有效防治的方法。

玉米茎腐病又称玉米茎基腐病、青枯病，该病害由多种病原菌单独或复合侵染引起，玉米茎腐病是典型的土传病害，致病菌在土壤、肥料、病残体或玉米种子上越冬，病残体及带病玉米种子是主要的初侵染源，病原菌借助风、水、机械及昆虫等进行传播，侵入根部及根茎部伤口，引起植株发病。由于近些年玉米自交系与杂交种在区域间引种频繁，导致茎腐病在玉米种植区大面积传播。相关报道指出，每年茎腐病在玉米主产区的发病率在10％-20％，一些年份更是达到60％，造成产量损失达25％(吴海燕等，2007)。近年来，虽然鉴定到了几个玉米茎腐病的数量抗性位点，但是抗性贡献率都有限，而且玉米茎腐病的抗性分子机理还知之甚少(zhangetal.2016)，因此，挖掘新的玉米茎腐病抗性基因及其抗性机理，对玉米的遗传改良和生产具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。

本发明提供了如下1)-3)中任一种物质在调控植物抗茎腐病中的应用；

1)蛋白zm-remorin；

2)编码蛋白zm-remorin的dna分子；

3)含有编码蛋白zm-remorin的dna分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述蛋白zm-remorin为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

上述应用中，所述dna分子是如下1)-4)中任一种的dna分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的dna分子；

2)编码区为序列表中序列3所示的dna分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的dna序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的dna分子；

4)与1)或2)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的dna分子。

上述应用中，所述调控植物抗茎腐病为提高植物抗茎腐病。

上述应用中，所述茎腐病为玉米茎腐病；

或所述茎腐病的病原菌为禾谷镰刀菌；

或所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

上述1)-3)中任一种物质在防治植物茎腐病害中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述1)-3)中任一种物质在培育抗茎腐病植物中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述1)-3)中任一种物质在培育高抗茎腐病植物中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述茎腐病为玉米茎腐病；

或所述茎腐病的病原菌为禾谷镰刀菌；

或所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为玉米。

本发明另一个目的是提供一种培育高抗茎腐病转基因植物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

提高目的植物中编码蛋白zm-remorin的dna分子的表达量和/或活性，得到转基因植物，

或，提高目的植物中蛋白zm-remorin活性，得到转基因植物，

所述转基因植物的抗茎腐病性高于所述目的植物；

所述蛋白zm-remorin为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

上述方法中，所述提高目的植物中编码蛋白zm-remorin的dna分子的表达量和/或活性为将所述编码蛋白zm-remorin的dna分子导入目的植物。

上述方法中，所述茎腐病为玉米茎腐病；

或所述茎腐病的病原菌为禾谷镰刀菌；

上述方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

或所述植物为单子叶植物，所述单子叶植物具体为玉米。

本发明的实验证明，本发明通过对zm-remorin转基因株系的抗病性鉴定和表达分析，研究发现，在接种禾谷镰刀菌后，转基因阳性株系的病斑扩展速度远远小于阴性株系，在病原菌入侵后，阳性株系能有效的阻止病原菌在植株体内的扩展。结合对病斑大小的差异性进行数据统计分析，在接种后5天、10天、15天、20天，转基因阳性株系和阴性株系的差异均达到了显著水平。可以发现，zm-remorin在玉米植株抵抗病原菌的侵染、扩展中发挥着重要的作用，可以显著提高对茎腐病的抗性。

附图说明

图1为zm-remorin在拟南芥中的亚细胞定位结果，每个图标尺都为50μm。

图2为bar基因pcr检测结果。

图3为接种方法及位置示意图。

图4为转基因株系的表型鉴定。

图5为转基因株系的病斑大小统计结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中玉米自交系b73为本实验室保存，大肠杆菌dh5α为本实验室保存，rna提取试剂trizolreagent，反转录试剂盒，琼脂糖凝胶dna回收试剂盒，t载体pmd18-t，taq酶，质粒提取试剂盒，限制性内切酶，t4连接酶，depc水均购自宝生物工程有限公司，测序和引物合成分别在华大和上海生工进行。

实施例1、zm-remorin基因的克隆

1、植物总rna的提取

提取玉米自交系b73四叶一心时叶片的rna。

2、植物dna提取

提取玉米自交系b73四叶一心时叶片的基因组dna。

3、cdna第一链的合成

将上述1得到的rna按照反转录试剂盒说明配置反转录体系进行cdna第一链的合成，得到cdna。

反转录如下：

rna6μl

oligo(dt)1μl

depc水4μl

65℃温浴5分钟，然后冰上放置2分钟，再加入如下试剂：

rnaseinhibitor1μl

m-mlvbuffer4μl

dntp(25nml)3μl

m-mlv反转录酶1μl

设置反转录pcr程序如下，

42℃1h

72℃10min

4℃forever

结束后保存于-20℃。

4、zm-remorin的克隆

1)cdna的克隆

设计引物如下：

zm-remorinf1：5'aaaaccggttgctattagtac3'；

zm-remorinr1：5'gaagaaaacaaaatgtctgc3'；目标片段长度971bp。

用上述3得到的cdna为模板，用zm-remorinf1和zm-remorinf1引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

上述pcr扩增体系如下：

上述pcr反应程序如下：

将上述pcr扩增产物连接到pmd18-t上进行测序，经过测序，该pcr产物具有序列1所示的基因，该基因命名为zm-remorin，该基因的orf序列为序列1，该基因编码的蛋白为序列表中序列2，该蛋白命名为zm-remorin。

2)dna的克隆

设计zm-remorindna扩增引物如下：

zm-remorinr2：5'gtgttgaacgaaacgaacgttgc3'；

zm-remorinf2：5'gtcatcaaataactgctagcat3'，目的片段1586bp。

zm-remorinr3：5'acgacgtggccatcgtaggtt3'；

zm-remorinf3：5'ctttggttgtgcataagcaggct3'。目的片段1443bp。

zm-remorinr4：5'tgctgttatctggtttatct3'；

zm-remorinf4：5'gatagagcgagaggaccaagca3'。目的片段2054bp。

分别以上述2得到的dna为模板，用上述3对引物进行pcr扩增，得到3种pcr扩增产物。将上述3种pcr扩增产物扩增产物经连接、转化、测序、拼接，获得了4140bp的zm-remorin的基因组dna序列(序列3)，通过和其cdna序列比对，发现zm-remorin基因dna序列含有5个外显子和4个内含子。

二、zm-remorin的亚细胞定位

b73玉米种子、拟南芥种子、载体质粒pcambia1304为本实验室保存。质粒提取试剂盒、限制性内切酶ncoi、spei、t4dna连接酶、pcr相关试剂等。共聚焦显微镜、离心机、移液器、摇床、凝胶成像系统、培养皿，载玻片，盖玻片，镊子等。

1、gfp融合表达载体的构建

gfp融合表达载体pcambia1304-zm-remorin-gfp为将序列表中序列1所示的zm-remorin基因替换载体pcambia-1304(记载在如下文献中：“ruchipandey,avinashmishra,g.k.garg.plantpromoterdrivenheterologousexpressionofhmwgluteningene(s)subunitine.coli.molbiolrep(2008)35:153–162.”；公众可从河南农业大学获得；该载体上有gfp)的ncoi和spei双酶切位点间的载体。

将上述pcambia1304-zm-remorin-gfp转入农杆菌gv3101中，得到重组农杆菌gv3101/pcambia1304-zm-remorin-gfp。

将空载体pcambia1304转入农杆菌gv3101中，得到重组农杆菌gv3101/pcambia1304。

2、拟南芥的转化

1)分别将gv3101/pcambia1304-zm-remorin-gfp和重组农杆菌gv3101/pcambia1304接种于500ml卡那抗性的yeb液体培养基(卡那霉素浓度为50μg/ml)中(同时接种几个不同克隆)，28℃振荡培养6-12小时(od600＝0.8-1.0)。

2)4000rpm/min，室温离心5分钟，收集菌体。

3)用200mlms盐溶液悬浮菌体。

4)将盛花期的野生型拟南芥(col-0)提前一天浇足水，拟南芥花序浸泡在农杆菌的悬液里一分钟左右，用保鲜袋套上保湿一天。第二天将植物从保鲜袋中取出来，黑暗放置一天后放回光照培养架上，正常生长至收获成熟t0代转zm-remorin拟南芥种子和t0代转空载体拟南芥种子。

3、转基因拟南芥阳性植株的筛选

1)转基因拟南芥的抗性筛选

根据实验室先前的实验，30mg/ml为潮霉素拟南芥筛选的最合适浓度，因此就以30mg/ml的潮霉素作为拟南芥抗性筛选的浓度。

将干燥后的t0代转zm-remorin拟南芥种子，播种于含有30mg/ml潮霉素的1/2ms平板培养基中，待到拟南芥长至6片叶左右时，能正常生长的为抗性筛选阳性t0代转zm-remorin拟南芥种子，将生长正常的拟南芥移至培养土中正常生长。

2)转基因拟南芥的pcr检测

抗性筛选阳性t0代转zm-remorin拟南芥移至营养土中生长至14片叶左右时，提取拟南芥基因组dna，进行pcr检测。

上述pcr检测所用引物为如下：

18sr：5'cctgcggcttaattgactc3'；

18sf：5'gttagcaggctgaggtctcg3'

检测pcr扩增产物，目的产物片段174bp为阳性t0代转zm-remorin拟南芥。

将上述转化株每代都要进行抗性筛选和pcr检测，阳性株分株收获，直到获得t3转zm-remorin拟南芥种子，进行后续试验。

4、zm-remorin在拟南芥中的亚细胞定位

参照上述拟南芥种植方法将t3代转zm-remorin拟南芥和t3转空载体拟南芥种植在含有潮霉素抗性的1/2ms平板培养基中，避光4℃春化3天后，移至光下(21℃)生长一星期(根系生长到大约6mm左右时)，剪取转化株的根尖，放置在载玻片的中间，滴一滴清水，盖上盖玻片，用拇指轻轻按压后，移至共聚焦显微镜下，观察绿色荧光蛋白在拟南芥细胞中的位置。

结果如图1所示，a、b、c是t3代转zm-remorin拟南芥根的荧光结果；d、e、f是t3转空载体拟南芥根的荧光结果；a、d是荧光信号下的拟南芥根细胞图片；b、e是明场信号下的拟南芥根细胞图片；c、f是a、b和d、e叠加后的照片；从图中可以看出，t3转空载体拟南芥根尖在细胞核、细胞膜和细胞质中均有荧光信号，而t3代转zm-remorin拟南芥的拟南芥根尖只在细胞膜中检测到荧光信号，说明zm-remorin蛋白是一个膜定位蛋白质。

实施例2、zm-remorin在玉米茎腐病防治中的应用

1、zm-remorin过表达载体的构建

zm-remorin过表达载体pcambia3301-zm-remorin为将序列1所示的zm-remorin基因替换pcambia3301载体(记载在如下文献中：“productionofpurple-coloredcreepingbentgrassusingmaizetranscriptionfactorgenesplandlcthroughagrobacterium-mediatedtransformation.plantcellrep(2009)28:397–406”中公开过，公众可从河南农业大学获得)中的ncoi酶切位点和bglⅱ酶切位点间的dna分子，得到的载体。

将上述pcambia3301-zm-remorin转入农杆菌gv3101中，得到重组农杆菌gv3101/pcambia3301-zm-remorin。

将空载体pcambia3301转入农杆菌gv3101中，得到重组农杆菌gv3101/pcambia3301。

2、转zm-remorin玉米的获得

将上述gv3101/pcambia3301-zm-remorin用农杆菌侵染的方法将其导入到玉米品种hiⅱ(以下也称为野生型玉米；玉米品种hiⅱ在文献“biolisticgun-mediatedmaizegenetictransformation.methodsmolbiol.(2009)；526:29-45”中公开过，公众可从河南农业大学获得)幼胚培养的愈伤组织，后续进行筛选和诱导再生(此方法参考文献“农杆菌介导的优良玉米自交系遗传转化体的建立。沈阳农业大学学报，2002—06，33(3)：195—199”)，获得t0代转zm-remorin玉米。

采用同样的方法将重组农杆菌gv3101/pcambia3301转入野生型玉米中，得到t0代转空载体玉米。

3、转zm-remorin玉米的鉴定

1)除草剂筛选(ppt：200mg/l)

t0代转zm-remorin玉米经过除草剂筛选(ppt：200mg/l)，具体如下：

首先用不同浓度的ppt涂抹非转基因玉米苗，确定合适的涂抹浓度；选取第二片新生玉米叶片，并于叶尖在正反两面同时涂抹不同浓度的ppt，所用浓度依次为50mg/l、100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l。一周后，观察叶尖表型。通过三次重复，发现当涂抹浓度为200mg/l时，叶尖开始明显枯萎，400mg/l时，叶尖基本都枯萎。所以，最终选择200mg/l的ppt来涂抹鉴定转基因苗。随后，对t0代转zm-remorin玉米苗进行涂抹鉴定，一周后进行表型观察，叶尖无明显枯萎的即为除草剂抗性苗，即为除草剂筛选阳性t0代转zm-remorin玉米。

2)报告基因bar基因pcr

待除草剂筛选阳性t0代转zm-remorin玉米植株生长至第4叶时,提取叶片基因组dna，用如下引物进行扩增：

barf8:tgacgcacaatcccactatccttc

barr8:ccagaaacccacgtcatgccagt

结果如图2所示，泳道均为除草剂筛选阳性t0代转zm-remorin玉米植株的不同株系，前两个泳道未检测出bar基因，后十个泳道均检测出了bar基因，可以看出，除了243、241株系外，其他株系均为阳性t0代转zm-remorin玉米植株。

播种，每代均进行除草剂筛选和bar基因pcr筛选，选择两种筛选均为阳性的作为下次自交母本，得到t2代转zm-remorin玉米植株和t2代转空载体玉米。

4、转基因玉米对茎腐病的抗性鉴定

供试病原菌：禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)ph-1在文献“rubellas.goswamiandh.corbykistler.headingfordisaster:fusariumgraminearumoncerealcrops.molecularplantpathology(2004)5(6):515–525.”中公开过，公众可从河南农业大学获得；具体从携带禾谷镰刀菌禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)ph-1的玉米叶片分离纯化保存。

1)菌株培养繁殖

将活化后的禾谷镰刀菌ph-1菌株置于pda培养基上，待菌株产孢后，用灭菌蒸馏水将孢子洗脱，配制成浓度为1×10^5个/ml的孢子悬浮液，待用。

pda培养基：将新鲜土豆洗净去皮，称200g切成小块，加水煮熟后用6层纱布过滤，称取20g葡萄糖和15g琼脂粉加入滤液，定容至ll，12l℃高压灭菌30min，取出制平板。

2)转基因玉米植株的种植

将t2代转zm-remorin玉米株系231、233、上述阴性株系241、243(非转zm-remorin玉米株系)和野生型玉米种植于温室中，待玉米10叶期时，准备接种。每个株系40株。

3)接种

首先，将2)的10叶期的t2代转zm-remorin玉米231、233、上述阴性株系241、243(非转zm-remorin玉米株系)和野生型玉米采用针刺法进行接种，接种位置在土上第三节间，针刺深度1cm，每株注射10μl1*10⁶的孢子悬浮液。

在接种后5天、10天、15天、20天分别进行病斑测量，测量方法为取接种后的玉米茎秆，用工具从中间劈开测量病斑(图3)。

结果如图4所示，可以看出，随着接种后天数的增加，所有株系的被侵染组织逐渐扩大，就株系之间的差异来说，株系241、243病斑的扩展速度明显比t2代转zm-remorin玉米231、233株系大。

野生型玉米和阴性株系241、243(非转zm-remorin玉米株系)无显著差异。

在接种后5天、10天、15天、20天进行病斑测量(对病斑在玉米茎秆中的纵向扩展长度进行测量；，对病斑的差异性进行数据统计分析。

结果如图5所示，阴性株系241、243和t2代转zm-remorin玉米231、233株系间的差异在5天、10天、15天和20天都达到了显著水平。

序列表

<110>河南农业大学

<120>zm-remorin基因在玉米茎腐病防治中的应用

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>597

<212>dna

<213>1

<400>1

atggctgaggaggaggccaagaaggtggaggtggaggtcaccaaggagcccgaggcggcg60

gcgaaggaggacgtagccgatgacaaggccgtcatccccgcgaccgacccgccgccgccg120

ccgccgccggccgacgactccaaggccctggccatcgtcgagaaagttgcagatgaacct180

gctcccgcgaagcctgcccctgcgaagcaagggggctccaatgacagggatctcgctctt240

gcaagggtggaaacagagaagaggaactctttgatcaaagcttgggaagagaatgagaag300

acaaaagctgagaacaaggctgctaagaaagtatccgctattctttcatgggaaaacaca360

aagaaagcaaacatagaagctgaactgaagaagattgaggaacaactggaaaagaagaag420

gctgaatatgcagagaagatgaagaacaaggttgcaatgatacacaaggaagccgaagag480

aagcgagcgatggtggaggcaaaacgcggtgaggaggtcctgaaggccgaggagatggct540

gccaagtaccgggccaccggccacgctcctaagaagctcatcggttgcttcggagcc597

<210>2

<211>199

<212>prt

<213>2

<400>2

metalaglugluglualalyslysvalgluvalgluvalthrlysglu

151015

proglualaalaalalysgluaspvalalaaspasplysalavalile

202530

proalathraspproproproproproproproalaaspaspserlys

354045

alaleualailevalglulysvalalaaspgluproalaproglulys

505560

proalaproalalysglnglyglyserasnaspargaspleualaleu

65707580

alaargvalgluthrglulysargasnserleuilelysalatrpglu

859095

gluasnglulysthrlysalagluasnlysalaalalyslysvalser

100105110

alaileleusertrpgluasnthrlyslysalaasnthrglualaglu

115120125

leulyslysileglugluglnleuglulyslyslysalaglutyrala

130135140

glulysmetlysasnlysvalalametilehislysglualagluglu

145150155160

lysargalametvalglualalysargglyglugluvalleulysala

165170175

gluglumetalaalalystyrargalathrglyhisalaprolyslys

180185190

leuileglycyspheglyala

195

<210>3

<211>4140

<212>dna

<213>3

<400>3

atggctgaggaggaggccaagaaggtggaggtggaggtcaccaaggagcccgaggcggcg60

gcgaaggaggacgtagccgatgacaaggccgtcatccccgcgaccgacccgccgccgccg120

ccgccgccggccgacgactccaaggccctggccatcgtcgagagtgagtacagcctgctc180

tctgctctgctttattaattaattctgcccccctctatgtagtccaaggcttgcgatgga240

aacatggcgctggcggactggtgtgtgctttagattcatgtgccgcgaattgggagaaac300

tttcctcctctctctaccctatgttttggttcgtcgctctgtactttctggtagctgtac360

tgtggctggcagtactaggtacttgtgacttgtaatccttggcagtcggtttgcttctcc420

ttttcatgggttccctgatttgttgccggcgtgatcctttggtgttggttgtacttgtac480

acccgaacgtatttggtccgattacttctcttagacaacaaaattttcttgttagggggt540

tgtgaggtgcaaatcacattggaaccttcgaccaagttctaaagtactctagttctgtcg600

taaaaaaaaacgtactgaagtaaatctgcgagtcatcgattttcaggattatttaccagc660

ttcctaactggtttccccctttttttagagtggtagccacgcctgctaacttgccaacta720

ctacggacgaattgcttgtcaagttccgaaagggcgcacggggtaaaaaggttttaacat780

ttttgggatagtcgcctcacttcgaaaattggttttaggacgacgtggccatcgtaggtt840

tttggtttgagggttctaaaagtatgctagcagttatttgatgactaggcatgtagtatt900

tcctttgcttgcgatttattttcagcgaaaatttcagattttgattcagagaaaaagatg960

gctctggaactttcctgaattctccactttctctccgccttttgggcgtgttcggctggc1020

tacaagccgacactgttgcagctgtttggattgctgcagctgcaatccatagagagaaaa1080

atactgtagaagccgcagccgcagccggattgcagccgcagcaagccgcagcgaacaagc1140

tgtttgtcccttgttgcctgctcttatcgttcttccctttattcaatccctgttccctct1200

aaaataacaaaaaaaaggccttagggcctgtttgtttcggcttctggcagcttctggcca1260

ccaaaatctgctgcggactgccaaacgctcagcttttcagccagcctctataaaattcgt1320

tgggggcaaaaaccatccaaaatcaacataaacacataaccggttgagtcgttgtaatag1380

taggaatccgtcactttctagatcctaagtcctatgaataactttatcttcctccacacg1440

taatcgtaatgatactcagattcttcccatagccagattcttcctacagtcagattttca1500

gaaaaactggtcagaaaaaactgaaccaaacatgcccttagaatctgcatgtatgccgac1560

cgtttttctatctcagtataatgacgtgcaggcgcagctttcgcgttcaaaaaagaataa1620

atcctaaactctatagaaagattcgaagtttcatgctaagaggaaagtaatcagacagaa1680

acaaaggagtatgaagaacaattttgcatactgttaagaaagttagaatttaccataaac1740

cttattatgattcatctgtcatttgaaatctgtactcactaatctaaatcgaacaacaaa1800

gcaggaaaaaaacagaatttgtcttttctaacacccaaataattcctccatgatttgaag1860

aaataggaagaactgtctgatacttcacaaaaaatagacatgccccatcacagcttgatg1920

acaattgctttctgttgctgctaagtcttcaaagatgtacatcagttccttgcataggcg1980

ggcaaatgatgaaaccatgcgcttttgaagcattcagtttcactaaggttatgcagatat2040

acaaaataagctcctgaaaattcaacttatttctattctttaaatagccaaaaacatgag2100

catataatcaaccgaacagagtgggtggcaaatttgagctggcgttccagttccaggcaa2160

cttgctgttatctggtttatctattttatcatgttgatccatcatccatctttagttata2220

tgcctatattaatcctccaaagcctgcttatgcacaaccaaagccgtcttgcctggaact2280

atatatttttctcgaggcacaaaaatttagcaaggtgccaacatacttgtatacaagttg2340

aacattatgtctcacacatacagctaattaatcaaccaagacaccatattctaaaaattt2400

gttaaacacagcacaaatacatagaagaatattcagttttgtagtcactagtttttttta2460

attattttgcattaactatgctggtgacctggtcttggatcttcagaagaccaaccactt2520

tcgttttctgaacaaaaagacaagagctctgccactctttgagaagaagagcagaagact2580

gaccattgaatacttagaagttggaacactatgtcatcatttggtaattccttcctgaaa2640

gatctagagaggtttctatggttactatcaatactatctattgctttgtagttcgtgtag2700

tttagaataagattaatcctacgcatgcaagagtgtactagtcaaataagagaaaggaaa2760

tctacaatctttctcactgaacaagctatgtaagcagcagttacgcaggacctggatatg2820

gacacaaataagttgagcattgcaaactcaagtgcatgctcctgcaaagataatagtata2880

gcgacataaattacattttgctctgtgatgctaatgggttggattggatcattgatcagc2940

atacaaccacttgctagcttctttcttccatataaaattgttcagcaaaaactgtttatg3000

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