一种三七类甜蛋白基因PnTLP5及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种具有抗真菌活性的三七类甜蛋白基因pntlp5及应用。

背景技术：

三七（panaxnotoginseng）是中国历史悠久的中草药。三七主产于云南文山州砚山县、马关、西畴、广南、麻栗坡、富宁、邱北等，另广西田阳、靖西、田东、德保等地也有种植。云南文山州的三七历史悠久、产量大、质量好，习称“文三七”、“田七”，为著名的道地药材。三七常年生长在阴蔽环境中，病虫害发生较为严重，据统计，三七上发生的病虫害大约有20多种。其中，主要的有根腐病、黑斑病、圆斑病、疫病、白粉病、蛞蝓、地老虎、蚜虫、介壳虫、尺蠖等，三七每年都因病虫的危害造成极为严重的损失。因此，加强三七病虫害防治是保证三七产量、质量的一项主要措施。

三七栽培中的病害问题比较突出，其中三七黑斑病就是七园中一个主要病害。三七的茎、叶、花均可受害，被害部初期呈椭圆形浅褐色病斑，继成黑褐色，病斑向上下扩展、凹陷，最后出现茎干或花盘扭折死亡。受害三七轻者产量、质量下降，重者减产90%以上。目前对三七真菌病害的控制有如下几种方式：使用化学杀菌剂；采取轮作、避免带菌土壤和带病原植物材料的传播等。但是无论是化学杀菌还是轮作都不能从根本上解决三七病害的问题。但是随着分子生物学理论和技术的不断发展，使人们不但能够从分子水平上深入认识植物与病原物相互作用的机制，而且还可以通过基因工程快速和高效地培育抗病作物新品种，是提高植物抗病能力的新方法。

病程相关蛋白(pathogenesis-relatedproteins，prs)最早从烟草(nicotianatabacum)花叶病毒(tobaccomosaicvirus，tmv)侵染的烟草叶片中发现，依据氨基酸组成、生物化学和血清学特性，将prs分为17个不同的蛋白家族，即pr-1~pr-17。由于pr-5家族中一些蛋白质的氨基酸序列与西非竹竽(thaumatococcusdaniellii)甜蛋白（thaumatin）的氨基酸序列高度同源，因此又被称为类甜蛋白(thaumatin-likeproteins，tlps)（李文娴,刘迪秋,等.类甜蛋白的结构特征以及功能研究进展.中国生物工程杂志,2010,30(3):100-104.）。tlps在高等植物内广泛分布，包括花粉管壁、精细胞壁、筛管端壁等，它们在植物正常生长发育中发挥重要作用。更重要的是，tlps在植物的抗病过程中也扮演着重要角色。tlps与植物的抗逆反应有关，当植物受到病原物、化学因子、物理因子等胁迫时，tlps基因在植物体特定部位迅速表达并积累(姜晓玲,黄秋娴,等.植物类甜蛋白基因家族研究进展.浙江农林大学学报,2012,29(2):279-287.)。许多研究发现植物tlps具有显著的抗真菌活性，一些转tlps基因的植株对于真菌病害的抗性也显著增强，因而近年来，tlps的抗真菌功能在植物病理学研究中受到越来越广泛的关注。

已知的tlps均属于糖基水解酶第十七家族，tlps最为重要的结构特征在于其分子中由16个半胱氨酸残基配对形成的8个二硫键，由于这些二硫键的存在，使得tlps具有了相对稳定的化学结构，能够抗热、抗酶解和抗酸碱。如胡萝卜tlps均含有16个半胱氨酸残基，多数均具有类甜蛋白家族标签g-x-[gf]-x-c-x-t-[ga]-d-c-x-（1，2）-g-x-（2，3）-c和5个保守的reddd氨基酸残(liud,hex,etal.molecularcloningofathaumatin-likeproteingenefrompyruspyrifoliaandoverexpressionofthisgeneintobaccoincreasedresistancetopathogenicfungi.plantcell,tissueandorganculture（pctoc）,2012,111（1）：29-39.)。一些tlps含有n端信号肽，用于引导成熟的蛋白到分泌路径。如湖北海棠类甜蛋白基因mhpr5n端还含有1个由25个氨基酸残基组成的信号肽(张计育，湖北海棠抗病相关基因的克隆及其功能分析.南京农业大学，2011)。tlps蛋白质的三级结构一般由3个结构域构成，结构域ⅰ由11个β片层(β-sheet)反向平行折叠形成，结构域ⅱ和结构域ⅲ主要由α螺旋区域构成，而结构域ⅰ和结构域ⅱ之间形成一个具有强烈电负性的裂缝（cleft）。然而也有一些特殊的tlps，其三级结构只具有结构域ⅰ和结构域ⅱ，甚至有些tlps仅仅包含结构域ⅰ，因此，植物tlps的分子量大小不等，一般为16~40kda。

tlps基因的表达与植物生长环境和植物抗病性有关。雪松(juniperusashei)花粉中具有过敏原活性的tlps在不同年份的含量差别高达5.0倍以上(azamani,rnsturrock,etal.genecloningandtissueexpressionanalysisofapr-5thaumatin-likeproteininphellinusweirii-infecteddouglas-fir.phytopathology,2004,94(11):1235-1243)。大麦（hordeumvulgare）和燕麦（avenasativa）从子房壁发育到糊粉层的过程中，tlps基因的表达发生了改变。一种胡椒tlps基因也是在果实成长过程中表达。小麦冠腐病菌（fusariumpseudograminearum）侵染4天后，小麦抗病品种中tlps基因表达显著高于感病品种。然而，也有一些tlps基因对病原菌胁迫不敏感，而在植物受到化学或物理因素诱导时大量表达(姜晓玲，黄秋娴等.植物类甜蛋白基因家族研究进展.浙江农林大学学报,2012,29(2):279-287)。

tlps抗菌作用主要体现在其独特的结构域与酸性裂缝上。黑麦(secalecereale)中的tlps结构域i中的酸性残基与真菌细胞膜上的水通道蛋白、离子通道蛋白和渗透感受器之间的相互作用，使得tlps具有了抗真菌活性（chany,griffithm,etal.cloningofacdnaencodingthethaumatin-likeproteinofwinterrye(secalecerealel.musketeer)anditsfunctionalcharacterization.journalofexperimentalbotany,1999,50(339):1627-1628）。tlps与病原菌β-1,3-葡聚糖的结合发生于裂缝区域，裂缝区域内的几个残基与真菌细胞壁的碳水化合物形成氢键，并且芳香族氨基酸在裂缝处参与形成堆积力共同破坏了真菌细胞壁的结构，使tlps与细胞膜接触，造成真菌细胞死亡。改变细胞壁结构是tlps抑制真菌侵染的先决条件。tlps除了与细胞壁上的β-1,3-葡聚糖特异性结合改变细胞壁结构外，还可以通过其他途径改变细胞的结构。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种从三七中克隆获得具有抗真菌活性的类甜蛋白的全长基因pntlp5，三七类甜蛋白基因pntlp5核苷酸序列如seqidno:1所示，该基因cdna全长序列为1170bp，包含一个726bp的开放阅读框、186bp的5’非翻译区、258bp的3’非翻译区，编码如seqidno:2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明分离克隆三七的一个抗真菌相关基因的完整cdna片段，利用根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)介导法将目的基因转入受体植物中并过量表达，通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草以及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将这个基因命名为pntlp5。

本发明将三七病程相关蛋白5家族类甜蛋白基因pntlp5应用在提高烟草对茄腐镰刀菌（fusariumsolani）、轮枝镰刀菌（f.verticillioides）、核盘菌（sclerotiniasclerotiorum）、人参链格孢（alternariapanax）、葡萄座腔菌（botryosphaeriadothidea）抗性中，具体操作如下：

（1）采用异硫氰酸胍法提取三七幼嫩叶片的总rna，以提取的rna为模板，以oligo(dt)15为反转录引物，通过逆转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，rt-pcr)扩增出pntlp5的编码区，然后将其连接到pmd-18t载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

（2）用限制性内切酶bamhi和ecori酶切pmd-18t-pntlp5，通过胶回收得到目的基因片段，用同样的内切酶酶切植物表达载体pcambia2300s，胶回收获得所需载体大片段，再将所获得pntlp5基因片段与pcambia2300s片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；

（3）以重组载体t-dna上具有的标记（卡那霉素抗性基因）筛选再生的烟草植株，并通过pcr以及rt-pcr检测得到真正的转基因植株，分析转基因植株叶片蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料；本发明中来自三七的类甜蛋白基因pntlp5能增强植物对多种病原真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产粮食作物、经济作物、中草药、观赏植物等提供方便，减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减少环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明部分pntlp5转基因烟草基因组dna的pcr检测结果，图中：marker为dl2000dnamarker(大连宝生物)；阳性对照为质粒pmd-18t-pntlp5为模板的pcr结产物；wt为非转基因烟草(野生型)总dna为模板pcr的产物；

图2是本发明部分阳性pntlp5转基因烟草中pntlp5转录水平的表达分析结果图；图中：marker是dl2000dnamarker(大连宝生物)；wt是非转基因烟草总rna逆转录cdna为模板的pcr产物；阳性对照是质粒pmd-18t-pntlp5为模板的pcr产物；

图3是本发明pntlp5转基因烟草体外抑菌活性效果图；图中a、b、c、d、e分别是核盘菌、人参链格孢、轮枝镰刀菌、茄腐镰刀菌、葡萄座腔菌；wt为野生型烟草的总蛋白；buffer为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：pntlp5全长基因克隆以及序列分析

取三年生三七叶片提取总rna，用液氮将三七叶片研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总rna，采用逆转录酶m-mlv(promega)以总rna为模板合成cdna第一链，反应体系和操作过程为：取5μgtotalrna，依次加入50ngoligo（dt），2μldntp（2.5mmeach）、depc水至反应体积为14.5μl；混匀后，70℃加热变性5min后迅速在冰上冷却5min，然后依次加入4μl5×first-standbuffer、0.5μlrnasin（200u）、1μlm-mlv（200u），混匀并短时离心，42℃温浴1.5h，取出后70℃加热10min，终止反应。cdna第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cdna为模板，扩增目的基因pntlp5，所用上下游引物序列分别为5’ttgtcaacttaaacaatatgagcta3’及5’aaccttttaacttattggaactgct3’。采用advantage^tm2pcrenzyme（clontech）扩增出目的基因；pcr反应条件：95℃2min；95℃30s，57℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；反应体系（20μl）为1μlcdna、2μl10×advantage2pcrbuffer、1.8μl50×dntpmix（10mmeach）、0.2μl正向引物（10μm）、0.2μl反向引物（10μm）、0.2μladvantage2pcrpolymerasemix、14.6μlpcr-gradewater；pcr结束后，取5μl用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性以及大小。

琼脂糖凝胶电泳结果显示pcr产物只有一条dna带，因此直接对pcr产物进行ta克隆，使用的试剂盒为pmd18-tvectorkit（大连宝生物），反应体系和操作过程为：取1.5μlpcr产物，依次加入1μlpmd18-tvector（50ng/μl）和2.5μl2×ligationsolutioni，混匀后置于16℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌dh5α中。使用含有氨苄青霉素（ampicillin，amp）的lb固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增pntlp5的特异引物鉴定出多克隆位点插入pntlp5的克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的pntlp5全长cdna为1170bp，通过ncbiorffinder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析发现其包含一个726bp的开放读码框（见序列表），pntlp5编码一个含241个氨基酸的蛋白质pntlp5，其蛋白质分子质量为26.4kd，等电点(pi)为7.75，表明该蛋白为碱性蛋白。其中包括16个酸性氨基酸（d，e）、19个碱性氨基酸（k，r，h）、113个疏水氨基酸和89个亲水氨基酸。利用smart进行基因结构分析发现，pntlp5具有一个可能的信号肽。

实施例2：植物超表达载体构建

采用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒（上海生工）提取插入pntlp5的大肠杆菌质粒pmd-18t-pntlp5以及植物表达载体pcambia2300s的质粒，取1μl用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶bamhi（takara）和ecori（takara）分别对质粒pmd-18t-pntlp5和pcambia2300s进行双酶切（100μl体系），反应体系和操作过程为：取20μlpmd-18t-pntlp5和pcambia2300s质粒、依次加入10μl10×kbuffer、5μlbamhi、5μlecori、60μlddh2o，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应；将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对pntlp5片段和pcambia2300s载体大片段分别进行胶回收；取1μl回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。

利用t4dnaligase（takara），将回收的pntlp5dna片段和pcambia2300s载体片段连接起来，反应体系（20μl）和操作过程为：取10μlpntlp5dna片段依次加入2μlpcambia2300s载体dna、2μl10×t4dnaligasebuffer、1μlt4dnaligase、5μlddh2o，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌dh5α中，用含有50mg/l卡那霉素（kanamycin，km）的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增pntlp5的特异引物进行pcr，挑选出pntlp5与pcambia2300s成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入甘油并置于-80℃保存备用。

采用sanprep柱式质粒抽提试剂盒提取并纯化上述大肠杆菌中的pcambia2300s-pntlp5质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pcambia2300s-pntlp5转入根癌农杆菌lba4404感受态细胞中。操作步骤为：取2μgpcambia2300s-pntlp5质粒加入含有200μl感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，随后转入液氮中冷冻1min，然后迅速置于37℃水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800μllb液体培养基于28℃振荡培养4h。将活化后的农杆菌涂于含有50mg/lkm的lb固体培养基上，28℃静止培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增pntlp5的特异性引物进行pcr，检测pcambia2300s-pntlp5是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1%的hgcl2浸泡8min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2ms培养基上，28℃暗培养6d，发芽后转至光照培养箱（25℃，16h/d光照），以后每月用1/2ms培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有pcambia2300s-pntlp5质粒的农杆菌lba4404菌种，接种于5ml含有50mg/lkm和20mg/l利福平的lb液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1ml浑浊的菌液至含有50mg/lkm的lb固体培养基上，28℃培养48h；随后将lb固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20mg/l的乙酰丁香酮的mgl液体培养基中，28℃振荡培养2-3h以活化农杆菌。

取烟草无菌苗叶子切成1cm²左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的mgl液体培养基中，浸染时间为15min，用无菌滤纸吸干叶盘表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养，烟草转化的共培养基为ms+0.02mg/l6-ba+2.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+6g/l琼脂，22℃无光条件下共培养2天。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的ms筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+6g/l琼脂+50mg/lkm+200mg/l头孢霉素（cefotaximesodiumsalt，cef）；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养（25℃，16h/d光照，8h/d黑暗），待烟草长出芽后用含有50mg/lkm和200mg/lcef的ms培养基继代培养，最后选择生根较好的再生苗进行pcr检测。

采用ctab法提取转基因烟草植株叶片的基因组dna，将提取的基因组dna取1μl通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组dna为模板用扩增pntlp5的特异引物进行pcr，pcr结束后，取8μl产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株，部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，pntlp5转基因烟草共筛选到30株阳性转基因植株。

实施例4：转基因烟草中pntlp5的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析

取阳性转基因单株以及非转基因烟草（野生型）的嫩叶提取总rna，逆转录生成cdna第一链，并以此为模板用扩增pntlp5的特异引物进行pcr，根据pcr结果分析各转基因单株中pntlp5转录水平的表达，总rna提取以及rt-pcr的方法与实施例1中相同，pcr结束之后，取5μl用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示。

将实验室保存的几种真菌接种于pda固体培养基（200g/l马铃薯，15g/l琼脂，20g/l葡萄糖）上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作，首先取1g转基因烟草单株（编号分别为4、11、19、26）及野生型叶片放入研钵中，加入1ml蛋白提取液（1mnacl，0.1m乙酸钠，1%pvp，ph6），充分研磨；转入1.5ml离心管中，混匀后4℃静置过夜，4℃离心30min（12,000g/min），取上清于新的1.5ml离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至1.2μg/μl，然后分别取20μl滴于各真菌培养基的无菌滤纸上，在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照（提取蛋白所用的溶液），28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价pntlp5转基因烟草的体外抗真菌活性，结果如图3所示，pntlp5转基因烟草叶片蛋白对核盘菌、人参链格孢、轮枝镰刀菌、茄腐镰刀菌、葡萄座腔菌的生长具有很强的抑制作用。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>一种三七类甜蛋白基因pntlp5及应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1170

<212>dna

<213>panaxnotoginseng

<400>1

ggccgcctctagttttagtacaatatagtggcggtattctttaactaaaataatgacaag60

tcagaagagtggcttatctaggtgaagttaaaagccgcccttaccctatataaatccttc120

atttgctcacaataaaaaaccaagctcaaattatacaaatattaatttgttgtcaactta180

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gcttcgccaggtggtggtcgtcgacttaaccgaggcgaaacttggtggttatatgcacct360

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165170175

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210215220

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225230235240

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<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>3

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<213>人工序列(artificial)

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