动脉粥样硬化分子标志物及其应用的制作方法

本发明涉及动脉粥样硬化领域，特别是涉及一种动脉粥样硬化分子标志物及其应用。

背景技术：

动脉粥样硬化是一种慢性炎症疾病，它主要是由于低密度脂蛋白(ldl)代谢发生紊乱，在血管内皮下层的内膜沉积所引发的。在临床上，动脉粥样硬化与心肌梗死、中风、缺血性心脏疼痛以及高血压等这些常见心血管疾病的发生都有着密切的关系。目前，由动脉粥样硬化所引发的心脑血管疾病已经成为危害人类健康的主要疾病之一。据世界卫生组织who的最新数据统计显示，死于心脑血管疾病的人数占所有非传染疾病总人数的48％，是死于癌症人数的两倍以上。因此，进一步研究动脉粥样硬化的发病机理，探寻能够作为动脉粥样硬化临床诊断的重要标志物具有十分重要的意义。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种能够作为动脉粥样硬化临床诊断的标志物的动脉粥样硬化分子标志物。

一种动脉粥样硬化分子标志物，所述动脉粥样硬化分子标志物为长链非编码rna，其具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种pcr扩增引物，包括用于特异性扩增上述动脉粥样硬化分子标志物的上游引物和下游引物。

在其中一个实施例中，所述上游引物具有如seqidno.2所示的核苷酸序列，所述下游引物具有如seqidno.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种小干扰rna，包括互补的有义链和反义链，且所述小干扰rna能够特异性地抑制上述动脉粥样硬化分子标志物的表达。

在其中一个实施例中，所述有义链具有如seqidno.2所示的核苷酸序列，所述反义链具有如seqidno.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述动脉粥样硬化分子标志物、上述pcr扩增引物或上述小干扰rna在制备诊断或检测动脉粥样硬化的产品中的应用。

在其中一个实施例中，所述产品为检测试剂、试剂盒、基因芯片或检测试纸。

本发明还提供了上述动脉粥样硬化分子标志物、上述pcr扩增引物或上述小干扰rna在制备用于预防或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。

本发明还提供了一种用于检测动脉粥样硬化的试剂盒，包括上述pcr扩增引物。

在其中一个实施例中，还包括rna提取试剂、逆转录试剂和pcr扩增试剂中的至少一种。

人类30多亿个碱基对的基因序列中三分之二的序列被反转录，而最终仅有不到2％的核酸序列用于编码蛋白，大部分基因不表达蛋白质，这一类基因被称为非编码rna。非编码rna包含短链非编码rna和长链非编码rna，它们可能在多个层面上参与细胞分化和个体发育调控，与各种疾病密切相关。本申请的发明人在研究中发现，长链非编码rnahoxa-as2(序列如seqidno.1所示)在动脉粥样硬化病人的外周血单核细胞中的表达量明显高于正常人的外周血单核细胞中的表达量(p值＜0.05)，能较好地反映动脉粥样硬化的进展状况，因此可以作为动脉粥样硬化的临床诊断分子标志物，并应用于制备诊断或检测动脉粥样硬化的相关产品，从而丰富了动脉粥样硬化的诊断和检测手段。

动脉粥样硬化的发生与血管内皮细胞的异常有着直接的关联。在动脉粥样硬化的早期，由于低密度脂蛋白的代谢紊乱，会引发血管内皮细胞的炎症反应，从而促使内皮细胞分泌大量的粘附因子、趋化因子等炎症因子。这些炎症因子的分泌会促进单核细胞和内皮细胞之间的粘附作用，使得单核细胞穿过内皮细胞间隙进入到内皮下层的血管内膜。进入到内膜后的单核细胞可以被氧化型的低密度脂蛋白诱导成为巨噬细胞并吞噬脂蛋白，从而逐步形成泡沫细胞，最终导致硬化斑块的形成。发明人通过进一步的研究发现，该动脉粥样硬化分子标志物能够抑制单核细胞thp-1与血管内皮细胞huvecs之间的粘附作用，以及抑制粘附因子、趋化因子以及细胞因子等炎症因子的表达，从而得以有效地抑制血管内皮炎症的过度活化，因此还可以作为抑制动脉粥样硬化的形成及发展的分子药物靶点，为进一步研究动脉粥样硬化的发病机理，探索其防治药物提供新的实验理论基础和方向。

附图说明

图1为动脉粥样硬化病人和正常人的外周血单核细胞中动脉粥样硬化分子标志物的表达量的对比；

图2为sirna对动脉粥样硬化分子标志物表达量的干扰抑制效果的对比；

图3为sirna降低动脉粥样硬化分子标志物的表达对单核细胞和内皮细胞之间粘附作用的影响；

图4为sirna降低动脉粥样硬化分子标志物的表达对粘附因子vcam1和icam1、细胞因子il6以及趋化因子ccl2的表达量的影响；

图5a为动脉粥样硬化分子标志物的过表达效率检测结果，图5b为过表达动脉粥样硬化分子标志物对单核细胞和内皮细胞之间粘附作用的影响；

图6为过表达动脉粥样硬化分子标志物对粘附因子vcam1和icam1、细胞因子il6以及趋化因子ccl2的表达量的影响。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下面主要结合具体实施方式和附图对动脉粥样硬化分子标志物及其应用作进一步详细的说明。

一、检测对比正常人和动脉粥样硬化病人的外周血单核细胞中动脉粥样硬化分子标志物的表达量

1.1外周血单核细胞的分离制备

分别从正常人(10例作为对照组)和动脉粥样硬化病人(10例作为实验组)的淋巴细胞分离液(购自天津灏洋生物公司)分离外周血单核细胞，离心后吸取中间的白膜层。然后用0.9％的氯化钠溶液洗涤两次，再用含10％pbs的x-vivo培养液重悬细胞，并调整细胞的浓度为1×10⁶个细胞/ml。

1.2rna的提取

分别取外周血单核细胞50μl至1.5ml的ep管中，加入500μl的trizol试剂。用移液枪吹吸至不再粘稠后，往ep管中加100μl氯仿(trizol体积的五分之一)，充分剧烈震荡后(变浑浊)静置5min。12000rpm离心10min，离心后分三层，rna在最上层，中间层为蛋白，最下层为有机相。吸取上清至新的ep管中，加入等体积的异丙醇，震荡混匀，于-20℃放置20min，使rna沉淀完全。12000rpm离心10min，去上清留沉淀，加500μl75％的乙醇洗涤。然后12000rpm离心5min，去上清，重复洗涤一次。室温下放置5～10min晾干，加入20μldepc水，室温下溶解30min。

1.3分光光度计测量rna浓度

分别取2μlrna，加入198μldepc水，混匀后在分光光度计中分别测量od230、od260和od280评估核酸质量，并根据以下计算公式得到rna浓度。

1.4消化并去除rna中的残留基因组dna

以消化5μgrna为例，依次加入0.4μlrna酶抑制剂(40u/μl)、1μl脱氧核糖核酸酶、2μl10×脱氧核糖核酸酶缓冲液和5μgrna，并加入depc水补齐至20μl体系。然后放入pcr仪中，进行如下程序：37℃，30min(脱氧核糖核酸酶消化dna)；68℃，10min(使脱氧核糖核酸酶失活)。

1.5逆转录

以逆转录1μgrna为例，先加入4μlrna(1μg)、2μl随机引物(25μm)和6μldepc水配制成12μl体系，混匀后放入pcr仪，程序如下：70℃，10min(打开复杂的rna结构)；然后立即置于冰上3～5min(使rna模板结合上随机引物)。在以上体系中再加入1μldntp(10mm)、4μl5×逆转录缓冲液、0.5μl反转录酶(mlv)和2.5μldepc水，混匀后放入pcr仪中，程序如下：30℃，10min；42℃，1h；70℃，15min。

1.6qrt-pcr检测

首先在ncbi数据库中找到hoxa-as2的rna序列(refseq序列号：

nr_122069.1，具体序列如seqidno.1所示)，依据hoxa-as2的序列进行引物设计并进行合成，上下游引物(引物-f和引物-r)序列分别如seqidno.2和seqidno.3所示。将逆转录得到的cdna作为模板配制以下反应体系：

然后放入荧光定量pcr仪中进行如下扩增程序：95℃，7min；40个循环：95℃，10s；60℃，30s。扩增完毕后进行熔解曲线分析：95℃，15s；60℃，15s；95℃，15s。利用2^-δδct相对定量法对正常人和动脉粥样硬化病人的外周血单核细胞中的hoxa-as2表达量进行比较分析。

结果如图1所示，动脉粥样硬化病人的外周血单核细胞中hoxa-as2的表达量明显比正常人的外周血单核细胞中hoxa-as2的表达量要高(图中*代表p值﹤0.05)。

二、动脉粥样硬化分子标志物sirna序列的设计及其干扰效果的检测

rna干扰(rnai)技术是指在进化过程中高度保守的、由双链小分子rna诱发的同源mrna高效特异性降解的现象，rna分子通过破坏特定mrna，以抑制某种基因表达的生物学过程。它是一种在动植物中广泛存在的序列特异性转录后水平的基因沉默过程，是生物基因组抵抗病毒之类的外来遗传原件入侵的一种生物保护机制。由于使用rnai技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术迅速成为基因功能研究和基因治疗研究领域最受关注的研究工具之一，已被广泛用于探索基因的生物学功能以及各种疾病的治疗。

2.1设计sirna

根据hoxa-as2的rna完整序列(如seqidno.1所示)，利用sirna的设计网站(http://sidirect2.rnai.jp/)设计sirna序列并筛选，委托上海生物生工公司合成，该sirna的有义链和反义链的具体序列分别如seqidno.4和seqidno.5所示。

2.2利用脐静脉内皮细胞(huvecs)检测上述sirna的干扰效果

将huvecs细胞接种到六孔板上，待细胞密度达到70％左右，利用lipofectamine3000转染试剂分别将对照组sirna(具体序列如seqidno.6和seqidno.7所示)和上述实验组sirna转染到huvecs中。

转染sirna的具体方法步骤如下：分别取150μl的无血清培养基加到两个1.5ml的ep管里，取6μl的lipofectamine3000加入到其中一个ep管中，另外一个ep管中加入6μl浓度为10μm的sirna。将sirna培养基的混合物加入到lipofectamine3000培养基的混合物中，涡旋振荡5秒，使其充分混匀，室温静止10min后逐滴加入到huvecs细胞中。待6小时后更换新鲜的完全培养基，待48小时后，如前所述利用trizol抽提总rna进行逆转录并通过荧光定量pcr进行hoxa-as2的rna表达量检测。

结果如图2所示，实验组细胞中的hoxa-as2的表达量明显低于对照组细胞中的hoxa-as2的表达量(图中**代表p值﹤0.01)，说明所设计的sirna能够特异性靶向hoxa-as2，使其表达量降低，因此该sirna可用于进一步探索hoxa-as2的生物学功能以及动脉粥样硬化的治疗。

三、降低动脉粥样硬化分子标志物的表达量对血管内皮炎症的影响

炎症反应是临床上非常常见的一种病理反应，是指具有血管系统的活体组织对各种损伤因子的刺激所发生的一种以防御反应为主的基本病理过程。炎症往往表现为红、肿、热、痛和功能障碍，也伴有发热、末梢血白细胞计数改变等全身反应。炎症的过度活化与动脉粥样硬化的发生、发展息息相关。

3.1降低表达量对单核细胞和内皮细胞之间粘附的影响

血管内皮炎症被活化后会促使内皮细胞分泌一些相关的粘附因子从而促进单核细胞和内皮细胞之间的粘附作用，所以通过验证细胞之间的粘附作用可以反应内皮细胞的炎症程度，具体步骤如下。

将内皮细胞huvecs接种到6孔板上，过夜，待密度达到80％时，利用lipofectamine3000转染试剂将对照组sirna和实验组sirna分别转染到huvecs中(具体转染步骤如前所述)。转染后6小时换成新鲜培养基，转染48小时后，将单核细胞thp-1用trackergreencmfda进行荧光基团的标记，1小时后给huvecs换成新鲜的培养基，同时用rpmi培养基洗涤thp-1细胞3次。将thp-1细胞分别加入到对照组和实验组的huvecs中，放入培养箱孵育1小时。用培养huvecs细胞的ecm培养基洗涤3次，去掉未粘附到huvecs上的thp-1细胞，在荧光显微镜下对粘附到huvecs上的thp-1细胞进行计数并拍照。

结果如图3所示，从图中可以看出，与对照组相比，降低了hoxa-as2表达量后，thp-1和huvecs细胞之间的粘附作用得到了显著的增强。

3.2降低表达量对内皮细胞中炎症因子表达量的影响

将huvecs细胞接种到六孔板上，待细胞密度达到70％左右，利用lipofectamine3000转染试剂分别将对照组sirna和实验组sirna转染到huvecs中。待48小时后，利用trizol抽提总rna进行逆转录并通过荧光定量pcr对粘附因子vcam1和icam1、细胞因子il6以及趋化因子ccl2等四种炎症因子的mrna表达量进行检测。

结果如图4所示，当hoxa-as2的表达量降低后，粘附因子vcam1和icam1、细胞因子il6以及趋化因子ccl2等炎症因子的表达量均显著升高(图中**代表p值﹤0.01，图中***代表p值﹤0.001)。

四、动脉粥样硬化分子标志物过表达对血管内皮炎症的影响

4.1构建动脉粥样硬化分子标志物的慢病毒表达载体

根据上述hoxa-as2的rna序列，合成双链的dna序列，并且在起始两端分别带上bamhi和xbai两个酶切位点。通过bamhi和xbai这两个位点的双酶切，将合成的hoxa-as2通过dnat4连接酶连接到plvcs2.0的慢病毒空载体上(慢病毒空载体序列如seqidno.8所示)。

酶切反应体系为：

加水补齐至20μl后，放置在37℃孵育4小时。

t4dna连接酶反应体系为：

10×缓冲液1μl

hoxa-as2片段∶plv载体(摩尔数)(1～5):1

t4连接酶1μl

加水补齐至10μl后，置于16℃孵育过夜。

对plvcs2.0空载体和hoxa-as2的过表达载体分别进行慢病毒包装，具体步骤如下：将hek293t细胞接种到6孔板中，待细胞密度达到70％，利用lipofectamine3000分别将hoxa-as2过表达质粒和空载体对照与商品化的慢病毒包装质粒pspax2和pmd2g转染到hek293t细胞中，质粒具体配比为：

pspax20.5μg

pmd2g0.5μg

hoxa-as2过表达质粒或空载体1μg

待转染48小时后，收集病毒上清，可直接用于感染细胞或冻存于负80度超低温冰箱，以备使用。

4.2检测过表达对单核细胞和内皮细胞之间粘附的影响。

将脐静脉内皮细胞huvecs接种到六孔板中，待细胞密度达到80％，弃掉原培养基，分别取上述空载体(vec)和hoxa-as2过表达病毒(hoxa-as2-flag)上清1ml，加到huvecs中，并添加1ml的新鲜培养基，最后加入2μl浓度为4μg/μl的聚凝胺(polybrene)。待8小时后，给细胞换成新鲜的培养基。待感染48小时后，将huvecs细胞用炎症反应的诱导剂tnfα处理1小时，同时将单核细胞thp-1用trackergreencmfda进行荧光基团的标记，置于37℃孵育1小时。用ecm培养基洗涤huvecs3次并换成新鲜的ecm培养基，同时用rpmi培养基洗涤thp-1细胞3次。将标记了trackergreen的thp-1细胞分别加入到感染了空载体和hoxa-as2过表达慢病毒的huvecs中，放入培养箱孵育1小时。用培养huvecs细胞的ecm培养基洗涤3次，去掉未粘附到huvecs上的thp-1细胞，在荧光显微镜下对粘附到huvecs上的thp-1细胞进行计数并拍照。

如图5a所示，与感染空载体的对照组相比，实验组细胞中hoxa-as2的表达量显著增加(图中***代表p值﹤0.001)。更重要的是，如图5b所示，hoxa-as2的表达量增加后显著抑制了单核细胞thp-1和内皮细胞huvecs之间的粘附作用。

4.3检测过表达对血管内皮细胞中炎症因子的影响

将huvecs接种到6孔板上，待细胞密度达到80％，分别用包装好的空载体和hoxa-as2过表达慢病毒感染huvecs。感染huvecs48小时后，用炎症反应的诱导剂tnfα处理1小时。用trizol裂解细胞提取总rna，经dna酶消化后，取1μgrna进行逆转录，将逆转录后的cdna进行荧光定量pcr，分别检测感染空载体和hoxa-as2过表达慢病毒后相关炎症因子的表达量。

结果如图6所示，与感染空载体的对照组相比，感染hoxa-as2过表达慢病毒后的实验组细胞中，粘附因子vcam1和icam1、细胞因子il6以及趋化因子ccl2等炎症因子的表达量都显著降低(图中#代表p值﹤0.05，图中##代表p值﹤0.01，图中###代表p值﹤0.001)，再次证明了长链非编码rnahoxa-as2对血管内皮炎症的重要抑制作用。

综上可知，长链非编码rnahoxa-as2(序列如seqidno.1所示)在动脉粥样硬化病人的外周血单核细胞中的表达量明显高于正常人的外周血单核细胞中的表达量(p值＜0.05)，能较好地反映动脉粥样硬化的进展状况，因此可以作为动脉粥样硬化的临床诊断分子标志物，并应用于制备诊断或检测动脉粥样硬化的相关产品，从而丰富了动脉粥样硬化的诊断和检测手段。该动脉粥样硬化分子标志物能够抑制单核细胞thp-1与血管内皮细胞huvecs之间的粘附作用，以及抑制粘附因子、趋化因子以及细胞因子等炎症因子的表达，从而得以有效地抑制血管内皮炎症的过度活化，因此还可以作为抑制动脉粥样硬化的形成及发展的分子药物靶点，为进一步研究动脉粥样硬化的发病机理，探索其防治药物提供新的实验理论基础和方向。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>新乡医学院

<120>动脉粥样硬化分子标志物及其应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1048

<212>rna

<213>homosapiens

<400>1

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acuccaggcgcucagggaaucgccuuuuccgguguccaggcgcucugcagacaaauaaac300

agcagaagcaaauggucaccgagccggcagucagcuuucugggagugggagaugaugggg360

aaagaggaaagaaucguccgcucgccggacccuggcuuggagaaguucugcgcuccgcug420

ggacucugcgggcccuuugcgucuacagaccuaucccugccccgacuaccccuucacuca480

gacccagggaaggacacguuucuaugccuuacagagacuugaagccugaaagccuggcca540

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