利用多个免疫调控点分子的表达量评价胶质瘤临床预后的系统的制作方法

本公开涉及生物医药卫生领域，特别是涉及一种利用多个免疫调控点分子的表达量评价中国人群胶质瘤临床预后的系统。

背景技术：

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，其恶性程度高、侵袭性生长、预后差易复发。尽管胶质瘤治疗手段不断进步，但侵袭性最高的胶质母细胞瘤(gbm)在接受术后放化疗后中位生存期仅为14.6个月。尽管新的胶质瘤免疫治疗策略相继出现，如树突状细胞(dc)治疗和免疫调控点阻滞，但效果仍然不理想，迫切需要深入研究胶质瘤免疫以寻找更有效的治疗方法。同时对于胶质瘤患者，临床亟需有效的胶质瘤诊断及预后评价指标，以达到早期诊断、早期治疗的目的，并选择相应的合理治疗方案，从而提高患者生存期，改善预后。

在胶质瘤中，各种免疫细胞和间质构成肿瘤实质的非肿瘤成分，如t细胞、肿瘤相关巨噬细胞(tams)、nk细胞等。它们之间通过分泌细胞因子或配体-受体相互作用进行信息传递，形成了利于胶质瘤恶性进展的温床。与此同时，胶质瘤中各种细胞之间通过多重方法产生强烈的免疫抑制，压抑有效的抗肿瘤免疫反应。有报道，tams可以通过与胶质瘤干细胞相互作用促进肿瘤进展和免疫抑制。此外，免疫调控点在抑制抗肿瘤免疫方面发挥重要作用，ctla-4、pd-1/pd-l1是肿瘤逃避t细胞和b细胞介导抗肿瘤免疫的关键共抑制分子。但针对ctla-4、pd-1的胶质瘤免疫调控点阻断治疗仅在一部分胶质瘤病人中起作用，并且常伴有免疫炎症相关的副作用。

信号传导淋巴细胞活化分子家族2(slamf2，cd48)是在大多数造血细胞上表达的粘附共刺激分子，尤其是在抗原呈递细胞(apc)中高表达。通过与其受体cd2结合，cd48参与多种固有免疫反应和适应性免疫反应，包括参与调节粒细胞活性和炎症反应、t细胞活化及自身免疫反应，参与调节ctl或nk细胞功能。cd48在自身免疫性疾病和过敏性疾病中表达量增加，并且抗cd48单克隆抗体可以有效治疗自身免疫性脑脊髓炎。有研究发现在肝癌中cd48与其高亲和力受体2b4(cd244)相互作用，可以导致出现单核/巨噬细胞诱导的nk细胞功能障碍。以上表明cd48在免疫激活或是免疫抑制中发挥了重要作用。然而，却少有报道研究cd48在胶质瘤中的预后评价及免疫调节作用。并且，中国人群仍缺乏适合本种族的胶质瘤临床预后评价方法。

技术实现要素：

本公开的目的是提供与中国人群胶质瘤预后密切相关的新的免疫调控点分子模型，从而丰富胶质瘤预后的评价方法，提高胶质瘤预后评价的准确性。

为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种通过多个免疫调控点分子的表达量评价中国人群胶质瘤临床预后的系统，其特征在于，该系统包括计算装置、用于输入胶质瘤患者个体的多个免疫调控点分子的表达量的输入装置和用于输出胶质瘤预后的输出装置；其中，所述多个免疫调控点分子包括cd48、slamf8和pd-l1；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如式(1)所示的判别函数的算法；

f＝0.2029a+0.2942b+0.4562c式(1)

式(1)中，f表示胶质瘤预后，f返回值为≥0.4710时表示胶质瘤预后不佳，a、b和c依次分别表示pd-l1、cd48和slamf8的表达量。

可选地，该系统还包括多个免疫调控点分子的表达量的检测装置。

可选地，所述多个免疫调控点分子的表达量的检测装置包括免疫调控点分子表达量检测芯片和芯片信号读取器，免疫调控点分子表达量检测芯片包括分别检测cd48、slamf8和pd-l1的表达量的探针。

可选地，所述多个免疫调控点分子的表达量的检测装置包括实时定量pcr仪和分子的实时定量pcr引物，分子的实时定量pcr引物包括分别检测cd48、slamf8和pd-l1的表达量的实时定量pcr引物。

本公开第二方面：提供本公开第一方面所述的系统在制备用于评价中国人群胶质瘤预后的医疗仪器中的用途。

本公开第三方面：提供一种评价中国人群胶质瘤预后的免疫调控点分子，该免疫调控点分子包括cd48。

可选地，所述免疫调控点分子还包括slamf8和pd-l1。

本公开第四方面：提供免疫调控点分子在制备评价中国人群胶质瘤预后的试剂盒中的用途，其中，所述免疫调控点分子包括cd48。

可选地，所述免疫调控点分子还包括slamf8和pd-l1。

本公开第五方面：提供检测免疫调控点分子的表达量的试剂在制备评价中国人群胶质瘤预后的试剂盒中的用途，其中，所述免疫调控点分子为包括cd48、slamf8和pd-l1。

胶质瘤是一种伴随多种免疫细胞浸润难治性疾病。虽然免疫调控点阻断的免疫疗法给肿瘤患者带来了希望，但胶质瘤调控点阻断治疗效果仍然不理想。本申请的发明人通过分析患者的rna测序数据，筛选出了高可信度的疾病诊疗免疫调控点分子，并通过计算公式建立了胶质瘤预后的判断和预测模型，并对其性能进行评估。评估结果显示，本公开的技术方案为中国人群胶质瘤的诊疗提供了高特异性、高敏感性的免疫调控点分子和预后预测模型，为胶质瘤预后评价及免疫治疗带来了新方法，同时为免疫调控点治疗提供了新的思路。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1示出了cd48在胶质瘤中的表达情况和预后价值，其中，a示出了cgga数据库中cd48在不同等级、组织病理学分类、分子分型和tcga亚型胶质瘤中的表达水平，横坐标分别代表ii级、iii级、iv级、少突胶质细胞瘤、少突-星形细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、低级别胶质瘤伴idh突变及1p19q共缺失、低级别胶质瘤伴idh突变及1p19q非共缺失、低级别胶质瘤伴idh野生型、胶质母细胞瘤伴idh突变、胶质母细胞瘤伴idh野生型、神经元型胶质瘤、前神经元型胶质瘤、经典型胶质瘤、间质型胶质瘤，纵坐标代表cd48的表达量；b示出了cgga数据库中cd48是间质亚型的良好预测分子，横坐标代表灵敏度，纵坐标代表1-特异度；c和d示出了在cgga数据库中cd48表达水平对胶质瘤预后的影响，横坐标代表总体生存期，纵坐标代表总生存率，low代表cd48低表达，high代表cd48高表达，n代表每组包含病例数量；e和f示出了在tcga数据库中cd48表达水平对胶质瘤预后的影响，横坐标代表总体生存期，纵坐标代表总生存率，low代表cd48低表达，high代表cd48高表达，n代表每组包含病例数量。

图2示出了cd48表达情况及预测临床预后，其中，a示出了tcga数据库中cd48在不同等级、组织病理学分类、分子分型和tcga亚型中的表达水平，横坐标分别代表ii级、iii级、iv级、少突胶质细胞瘤、少突-星形细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、低级别胶质瘤伴idh突变及1p19q共缺失、低级别胶质瘤伴idh突变及1p19q非共缺失、低级别胶质瘤伴idh野生型、胶质母细胞瘤伴idh突变、胶质母细胞瘤伴idh野生型、神经元型胶质瘤、前神经元型胶质瘤、经典型胶质瘤、间质型胶质瘤，纵坐标代表cd48的表达量；b示出了tcga数据库中slamf8特异性的间质亚型中富集高表达，横坐标代表灵敏度，纵坐标代表1-特异度；c-e示出了cd48预测1年、2年和3年存活率，横坐标代表灵敏度，纵坐标代表1-特异度。

图3示出了本公开的系统中用于确定胶质瘤预后的预测模型的预后价值，其中，a示出了预测模型(调控点风险评分)与胶质瘤级别、组织病理学分类、分子分型及tcga亚型的相关性，横坐标分别代表ii级、iii级、iv级、少突胶质细胞瘤、少突-星形细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、低级别胶质瘤伴idh突变及1p19q共缺失、低级别胶质瘤伴idh突变及1p19q非共缺失、低级别胶质瘤伴idh野生型、胶质母细胞瘤伴idh突变、胶质母细胞瘤伴idh野生型、神经元型胶质瘤、前神经元型胶质瘤、经典型胶质瘤、间质型胶质瘤，纵坐标代表f值(riskscore)；b示出了cgga数据库中该预测模型是间质亚型的良好预测分子，横坐标代表灵敏度，纵坐标代表1-特异度；c-e示出了在cgga数据库中高f值意味胶质瘤临床预后不良，f-h示出了在tcga数据库中高f值意味胶质瘤临床预后不良，横坐标代表总体生存期，纵坐标代表总生存率，low代表较低的f值(riskscore)，high代表高f值(riskscore)。

图4示出了本公开的系统中用于确定胶质瘤预后的预测模型在tcga数据库的分布情况，其中，a示出了tcga数据库中胶质瘤恶性表型具有明显较高的f值(调控点风险评分)，横坐标分别代表ii级、iii级、iv级、少突胶质细胞瘤、少突-星形细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、低级别胶质瘤伴idh突变及1p19q共缺失、低级别胶质瘤伴idh突变及1p19q非共缺失、低级别胶质瘤伴idh野生型、胶质母细胞瘤伴idh突变、胶质母细胞瘤伴idh野生型、神经元型胶质瘤、前神经元型胶质瘤、经典型胶质瘤、间质型胶质瘤，纵坐标代表f值(riskscore)；b示出了f值(调控点风险评分)为间质亚型良好的预测因子。

图5示出了本公开的系统中用于评价胶质瘤预后的预测模型在不同亚型的gbm的预后价值，其中，a-d示出了f值(riskscore)在男性和女性gbm中均具有预测价值，e-h示出了f值(riskscore)高低表达在40岁以上患者中具有预后差异，但在40岁以下患者中却不具预后差异，i-p示出了在idh野生型和mgmt启动子甲基化患者中，f值(riskscore)高表达提示预后不良，但在idh突变和mgmt非甲基化状态下高低表达f值(riskscore)患者预后差异不明显，其中，横坐标代表总体生存期，纵坐标代表总生存率，low代表较低的f值(riskscore)，high代表高f值(riskscore)。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开第一方面：提供一种利用多个免疫调控点分子的表达量评价中国人群胶质瘤临床预后的系统，其中，该系统包括计算装置、用于输入胶质瘤患者个体的多个免疫调控点分子的表达量的输入装置和用于输出胶质瘤预后的输出装置；其中，所述多个免疫调控点分子包括cd48、slamf8和pd-l1；所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如式(1)所示的判别函数的算法；

f＝0.2029a+0.2942b+0.4562c式(1)

式(1)中，f表示胶质瘤预后，f返回值为≥0.4710时表示胶质瘤预后不佳，a、b和c依次分别表示pd-l1、cd48和slamf8的表达量。

slamf8为cd48同一家族的免疫共刺激分子。本申请的发明人在研究中发现，slamf8在胶质恶性进展中高表达，且为胶质瘤独立的预后因素，slamf8高表达提示患者预后不良。通过功能分析发现，slamf8涉及参与胶质瘤免疫反应，高表达slamf8胶质瘤呈现出免疫激活状态，但有效的抗肿瘤免疫反应却被抑制，表现出活跃的炎症反应状态。进一步分析发现，cd48、slamf8与大部分经典免疫调控点成较强的正相关，而与pd-l1相关性弱，因而推测结合cd48、slamf8与pd-l1可代表经典免疫调控分子对胶质瘤预后进行评价。基于此，本公开以cgga数据库为基础建立了适合中国人群的胶质瘤临床预后评价系统。

其中，cd48是指ncbi数据库中geneid为962的基因，cd48的表达量可以为cd48的蛋白表达量，优选为细胞膜表面的蛋白表达量。slamf8是指ncbi数据库中geneid为56833的基因，slamf8的表达量可以为slamf8的蛋白表达量，优选为细胞膜表面的蛋白表达量。pd-l1是指ncbi数据库中geneid为29126的基因，pd-l1的表达量可以为pd-l1的蛋白表达量，优选为细胞膜表面的蛋白表达量。

根据本公开，该系统还可以包括多个免疫调控点分子的表达量的检测装置。

进一步地，所述多个免疫调控点分子的表达量的检测装置可以包括免疫调控点分子表达量检测芯片和芯片信号读取器，免疫调控点分子表达量检测芯片包括分别检测cd48、slamf8和pd-l1的表达量的探针。或者所述多个免疫调控点分子的表达量的检测装置包括实时定量pcr仪和分子的实时定量pcr引物，分子的实时定量pcr引物包括分别检测cd48、slamf8和pd-l1的表达量的实时定量pcr引物。

本公开第二方面：提供本公开第一方面所述的系统在制备用于评价中国人群胶质瘤预后的医疗仪器中的用途。

本公开第三方面：提供一种评价中国人群胶质瘤预后的免疫调控点分子，该免疫调控点分子包括cd48。

本申请的发明人在研究中发现，cd48表达水平随着胶质瘤级别的增加而升高，例如，cd48在胶质母细胞瘤、idh野生型胶质瘤及间质亚型胶质瘤等具有恶性表型的胶质瘤中高表达；进一步地，cd48高表达患者的总生存期(os)明显较低表达患者短，并且，cd48对胶质瘤微环境具有一定影响，能够促进免疫压抑及炎症反应。因此，将cd48作为间质型胶质瘤的良好预测分子用于评价胶质瘤的临床预后，能够及时选择合理的临床治疗策略，改善预后。

进一步地，所述免疫调控点分子还可以包括slamf8和pd-l1。

本公开第四方面：提供免疫调控点分子在制备评价中国人群胶质瘤预后的试剂盒中的用途，其中，所述免疫调控点分子包括cd48。

进一步地，所述免疫调控点分子还可以包括slamf8和pd-l1。

本公开第五方面：提供检测免疫调控点分子的表达量的试剂在制备评价中国人群胶质瘤预后的试剂盒中的用途，其中，所述免疫调控点分子为包括cd48、slamf8和pd-l1。

其中，检测免疫调控点分子的表达量的试剂可以为探针和/或引物。

以下，通过实施例进一步详细说明本公开。

实施例

本实施例用于说明本公开的生物标志物的发现和预测模型的建立。

病例来源及样本量：对946例具有详细临床信息的胶质瘤测序数据进行分析，其中310例来自cgga数据库(http://www.cgga.org.cn，为以中国人群胶质瘤样本为基础组建的中国胶质瘤基因组图谱)，636例来自tcga数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgadownload.jsp，为国外人群胶质瘤样本为基础的肿瘤基因组图谱)。将cgga数据库作为发现数据库，tcga数据库作为验证数据库。总体生存期(os)为从诊断确诊至死亡或最终随访结束的时间。

生物信息学分析：胶质瘤间质评分、免疫评分以及胶质瘤纯度使用r语言进行计算用以评价肿瘤中非肿瘤细胞成分比例。r包软件计算微环境细胞亚群用于计算八种免疫细胞及两种间质细胞的绝对富集程度。利用皮尔森相关分析筛选相应基因进行功能分析。david软件用于基因本体功能分析。gsea软件用于分析cd48高表达与低表达组间不同的功能表型。主成分分析和基因集变异分析用于区分cd48表达不同造成的基因组、免疫功能及炎症反应的差异。

统计分析：spss，graphpadprism7和r3.3.3(https:///www.r-project.org)软件用以统计分析。t检验用以评价不同组间的差异表达情况，皮尔森相关系数用于计算相关性。低表达组和高表达组根据中位表达量进行分组。使用kaplan-meier生存分析评价预后结果，log-rank检验评价不同组间的预后差异情况。使用cox单因素和多变量回归分析判断其是否为独立预后因素。受试者工作曲线(roc)使用medcalc软件绘制。其他的统计计算和统计图使用r包(ggplot2，corrplot，pheatmap等)绘制。双尾p值＜0.05定义为具有统计学意义。

对cgga数据库中的rna测序数据进行分析发现，cd48表达水平随着胶质瘤级别的增加而升高，特别是在iv级中高表达。参考组织病理学分型，cd48在胶质母细胞瘤(gbm)中表达最高。在不同的分子亚型中，无论是在较低级别胶质瘤(lgg)还是gbm中，idh野生型胶质瘤中cd48表达量明显较高(图1a)。分析tcga数据库后得到了类似的结果(图2a)，说明cd48表达水平与胶质瘤恶性进展密切相关。

间质亚型是胶质瘤tcga数据库分型中恶性程度最高的亚型。绘制受试者工作特征曲线(roc)，发现cd48在cgga数据库(auc＝85％)(图1b)和tcga数据库(auc＝91.9％)(图2b)中是间质型胶质瘤的良好预测分子。

在cgga数据库中，cd48高表达患者的os明显较低表达患者短，在高级别胶质瘤(hgg)中也是如此(图1c和1d)。而且此结果在tcga数据库中得到了进一步的验证(图1e和1f)。考虑到cd48的影响胶质瘤预后的重要性，我们评估了cd48在cgga中的预后预测价值，结果显示cd48是评价胶质瘤1年、2年和3年生存率的准确预测因子(auc＝77.7％，分别为79.2％和81.3％)(图2c-e)。

结合临床因素进行单因素和多因素回归分析，可以发现在cgga数据库中cd48是胶质瘤的一个独立预后因素(hr＝1.202，p＝0.006)(见表1)。在tcga数据库中cd48同样可以独立预测胶质瘤的不利预后(hr＝1.144，p＝0.006)(见表2)。这些表明cd48在决定胶质瘤预后中发挥重要作用。

表1

表2

cd48和slamf8与经典免疫调控点都具有较强的相关性，但与pd-l1的相关性却很小。因此，利用cd48、slamf8和pd-l1建立胶质瘤预后的判断和预测模型，该模型如式(1)所示。

f＝0.2029a+0.2942b+0.4562c式(1)

式(1)中，a、b和c依次分别表示pd-l1、cd48和slamf8的表达量。

经检测并计算发现，在恶性进展的胶质瘤亚型中f值明显较高(cgga数据库中约为2～10，tcga数据库中约为5～10)，如gbm，idh-野生型的lgg及gbm，间质亚型(cgga数据库见图3a，tcga数据库见图4a)。而且该模型对间质型胶质瘤具有准确的预测价值，曲线下面积auc在cgga数据库中为94.2％，在tcga数据库中为94.8％(cgga数据库见图3b，tcga数据库见图4b)。

在cgga数据库的胶质瘤中，较高的f值意味更短的总生存期，较高f值在较低级别胶质瘤(lgg)和gbm中提示预后不良(图3c-e)。相同的结果在tcga数据库中得到验证(图3f-h)。在单因素和多因素回归分析后可以发现上述模型是胶质瘤独立的预后因素(cgga数据库见表3，tcga数据库见表4)。

表3

表4

经上述cgga及tcga数据库分析，可以证明cd48、slamf8与pd-l1构成的免疫调控点模型的f值是胶质瘤的独立预后影响因素，可进行胶质瘤预后预测。由gbm中位生存期为14.6个月，可以界定胶质瘤患者总生存期小于14.6个月为预后不良，并进一步在中国胶质瘤数据库cgga中利用roc曲线确定当f值为0.4710是为临床预后不良的最佳分界点，即，在中国人群胶质瘤患者中，当f返回值≥0.4710时，表示胶质瘤临床预后不良。

gbm是恶性程度高预后差的胶质瘤，而免疫调控点研究与免疫调控点阻滞治疗已成为gbm的治疗热点。上述模型在女性组和男性组中都具有预测价值(图5a-d)。在40岁以上患者中，高f值的患者预后明显不同(图5e-h)，即上述模型评价预后受年龄因素影响。

在idh野生型gbm中，f值高患者预后明显较f值低者差，但在idh突变的gbm中两组间却没有观察到预后差异(图5i-l)。在mgmt启动子甲基化的gbm患者中，高f值提示预后不良，但mgmt启动子未甲基化的gbm中却未有如此发现(图5m-p)。提示针对不同分子亚型进行预后评价将提高上述模型评价的准确性。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。