一种AHNAK2基因在作为结直肠癌干细胞标记物中的应用及试剂盒的制作方法

本发明属于医疗技术领域，具体涉及一种ahnak2基因在作为结直肠癌干细胞标记物中的应用及试剂盒。

背景技术：

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发病人约八百万，占所有恶性肿瘤的10％～15％，其发病率和死亡率居恶性肿瘤的第三位。

结直肠癌目前，主要采用外科手术和放射的综合治疗，含有5-fu的联合化疗，以及与传统放化疗结合的免疫治疗等。但是总体治疗效果差，复发转移率高且肿瘤治疗副作用大、精准性差。其中结直肠癌的发生与饮食、环境、遗传等密切相关，是多因素协同作用的结果。结直肠癌的防治研究引起人们的高度重视，生物标志物的发现与检测，对预测结肠癌的发生、发展、治疗效果及顸后判断有一定的临床指导意义。

结直肠癌干细胞(colorectalcancerstemcells,crcscs)是癌组织中一小部分增殖缓慢、具有自我更新和多向分化能力的干细胞样肿瘤细胞；是肠癌发生、转移复发和治疗抵抗等恶性生物学行为的根源。探明crcscs的特异性突变基因，将其作为进一步的准确的分子标志物，有利于更好的识别和控制肠癌干细胞，有利于精准治疗，从而可以制定合理的治疗方案，采取有针对性的干预措施，提高生存率等方面都至关重要。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种ahnak2基因在作为结直肠癌干细胞标记物中的应用，用于辅助诊断结直肠癌。

本发明的技术方案为：一种ahnak2基因在作为结直肠癌干细胞标记物中的应用。

本发明发现在结直肠癌患者的癌细胞表面蛋白ahnak2基因两个突变位点(chr14:105410531a>g和chr14：105410533a>t)中至少一个的突变，而在普通肿瘤细胞中未发现ahank2基因在相同位点处突变。而且本发明发现ahnak2基因的这两个突变位点位于第7个外显子区域，对应氨基酸为v3752d和s3753p，属于第4个tamb和第5个tamb连接的中间区域。

由上述可知，本发明可以将上述ahnak2基因可以应用于作为结直肠癌干细胞标记物，可以应用于辅助诊断结直肠癌。

本发明还提供了一种用于检测结直肠癌干细胞标记物的探针，所述探针为seqidno.1或seqidno.2。

本发明中的探针用于检测ahnak2(chr14:105410531和chr14:105410533)的位点。本发明可以选取ahnak2基因“chr14:105404389-105421146”和“chr14:105404367-105421167”的序列通过设计网站设计得到探针，例如本发明可以于agilent在线panel设计网站(https://earray.chem.agilent.com/suredesign/index.htm？sessiontimeout＝true)设计探针。ahnak2基因“chr14:105404389-105421146”和“chr14:105404367-105421167”的序列设计得到的探针均可用于检测chr14:105410531和chr14:105410533的位点。

本发明还提供了一种用于检测结直肠癌干细胞标记物的基因芯片，包括上述的探针。

本发明还提供了上述的探针在制备用于检测结直肠癌干细胞的试剂盒中的应用。

本发明还提供了上述的基因芯片在制备用于检测结直肠癌干细胞的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种用于检测结直肠癌干细胞的试剂盒，包括上述的探针。

本发明还提供了一种用于检测结直肠癌干细胞的试剂盒，包括上述的基因芯片。

本发明还提供了ahnak2蛋白在作为结直肠癌干细胞标记物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明中肠癌干细胞特异性突变基因ahnak2在chr14:105410531和chr14：105410533的异常与肠癌的发生密切相关，因此两个突变位点可以应用于结直肠癌干细胞标记物，用于辅助诊断结直肠癌，对于及直肠癌的诊断具有非常重要的意义，而且本发明中尤其chr14：105410533a>t突变对应的s3753p位点所在的新生抗原亲和力高，hla-i覆盖度高，且ahnak2在细胞表面表达。

附图说明

图1为本发明中ahnak2基因在结直肠癌干细胞中特有的两个突变位点(chr14:105410531a>g和chr14：105410533a>t)。

图2为本发明中ahnak2(chr14：105410533a>t)突变位点所对应氨基酸s3753p位点的hla-i覆盖度及预测的新生抗原序列。

具体实施方式

实施例1

1例结直肠癌干细胞全外显子组测序数据结合20例结直肠癌干细胞靶标测序数据分析发现ahnak2基因两个癌干细胞特异性的体细胞突变。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：本发明实施例中未作特殊说明的操作方法均按照仪器说明书进行操作。

1.样本和数据来源

结直肠癌样本均来自于杭州市肿瘤医院，按照伦理审查委员会规定的制度，每个病人在取样前均签署了知情同意书。病人均没有采取放疗或者化疗，手术是第一个治疗方案。

1例单细胞测序样本和数据来源：

a.样本获取：在病人知情同意的情况下，首先获取1个肠癌病人手术切除的部分癌组织并采集其外周血作正常对照。经病理切片确定组织类型无误后，利用iv型胶原酶将肠癌组织消化成单细胞悬液；分离外周血中的白膜层细胞并去除红细胞后同样制备成单细胞悬液。直接利用显微操作系统获取白膜层单细胞悬液中的单细胞并-80℃冻存。肠癌组织的单细胞悬液则利用bdairaiii流式平台进行分选。分别获取三组crcscs细胞群(epcam+cd133+cd44-,epcam+cd133-cd44+以及epcam+cd133+cd44+)以及一组普通肿瘤细胞群(epcam+cd133-cd44-)。然后再利用显微操作系统挑取各组单细胞并-80℃冻存。

b.单细胞基因组扩增：获取的单细胞样本利用mda技术进行单细胞基因组扩增。

c.单细胞外显子组捕获：利用agilent外显子组捕获芯片获取扩增后的单细胞外显子组。

d.二代测序：利用illumina的hiseq高通量测序仪进行测序，测序方案为pe150，200x。获得原始文件为faseq格式的文件。

e.生信分析：通过生信分析获取单细胞层面的突变特征、体细胞突变、肠癌干细胞特异性突变位点及突变基因，驱动基因、克隆进化等。

20例靶标测序样本和数据来源：

a.样本获取：在病人知情同意的情况下，获取20个肠癌病人手术切除的部分癌组织以及癌旁同时切除的部分正常组织(作对照)。经病理切片确定组织类型无误后，正常组织直接-80℃冻存备用。肠癌组织的消化及流式分选与上述“1中的a”的方法相同。最终共获取96个样本，然后-80℃冻存。

b.微量细胞基因组扩增：通过流式细胞术获取的微量细胞群(因为干细胞含量少)利用mda技术进行基因组扩增。

c.靶标基因外显子捕获：利用agilent在线panel设计网站(https://earray.chem.agilent.com/suredesign/index.htm？sessiontimeout＝true)设计单细胞测序所得的体细胞突变基因(258个基因)的panel探针；在agilent公司合成相应panel基因的外显子芯片，利用此芯片获取扩增后基因组中的靶标基因外显子。其中，针对ahnak2基因探针的序列为seqidno.1或seqidno.2(“chr14:105404389-105421146”和“chr14:105404367-105421167”的序列)，seqidno.1或seqidno.2的探针均可用于检测chr14:105410531和chr14:105410533的两个位点。

d.二代测序：利用illumina的hiseq高通量测序仪进行测序，测序方案为pe150，1000x。同样获取原始文件为faseq格式的文件。

e.生信分析：通过生信分析重点获取肠癌干细胞特异性突变位点及突变基因，并与单细胞层面所得的突变位点及突变基因比较，最终获取单细胞测序以及靶标测序共有的肠癌干细胞特异性突变位点：ahnak2(chr14:105410531a>g和chr14：105410533a>t)。

2.实验材料

collagenaseiv(sigma)

cd133/1(ac133)-pe(130-080-801)(miltenyi)

bdpharmingenapcmouseanti-humancd44(559942)(bdbiotech.)

bdpharmingenbv421mouseanti-humancd326(557196)(bdbiotech.)

7-aad(559925)(bdbiotech.)

bdfacsariaiiisorter

qiaampdnaminikit(qiagen)

nanodrop2000(thermo)

qubit3.0(lifetechnologies)

repli-gsinglecellkit(qiagen)

repli-gultrafastminikit(qiagen)

bioanalyser(agilenttechnologies)

96rxnexomeresearchpanelv1.0(idt)

kapahyperprepkits(96rxn)(kapabiosystem)

covarise-210(covaris)

abi7300realtimepcrsystem

illuminahiseqsbskit300cycles(illumina)

hiseq4000(illuminia)

3.实验方法

(1)流式分选结直肠癌干细胞

获取的部分肠癌组织经病理切片确定组织类型无误后，利用iv型胶原酶将其消化成单细胞悬液；肠癌组织的单细胞悬液利用流式抗体cd133/1(ac133)-pe(130-080-801)(miltenyi)，bdpharmingenapcmouseanti-humancd44(559942)(bdbiotech.)、bdpharmingenbv421mouseanti-humancd326(557196)(bdbiotech.)以及7-aad(559925)(bdbiotech.)的染色。同时有部分细胞分出用于阴性对照，以及同型染色。然后利用bdairaiii流式平台进行分选。分别获取三组crcscs细胞群(epcam+cd133+cd44-,epcam+cd133-cd44+以及epcam+cd133+cd44+)以及一组普通肿瘤细胞(epcam+cd133-cd44-)。然后再利用显微操作系统挑取各组单细胞并-80℃冻存。

(2)单细胞外显子组测序和群体样本靶标基因外显子组测序

单细胞外显子组测序：采用mda法试剂盒(repli-g)singlecellkit扩增肿瘤组织以及癌旁组织(外周血)dna，经质控后，质控合格的基因组采用外显子捕获试剂盒96rxnexomeresearchpanelv1.0完成外显子组序列的富集。采用covarise-210将dna序列碎片化，全外显子约200-300bp，构建dna文库。采用hiseq4000平台，测序长度150，采用双端测序策略。

群体样本靶标基因外显子组测序：采用mda法试剂盒(repli-g)ultrafastminikit扩增肿瘤组织以及癌旁组织(外周血)dna，经质控后，质控合格的基因组采用agilent公司合成单细胞测序所得的体细胞突变基因(258个基因)的外显子芯片，利用此芯片获取扩增后基因组中的靶标基因外显子。采用covarise-210将dna序列碎片化，全外显子约200-300bp，构建dna文库。采用hiseq4000平台，测序长度150，采用双端测序策略。

(a)数据质量评估采用fastqc软件，该软件可以统计测序片段的每个碱基测序质量分布，gc含量分布，以及测序接头残留和建库过程中的duplication等。

(b)序列比对和检测：使用burrows-wheeleraligner(bwa)软件进行序列比对，参考基因组选择ucsc网站上下载的hg19版本。通过比对，将质控得到的fq格式文件转化成bam格式文件，然后用picard和gatk软件将原始的bam文件进行排序，局部重比对和去除重复区域，经过这些处理之后得到最终的bam文件，然后统计这个bam文件的测序深度和覆盖度。使用gatk软件将肿瘤样本和成对的对照样本分析snp和indel。然后用annovar软件将结果进行注释，注释的内容包括千人基因组数据库(1000genomesproject)、dbsnp数据库、exac、sift、ployphen等。

(c)体细胞检测：将所有gatk检测得到的vcf文件合并在一起。过滤掉正常对照样本的突变。过滤掉低质量和低比对率的位点。保留cds区域的位点。snv之间的最小距离设置为5bp如果有多个位点保留质量值最好的位点。

(d)单细胞分类：mutect软件检测体细胞突变。ape软件对组织检测结果和所有单细胞突变结果信息进行聚类。

(e)驱动基因预测和进化树分析：music-smg软件进行驱动基因预测分析。将分析得到的四种检测方法进行过滤(fisher检验、卷积检验、fisher结合p值检验、lrt检验)。

(f)新抗原预测与分析：polysolver软件进行hla分型。然后将分型结果进行比对。netmhcpan如软件将比对后的结果，与转化的氨基酸变化进行预测新抗原是否发生变化，并打分。根据分数高低过滤符合条件的新抗原。

4.实验结论

通过单细胞外显子组测序结合靶标测序技术发现大约28.57％(6/21)的结直肠癌病人的干细胞携带细胞表面蛋白ahnak2基因两个突变位点(chr14:105410531a>g和chr14：105410533a>t)中至少一个的突变，而在普通肿瘤细胞中未发现ahank2在相同位点处无突变(图1)。发现ahnak2的这两个位点位于第7个外显子区域，对应氨基酸为v3752d和s3753p；是属于第4个tamb和第5个tamb连接的中间区域，该两个突变位点为肠癌干细胞中首次发现。对以上两个位点进行新生抗原预测分析，结果发现尤其s3753p位点在以亲和力<500做cutoff时，有比较高的hla-i覆盖度(具体见图2)。

由图2的结果可看出，肠癌干细胞特异性突变基因ahnak2在chr14:105410531和chr14：105410533的异常与肠癌的发生密切相关，且其chr14：105410533a>t突变对应的s3753p位点所在的新生抗原亲和力高，hla-i覆盖度高(图2)，且ahnak2在细胞表面表达。

序列表

<110>吴式琇

<120>一种ahnak2基因在作为结直肠癌标记物中的应用及试剂盒

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>16758

<212>dna

<213>人工合成序列(unkown)

<400>1

agccatacctctcagccttcatttggtcccaggcctgaccctttgctttcatcgtcagct60

tttctgtcctgctcgggcaggattaactctgttcttgccgcggatgtcaccatcactctg120

gagtccagcccagtgcccacaggcccgatcagttcaccctcttccttctcttcaggggag180

aaactttctcgggcatcaaaaaacgtgattgtttcttcttgaagtttttgttcttccagc240

tctgccccatcttcggtgcttttgcttttcttggtaggagatgaggagaaccctaatttg300

ggaaatcggaaccagcctgccttctcctgttttttaggcagttctgcctctggtcgtgcc360

tcaggctgtgtttgaatgggagcagatctctggacgtcatttttggaatcaacacctgtc420

tcatcaacagaagaggaaaacccaatgtttggaagccaaaaccagagcagaccagatttt480

ttactttctggtttgtcttttggagccctgccttcatctgccagtggtgtggttgcctct540

tggctatcatcagggggaaactcaagaatttctgctggctcctcatctgaacagctgtct600

gcaagctggtggccagaaggaacttcaaatgtgagtgtttgctgtcccagtacattgacg660

ctggaagagatcatctcaaatggttctccagtgtcaggctggagatctccagaaatggag720

tctactcctggggtggcttgtatgggagcctcttctgtgccctcctgagtcctagagtgt780

tgagtcattgttgtgtacactctagcctgcgtgtggggctctgggattttcacttttaat840

aaggaaaatccgtacgaaggtgtttgaatctctgacgtggggatctctgattcccgcaca900

atctgagtggaaaaagtcctgggtactgagagatctacaaactctggtgtcactatgctg960

tgtatagtgacctcttgactttcaacctgagcaccctgaatatgcactctgacctttgaa1020

attgggggagcttccaaaggcaggttaaggtccacaggctgctccccagggaccccagca1080

cctgccttcaggatgctggctccccagagccccggactttccttacaaagggctgtatca1140

atattggcctctggacactgcacttccctcacagtggggatgaacacatcatcctctgag1200

ctgggggcagggaaggagaaccttggtaccattaatttggggaatttgacagttaggaca1260

gaatcttcccacagttgatccacattaaccacagaaatctgggatggcatatcagtactt1320

gaagctttcaatttaagtggaccttcaggctgggaagaccatttctctgttttatcctcc1380

atgctggcaaggtcatgtcctggcttggaaagaggagtctcatctatttctcctggaaga1440

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tggaggggatcttcaggtgtgggggctatcccctccccacaaggctggctcactgggaca1980

tccccgagcccacatcctctgctgtcaccttcggtagacagatcatgtttgggaagaggc2040

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gtggcacttgctgttgcaccaagtcctcccctaccaccgtcactgctggccttttctgtg2220

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ggaacagtcacctggtattttgtaagtgtaacatcctcacagggagagagaatagaagat3060

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tctgaagatgataaaggaatcgtggaaagacctatgctagactttgcacctgggactaaa3240

ctatctttaggagttttggtagaagaaaatgaaactttgggcactttaaaatgcagtttc3300

ttaaacttcgaatccattccaacttctccaacagcaagccccaagttaccatcgcgagat3360

ggatcatgaagatcaccttcatgaacaacagattccacaatgggaaatgtggaagtcttc3420

tcatggaatgtaacatttccttcgatttcagaggaagacatggaaactttctttgacgac3480

cattcaaaaccagacgtgctcagttttggtccttgaaacttactgtctttcccagctaca3540

tcctcgtgggccagggacaggtccccctcaagccgcgcaccatccagcatggatcctggg3600

gcctggacatccgtctccacgctgggcagagacacctccacatcgggggccatcacctct3660

gcctttgggcctttcaggtccagcttggggcccttgacgtccacctgggggcccttgagg3720

tccactttgggcatcttgaaactgggcatctccaccttgggcaggtgccctttgaggccg3780

gctacctcgggcatgtggccttctggaagtttcaagtccacctggccagcctggacctcc3840

aggtcggcggaaggggcctgaatgcggaggtcagtggtcttgaggtccccctgcatggag3900

ggaatgctcatgtcggcctccatctttggcgcagacacatccaccgagacctcgatggac3960

ttgcctggggacaacatcccaaaggatggcatcttgaacttgggcattttgaacttgctg4020

tctttggcagtcacgtccttgtcagccagggacaggtccccctccagccgcgtactgtcc4080

agcttggctcctggggcttggatgtccacctccatgctgggcagagacacgtccaggttg4140

ggggacgtcacctccaccttggggcctttcaggtccagcttggggacattaacgtctatc4200

tggggacccttgaggtccactttgggtaccttgaaactgggcatctgcagcttcggcagg4260

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cccttgacatccacctgggggcccttgagggccactttgggcatcttcaaacagggcatc4740

tgcaccttggggaggtgccctttgaggccggctcccttgggcagggggccctccgggagt4800

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tcagacacatccacggacgcctccatggacttgcctggggccgacaccccgaatgatggc4980

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