功能蛋白POX01907及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，功能蛋白pox01907及其编码基因与应用。
背景技术：
：自然界中，植物可通过光合作用大量产生淀粉，淀粉是一种仅次于纤维素的重要碳水化合物。淀粉由葡萄糖残基通过α-1,4-糖苷键或α-1,6-糖苷键聚合成的大分子聚合物，分为支链淀粉和直链淀粉。收获物富含淀粉的作物很多，例如水稻、玉米和木薯等。淀粉工业是重要的农产品加工产业，对扩大就业、改善民生和服务三农等方面发挥了重要作用。淀粉工业中，需要使用大量淀粉酶，主要包括α-淀粉酶(α-amylase,ec3.2.1.1)、糖化酶(glucoamylase,ec3.2.1.3)和α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,ec3.2.1.20)。淀粉酶用途广，需求量大，占全球酶制剂交易市场的25-33％。生淀粉酶(rawstarch-digestingamylase，rsda)能在淀粉糊化温度以下的温度直接水解生淀粉，生淀粉是指直接来源于植物，未经过任何处理的淀粉。生淀粉酶主要包括α-生淀粉酶(rawstarch-digestingα-amylase)、β-生淀粉酶(rawstarch-digestingβ-amylase)和生淀粉糖化酶(rawstarch-digestingglucoamylase，rsdg)，具有巨大的应用前景。其中，rsdg可直接降解生淀粉产生葡萄糖。目前rsdg主要来源于丝状真菌，例如黑曲霉(aspergillusniger)、草酸青霉(penicilliumoxalicum)、根霉(rhizopus)等。但是，天然丝状真菌产生的rsda包括rsdg的量很低，远远不能满足工业需求。基于真菌rsda基因表达调控网络构建遗传工程菌以提高生淀粉酶产量是有效的途径。在丝状真菌中，淀粉酶基因包括rsda基因的表达在转录水平上受到严格的控制。但是，真菌中对rsda基因，尤其是rsdg基因的表达调控机制的报道很少。因此，鉴定丝状真菌中更多新的调控rsda基因表达的转录因子是必要的，具有潜在的应用价值。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何调控微生物产生淀粉酶或生淀粉酶的量。为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种来源于草酸青霉(penicilliumoxalicum)菌株hp7-1的蛋白质，其名称为pox01907，pox01907为如下a1)、a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；a2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；a3)在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质。为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1：标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述a2)中的pox01907蛋白质，为与序列1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。上述a2)中的pox01907蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a2)中的pox01907蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示标签的编码序列得到。其中，序列2所示的dna分子编码序列1所示的pox01907蛋白质。本发明还提供了与pox01907相关的生物材料，所述生物材料为下述b1)至b7)中的任一种：b1)编码pox01907的核酸分子；b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；b5)含有b1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因细胞系；b6)降低权利要求1中所述蛋白质表达量的核酸分子；b7)含有b6)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。上述生物材料中，b1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：b11)编码序列是序列表中序列2的cdna分子或dna分子；b12)序列表中序列2的cdna分子或dna分子；b13)序列表中序列3的dna分子；b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码pox01907的cdna分子或dna分子；b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码pox01907的cdna分子或dna分子；b6)所述核酸分子可为如下b61)或b62)或b63)或b64)：b61)含有序列表中序列4的第1-2179位和/或第4608-6180位的dna分子；b62)序列表中序列4所示的dna分子；b63)与b61)或b62)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的dna分子；b64)在严格条件下与b61)或b62)或b63)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码pox01907蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的pox01907蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码pox01907蛋白质且具有pox01907蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相同性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸编码序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述生物材料中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×ssc,0.1％sds和1×ssc,0.1％sds各洗膜一次；也可为：2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，b2)所述的含有编码pox01907蛋白质的核酸分子的表达盒(pox01907基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达pox01907蛋白质的dna，该dna不但可包括启动pox01907基因转录的启动子，还可包括终止pox01907基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。可用现有的表达载体构建含有所述pox01907基因表达盒的重组载体。上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。上述生物材料中，所述微生物可为真菌、酵母、细菌或藻。所述真菌可为丝状真菌。所述丝状真菌可为青霉。所述青霉可为草酸青霉(penicilliumoxalicum)。所述草酸青霉具体可为草酸青霉菌株hp7-1或敲除草酸青霉菌株hp7-1中ku70基因得到的重组菌株δpoxku70。上述生物材料中，所述转基因细胞系不包括繁殖材料。本发明还提供了pox01907蛋白质或所述生物材料的应用，所述应用为如下(b1)-(b6)中的至少一种：(b1)调控微生物淀粉酶产量；(b2)调控微生物生淀粉酶产量；(b3)调控微生物淀粉酶相关基因的表达量；(b4)调控微生物α-淀粉酶基因的表达量；(b5)调控微生物糖化酶基因的表达量；(b6)调控微生物生淀粉糖化酶基因的表达量。上述应用中，所述调控可为正向调控。所述淀粉酶相关基因具体可为pox01356基因,pox02412基因和/或pox09352基因。所述α-淀粉酶基因具体可为pox09352基因。所述糖化酶基因具体可为pox01356基因和/或pox02412基因。所述生淀粉糖化酶基因具体可为pox01356基因。上述应用中，所述微生物可为真菌、酵母、细菌或藻。所述真菌可为丝状真菌。所述丝状真菌可为青霉。所述青霉可为草酸青霉(penicilliumoxalicum)。所述草酸青霉具体可为草酸青霉菌株hp7-1或敲除草酸青霉菌株hp7-1中ku70基因得到的重组菌株δpoxku70。本发明还提供了一种抑制微生物生产淀粉酶能力的方法，所述方法包括：抑制出发微生物中pox01907蛋白质的编码基因的表达，或降低所述出发微生物中pox01907蛋白质的含量，或抑制所述出发微生物中pox01907蛋白质的活性，得到目的微生物，与所述出发微生物相比，所述目的微生物的生产淀粉酶的能力下降。本发明还提供了一种制备重组微生物的方法，所述方法包括：抑制出发微生物中pox01907蛋白质的编码基因的表达，或降低所述出发微生物中pox01907蛋白质的含量，或抑制所述出发微生物中pox01907蛋白质的活性，得到重组微生物。上文中，所述淀粉酶可为生淀粉酶。所述淀粉酶具体可为分泌到细胞外的淀粉酶。所述抑制出发微生物中pox01907的编码基因的表达可通过向所述出发微生物中导入降低pox01907蛋白质表达量的核酸分子实现。所述微生物可为真菌、酵母、细菌或藻。所述真菌可为丝状真菌。所述丝状真菌可为青霉。所述青霉可为草酸青霉(penicilliumoxalicum)。所述草酸青霉具体可为草酸青霉菌株hp7-1或敲除草酸青霉菌株hp7-1中ku70基因得到的重组菌株δpoxku70。所述编码基因可为上文b1)所述核酸分子。降低pox01907蛋白质表达量的核酸分子可为上文b6)所述核酸分子。采用所述制备重组微生物的方法制备得到的重组微生物，也属于本发明的保护范围。在本发明的一个实施例中，所述重组微生物为敲除δpoxku70中pox01907蛋白质的编码基因得到的突变株δpox01907。突变株δpox01907具有如下特点：(1)在可溶性淀粉诱导培养条件下，和背景菌株δpoxku70相比，突变株δpox01907前期生长稍慢，后期变快。(2)在可溶性淀粉诱导培养条件下，和背景菌株δpoxku70相比，突变株δpox01907的生淀粉酶活力显著降低。(3)在可溶性淀粉诱导培养条件下，和背景菌株δpoxku70相比，突变株δpox01907中关键淀粉酶基因的转录水平显著下降或升高。(4)在可溶性淀粉诱导培养条件下，和背景菌株δpoxku70相比，突变株δpox01907中关键生淀粉酶基因的转录水平显著下降或升高。本发明提供了一种草酸青霉的功能蛋白pox01907，通过实验证明pox01907在调控淀粉酶基因和/或生淀粉酶基因的表达调控中起关键作用，敲除pox01907基因后，微生物细胞的淀粉酶或生淀粉酶产量显著下降，所得到的微生物可以作为模型用于筛选提高淀粉酶产量的物质，在提高生淀粉酶产量中具有应用潜力。附图说明图1为构建草酸青霉pox01907基因敲除盒的pcr产物电泳图。m为1kbdna分子量标准。图2为草酸青霉pox01907基因敲除盒的元件示意图。图3为草酸青霉突变株δpox01907的pcr验证电泳图。图4为草酸青霉突变株δpox01907的southern杂交图。图5为草酸青霉δpoxku70和δpox01907-7在葡萄糖液体培养基中的生物量。图6为草酸青霉δpoxku70和突变株δpox01907-7在可溶性淀粉液体培养基中的生物量。图7为草酸青霉δpoxku70和突变株δpox01907-7、δpox01907-9和δpox01907-15的生淀粉酶产量检测结果。图8为草酸青霉突变株δpox01907-7和菌株δpoxku70在淀粉诱导条件下淀粉酶基因pox01356、pox02412和pox09352的rt-qpcr检测比较结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna的3′末端核苷酸。下述实施例中的草酸青霉(penicilliumoxalicum)菌株hp7-1为文献(zhaos,yanys,heqp,etal.comparativegenomic,transcriptomicandsecretomicprofilingofpenicilliumoxalicumhp7-1anditscellulaseandxylanasehyper-producingmutanteu2106,andidentificationoftwonovelregulatorygenesofcellulaseandxylanasegeneexpression[j].biotechnologyforbiofuels,2016,9(1):203)中的“penicilliumoxalicumstrainhp7-1”，草酸青霉菌株hp7-1在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为：cgmcc10781，公众也可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。质粒pcpxg418：参考文献：chenm,jiangm,shangj,etal.cyp1,ahypovirus-regulatedcyclophilin,isrequiredforvirulenceinthechestnutblightfungus[j].molecularplantpathology2011,12(3):239–246.；质粒pcpxg418在文献中的名称为“transformationvectorpcpxg418”，公众可以从广西大学获得。dna纯化试剂盒：天根生化科技有限公司，货号：dp214。总rna提取试剂盒(离心柱型)：天根生化科技有限公司，货号：dp419。溶菌酶：索莱宝公司，货号：l8120。蜗牛酶：索莱宝公司，货号：s8280。裂解酶：sigma公司，货号：l1412-5g。高保真酶：诺唯赞公司，货号：p515-aa。验证酶：genstar公司，货号：a012-101。潮霉素：amresco公司，货号：1796c205。定量酶：takara公司，货号：rr820。pda培养基：(bd公司，货号：5056836)：称取7.8gpda溶解于200ml蒸馏水中，摇匀，121℃，高压蒸汽灭菌25min。0.1％吐温80溶液：量取1ml吐温80混匀于1l去离子水中，121℃，高压蒸汽灭菌25min。用于提取真菌总dna的葡萄糖培养基(g/l)：yeastextract0.5g，tryptone3g，glucose10g，(nh4)2so42g，k2hpo44g，cacl2·2h2o0.3g，mgso4·7h2o0.3g，ph5.0，115℃，低压蒸汽灭菌20min。基本培养基：kh2po44g、(nh4)2so44g、mgso4·7h2o0.6g、cacl20.6g、微量元素溶液0.1ml，tween80加2ml，蒸馏水定容至1l，ph5.5；115℃，低压蒸汽灭菌20min。葡萄糖液体培养基：在基本培养基中加入葡萄糖，葡萄糖在葡萄糖液体培养基中的浓度为10g/l。可溶性淀粉液体培养基：在基本培养基中加入玉米可溶性淀粉，玉米可溶性淀粉在可溶性淀粉液体培养基中的浓度为10g/l。cm培养基(g/l)：tryptone2g、yeastextract1g、glucose10g、酶水解酪蛋白1g、20×硝酸盐50ml、微量元素溶液1ml，ph6.5，115℃，低压蒸汽灭菌20min。微量元素溶液(g/l)：feso4·7h2o2.5g、mnso40.8g、znso4·7h2o0.7g、cocl21.0g，去离子水定容至1l。20×硝酸盐(g/l)：nano3120g、kcl10.4g、mgso4·7h2o10.4g、kh2po430.4g，去离子水定容至1l。50×tae缓冲液：242gtris碱,57.1ml冰乙酸,100ml0.5medta(ph8.0)加入去离子水至1l，121℃，高压蒸汽灭菌25min。0.5medta(ph8.0)：称取186.1g二水乙二胺四乙酸二钠(edta-na2·2h2o)，加入到800ml去离子水中，边搅拌边调ph至8.0，定容至1l。0.6mmgso4·7h2o：称取147.88gmgso4·7h2o于1l去离子水中，混匀，高压蒸汽灭菌25min，4℃冰箱待用。1m山梨醇水溶液：称取182.1g山梨醇于1l去离子水中，混匀，高压蒸汽灭菌，4℃冰箱待用。ombuffer：称取295.76gmgso4·7h2o、1.56gnah2po4，溶解于800ml去离子水，然后用1mna2hpo4溶液调节ph至5.8，定容至1l，高压蒸汽灭菌，4℃冰箱待用。trappingbuffer：称取72.872g山梨醇、12.1gtris，溶解于800ml去离子水，用稀hcl溶液调节ph至7.0，定容至1l，高压蒸汽灭菌，4℃冰箱待用。ptc溶液：称取400gpeg3350、12.1gtris、11.1gcacl2，溶解于800ml去离子水，然后用稀hcl溶液调节ph至8.0，定容至1l，高压灭菌后置4℃冰箱待用。stc溶液：称取182.2g山梨醇、12.1gtris、11.1gcacl2，溶解于800ml去离子水，用稀hcl溶液调节ph至8.0，定容至1l，高压蒸汽灭菌，4℃冰箱待用。om酶解液：称取溶菌酶0.2g、溶壁酶0.3g、蜗牛酶0.3g，加入到50ml的ombuffer中溶解(现配现用)。再生培养基(ocm)：酶水解酪蛋白0.05g、酵母提取物0.05g、蔗糖17.1g，琼脂1g，加入50ml蒸馏水，ph自然，121℃，高压蒸汽灭菌25min。ph5.0柠檬酸-na2hpo4缓冲液：将0.1m柠檬酸溶液和0.2mna2hpo4溶液分别按照48.5％和51.5％的比例混匀，微调ph值至5.0。1.0％的生木薯淀粉：1g生木薯淀粉于100ml的ph5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，混匀备用。1.0％的可溶性淀粉：1g可溶性淀粉于100ml的ph5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，混匀备用。dns溶液：200g四水合酒石酸钾钠、0.5g无水亚硫酸钠和3,5-二硝基水杨酸10g，用少于1l去离子水溶解，然后分别加入溶解好的20g氢氧化钠和2g重蒸酚，定容至1l待充分溶解后，过滤避光静置一周后，方可使用。0.4mna2co3：43.4g碳酸钠于1l去离子水溶解。蛋白提取液：pmsf0.871g，edta1.861g，nacl8.5g，na2hpo42.2g，nah2po40.2g，定容至1l，调ph为7.4。实施例1、草酸青霉中功能蛋白pox01907及其编码基因的发现本发明提供了一个来源于草酸青霉(penicilliumoxalicum)菌株hp7-1的蛋白质，其名称为pox01907，由1794个氨基酸残基组成，氨基酸序列为序列表中序列1。将编码pox01907的基因命名为pox01907基因，草酸青霉菌株hp7-1的pox01907基因cdna上的开放阅读框(orf)如序列表的序列2所示。pox01907基因的基因组dna如序列表的序列3所示。一、pox01907基因敲除盒的构建1、提取草酸青霉菌株hp7-1的基因组dna。2、以步骤1得到的基因组dna为模板，采用引物pox01907-l-f和引物pox01907-l-r组成的引物对进行pcr扩增，得到pox01907基因上游的2921bpdna片段(电泳结果见图1的泳道1)，称为pox01907左臂。pox01907-l-f:5’-cgagccgcccagtaaagg-3’；pox01907-l-r：5’-ggtaatccttctttctagaccgggccacccgatga-3’。3、以步骤1得到的基因组dna为模板，采用引物pox01907-r-f和引物pox01907-r-r组成的引物对进行pcr扩增，得到pox01907基因下游的2537bpdna片段(电泳结果见图1的泳道3)，称为pox01907右臂。pox01907-r-f:5’-caatatcatcttctgtcgacgttggacgtgcgacatgag-3’；pox01907-r-r：5’-gcgtctgcgtcattcaca-3’。4、以质粒pcpxg418为模板，采用引物g418-f和g418-r组成的引物对进行pcr扩增，得到抗生素g418抗性基因的编码序列(1888bp)(电泳结果见图1的泳道2)。g418-f：5’-tctagaaagaaggattacc-3’；g418-r：5’-cgacagaagatgatatt-3’。5、将步骤2、步骤3和步骤4得到的三个pcr产物经dna纯化试剂盒纯化，然后按照摩尔比1:1:1混合后，进行融合pcr扩增，得到pcr混合产物。融合pcr反应条件：预变性95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃3min，一共进行30个循环反应；72℃5min。6、以步骤5得到的pcr混合产物为模板，采用引物pox01907-n-f和引物pox01907-n-r组成的引物对进行pcr扩增，得到6180bppcr产物(电泳结果见图1的泳道4)。pox01907-n-f：5’-ccagcaagtttccgattc-3’；pox01907-n-r：5’-ggacgcctcataacctctat-3’。经测序，得到的pcr产物如序列表的序列4所示。将序列表的序列4所示的dna分子命名为pox01907基因敲除盒。序列4中，自5’端第1-2719位核苷酸为pox01907左臂序列，第2720-4607位核苷酸为g418抗性基因序列，第4608-6180位核苷酸为pox01907右臂序列。pox01907基因敲除盒的元件示意图见图2。实际应用中，也可以直接人工合成序列4所示dna分子。二、草酸青霉pox01907基因缺失突变株δpox01907的构建与验证1、以草酸青霉菌株hp7-1为出发菌，敲除其ku70基因，得到草酸青霉突变体δpoxku70。记载草酸青霉突变体δpoxku70，以及敲除ku70基因的具体步骤的文献如下：zhaos,yanys,heqp,etal.comparativegenomic,transcriptomicandsecretomicprofilingofpenicilliumoxalicumhp7-1anditscellulaseandxylanasehyper-producingmutanteu2106,andidentificationoftwonovelregulatorygenesofcellulaseandxylanasegeneexpression[j].biotechnologyforbiofuels,2016,9(1):203.草酸青霉突变体δpoxku70在文献中的名称为“penicilliumoxalicummutantδpoxku70”。草酸青霉突变体δpoxku70在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为：cgmcc3.15650，公众也可从广西大学获得。2、制备草酸青霉突变体δpoxku70的原生质体(1)将步骤1得到的草酸青霉突变体δpoxku70接种于pda培养基平板上，28℃静置培养6天后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/ml)。(2)取步骤(1)中2ml的孢子悬浮液，接种至200mlcm培养基中，28℃、180rpm振荡培养11小时。(3)完成步骤(2)后，4℃、3500rpm离心10min，弃上清，收集菌丝体沉淀，用0.6mmgso4·7h2o水溶液洗涤2次，然后4℃、3500rpm离心15min，弃上清，收集菌丝体沉淀。(4)取步骤(3)得到的菌丝体，用50mlom酶解液重悬，28℃、180rpm振荡反应2小时以进行酶解；用显微镜观察到大部分菌丝形成原生质体后，按每管12.5ml分装到50ml离心管中,加入2倍体积的trappingbuffer溶液，4℃、3500rpm离心30分钟，观察到明显的分层现象。(5)用巴氏吸管小心地吸出步骤(4)中间层的原生质体至新50ml离心管中，加入2倍体积1m山梨醇水溶液漂洗1次，4℃、3500rpm离心15分钟，再使用20mlstc溶液漂洗2次后离心，弃上清，得到原生质体。3、草酸青霉突变株δpox01907的构建及验证(1)将4体积份的stc溶液和1体积份的ptc溶液混合，得到混合液，用混合液重悬步骤2得到的原生质体，得到原生质体溶液(调整浓度为1×107个/ml)。(2)用实施例2得到的pox01907基因敲除盒dna转化δpoxku70原生质体(方法参照文献：churchillacl,ciuffettilm,hansendr,etal.transformationofthefungalpathogencryphonectriaparasiticawithavarietyofheterologousplasmids[j].currentgenetics1990,17:25-31)，具体步骤如下：①将5μgpox01907敲除盒dna和3μl100mm亚精胺溶液混合后加入到100μl步骤(1)制备的原生质体溶液中，混合均匀，冰上反应30分钟；②反应结束后向溶液中加入1mlptc溶液，混合均匀，室温放置25分钟；③向混合液中加入1mlstc溶液混合均匀，将混合液加入到20ml预热的再生培养基中，混合均匀，将上述混合液倒入到无菌培养皿中(按每个培养皿分别倒入2-5ml)，室温放置1h，加入40ml含有g418(800μg/ml)与潮霉素(300μg/ml)的pda培养基，覆盖在再生培养基的表面，完全凝固后28℃倒置培养5天。④将步骤③的转化双层板的孢子用0.1％吐温80溶液冲洗，放入到新离心管中，用无菌水梯度稀释孢子悬浮液，将每个稀释梯度的孢子悬浮液涂在两个含有g418(800μg/ml)与潮霉素(300μg/ml)的pda平板上，28℃培养4天，挑选单菌落，随机选取三个候选突变株(δ7、δ9和δ15)，提取各候选突变株基因组dna，采用引物pox01907-l-f和左交叉验证引物g418-v-r、右交叉验证引物g418-v-f和引物pox01907-r-r、引物pox01907-v-f和引物pox01907-v-r进行pcr验证。左交叉验证引物g418-v-r：5’-gtgaatgctccgtaacacccaat-3’；右交叉验证引物g418-v-f：5’-cgctactgcttacaagtgggctgat-3’。pox01907-v-f：5’-gttcctgccttcggttca-3’(识别序列位于从atg开始第726-743位核苷酸)；pox01907-v-r：5’-tcgcatcactcgggtcaa-3’(识别序列位于从atg开始第2533-2550位核苷酸)。结果如图3所示。图3中，泳道m为1kbdnamarker，泳道1为以突变体δpoxku70作为模板的对照，泳道2为以ddh2o作为模板的阴性对照，泳道3为δ7的鉴定结果，泳道4为δ9的鉴定结果，泳道5为δ15的鉴定结果。图3中a为用引物pox01907-l-f和引物g418-v-r扩增得到的扩增产物；图3中b为用引物g418-v-f和pox01907-r-r扩增得到的扩增产物；图3中c为用引物pox01907-v-f和pox01907-v-r扩增得到的扩增产物。结果表明，δ7、δ9和δ15可以扩增出3035bp的左臂dna片段(图3中a)和2711bp的右臂dna片段(图3中b),而突变体δpoxku70没有g418抗性基因的存在，不能扩增出左臂和右臂基因片段(图3中a、图3中b)。同时，突变体δpoxku70可扩增出1825bp的目的dna片段，δ7、δ9和δ15无扩增产物(图3中c)。上述结果表明菌株δ7、δ9和δ15中pox01907基因已被敲除。⑤提取三个候选突变株(δ7、δ9和δ15)和突变体δpoxku70的基因组dna，将基因组dna采用pstⅰ酶切后进行southern杂交分析，结果如图4所示。图4中，泳道m为1kbdnamarker，泳道1为突变体δpoxku70对照，泳道2为δ7的鉴定结果，泳道3为δ9的鉴定结果，泳道4为δ15的鉴定结果。结果表明，δ7、δ9和δ15均得到大小为2.7kb的杂交带，突变体δpoxku70得到6.9kb的杂交带，与预计结果一致。以上结果表明，将pox01907基因敲除盒导入草酸青霉菌株δpoxku70原生质体得到的三个转化子(δ7、δ9和δ15)均为pox01907基因被敲除的突变菌株，分别命名为δpox01907-7、δpox01907-9和δpox01907-15。将敲除pox01907基因的该3个突变菌株均命名为突变株δpox01907。三、草酸青霉突变株δpox01907在葡萄糖液体培养基中生物量的测定待测菌株为：δpox01907-7和δpoxku70。1、将待测菌株接种于pda培养基平板上，28℃静置培养6天。2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将pda平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/ml)。3、将1ml步骤2得到的孢子悬浮液接种至100ml葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养72小时。分别于培养的第12小时、第24小时、第36小时、第48小时、第60小时、第72小时收集培养体系中的所有菌丝体，50℃烘干至恒重,测定生物量(菌丝体干重)。结果如图5所示。结果表明，δpox01907-7在葡萄糖液体培养基中的生物量与δpoxku70菌株的生物量无显著差异，表明菌株δpoxku70中pox01907基因的敲除不影响草酸青霉菌株在葡萄糖培养基中正常生长。四、草酸青霉突变株δpox01907在可溶性淀粉液体培养基中生物量的测定待测菌株为：δpox01907-7和δpoxku70。1、将待测菌株接种于pda培养基平板上，28℃静置培养6天。2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将pda平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/ml)。3、将1ml步骤2得到的孢子悬浮液接种至100ml可溶性淀粉液体导培养基中，28℃、180rpm振荡培养72小时。分别于培养的第12小时、第24小时、第36小时、第48小时、第60小时、第72小时收集培养体系中的所有菌丝体，50℃烘干至恒重,测定生物量(菌丝体干重)。结果见图6。菌株δpox01907-7在可溶性淀粉培养基中的生物量与菌株δpoxku70的生物量相比表明，前36小时，菌株δpox01907-7的生长比菌株δpoxku70略慢，36小时后，菌株δpox01907-7的生长比菌株δpoxku70稍快，说明菌株δpoxku70中pox01907基因的敲除影响草酸青霉菌在可溶性淀粉培养基中正常生长。五、草酸青霉菌突变株δpox01907生淀粉酶产量的测定待测菌株为：δpoxku70、δpox01907-7、δpox01907-9和δpox01907-15。1、将待测菌株接种于pda培养基平板上，28℃静置培养6天。2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/ml)。3、将1ml步骤2得到的孢子悬浮液接种至100ml葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养24小时，离心收集菌丝体，用无菌水洗涤2-3次。4、取步骤3得到的菌丝体(湿重为1g)，转接到100ml可溶性淀粉液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养4天。分别于培养的第2天、第3天和第4天取样，8000rpm离心10min，收集上清液，即为粗酶液。5、检测步骤4得到的粗酶液的生淀粉酶活力。所用底物为生木薯粉。一个生淀粉酶活力单位(u)的定义:每分钟产生1μmol还原糖所需要的酶量。检测方法参考文献：xuqs,yanys,fengjx.efficienthydrolysisofrawstarchandethanolfermentation:anovelrawstarch-digestingglucoamylasefrompenicilliumoxalicum[j].biotechnologyforbiofuels.2016,9:216.。6.提取步骤4可溶性淀粉液体培养基中菌丝体的胞内蛋白。方法参照以下步骤：①将步骤4得到菌丝体放入预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉末。②将步骤①得到的粉末转移到50ml离心管中，加入15ml蛋白提取液，再加入5g直径为0.25mm以及1g直径为3mm的玻璃珠。③将步骤②的混合液在旋涡振荡器上振荡1min，再放置冰上30s。重复8-10次。④将步骤③得到的混合液在7000rpm，4℃，离心20min，收集上清液，即为菌体胞内蛋白。胞内蛋白浓度检测方法参照文献：zort,selingerz.linearizationofthebradfordproteinassayincreaseitssensitivity:theoreticalandexperimentalstudies[j].analbiochem1996,236:302-308。草酸青霉菌株生淀粉酶产量(u/g胞内蛋白)＝生淀粉酶活力(u)/胞内蛋白(g)。结果如图7所示。与菌株δpoxku70相比，3株突变株(δpox01907-7、δpox01907-9和δpox01907-15)的生淀粉酶产量均显著降低，说明基因pox01907正调控草酸青霉生淀粉酶的产生。六、pox01907基因的缺失对草酸青霉淀粉酶基因转录水平的影响待测菌株为：δpox01907-7和δpoxku70。1、将待测菌株接种于无菌pda培养基上，28℃恒温培养6天。2、用0.1％吐温80溶液将pda平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液并将浓度调整到1×108个/ml。3、将1ml步骤2得到的孢子悬浮液接种至100ml葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm培养24小时，收集菌丝体；将1g菌丝体转接至100ml可溶性淀粉液体培养基，28℃、180rpm培养。分别收集、提取诱导培养第4小时、第12小时、第24小时和第48小时的待测菌株总rna并反转录为cdna，以cdna为模板，进行定量pcr检测，检测3个淀粉酶相关基因(1个α-淀粉酶基因：pox09352基因；2个糖化酶基因：pox01356基因、pox02412基因，其中pox01356为生淀粉糖化酶基因)在转接后第4小时、12小时、24小时、48小时的表达情况，采用actin基因作为内参基因。rt-qpcr检测引物如下所示(5’→3’)：actin-f：ctccatccaggccgttctgactin-r：catgaggtagtcggtcaagtcacpox01356-f：cctcggtgagcccaagttpox01356-r：ccaaagtcaatcaaggcaapox02412-f：tatgtggattccttccgctctapox02412-r：atggattgcctccttggtpox09352-f：ctgacggctgcccaatgpox09352-r：ccaaatcgcagtaaatccc结果如图8所示，其中，相对表达量是指突变株δpox01907-7中淀粉酶相关基因的转录水平减去δpoxku70中同样基因的转录水平。图8表明，在淀粉诱导第4小时，与δpoxku70相比，突变株δpox01907-7中除了pox09352基因外，其他两个糖化酶基因pox01356基因、pox02412基因的转录水平显著升高，其中pox01356基因的转录水平升高幅度最大。在淀粉诱导第12小时，pox09352、pox01356、pox02412三个基因的转录水平都比淀粉诱导第4小时的显著降低，但与δpoxku70相比，pox01356基因的转录水平还是显著上调，上调212.2％。在淀粉诱导第24小时，与δpoxku70相比，pox09352基因下调幅度超过了90％，为96.7％，而pox01356基因下调45.3％，pox02412基因下调71.3％。在淀粉诱导第48小时，三个淀粉酶基因转录水平都非常低，与δpoxku70相比，下调幅度都超过了80％，其中pox01356基因下调91.7％、pox02412基因下调82.7％，pox09352基因下调98.8％。以上结果表明，pox01907在可溶性淀粉液体诱导培养条件下，对草酸青霉3个关键淀粉酶相关基因的表达起关键调控作用。<110>广西大学<120>功能蛋白pox01907及其编码基因与应用<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>1794<212>prt<213>草酸青霉(penicilliumoxalicum)<400>1metaspproleuargvalgluglymetphethraspglnvalprocys151015alavalvalglyglygluthrglylysgluvalvalaspgluglyala202530serpheseralavalglualaaspprovallysleualaglnilegly354045hisalaalavalargleusertrpthralathralaasngluiletyr505560trpilealathrvalhisleuasnalailealaserglysertrpthr65707580alaasnalaasnvalilegluthrgluilegluileglythrgluthr859095gluthrgluthrgluthrvalthrvalthrvalthrvalthralaile100105110gluthrglythrtrpthraspvalileargaspleuleuproasnarg115120125valaspasnargasnserilealaservalseralaserseralaasn130135140alaileproleuprovalprothralaprogluargleuserglupro145150155160gluasnvalaspserserhisarglysserserileileserglypro165170175proalaalagluproproargarggluservalargprogluproala180185190provalargleugluproprolysaspalaalavalservalglngln195200205serproproproseralaproglnvalproalapheglyservalser210215220thrprovalproseralaglyproalalysvalserserproglugly225230235240argproserileaspalathrthrproserasplysaspargpropro245250255phehisproprothrglyprolysalagluargserglnserleuhis260265270servalgluserargserhisglysergluserasnhisargglnasp275280285aspserserargservalargthrservalhisvalproaspargser290295300proprothralaproalaalametvallysargaspservalsergly305310315320asnvalgluhisalaserleuglyargserservalhisalathrser325330335prothrphethrargleuproproproalaproargalaleuserarg340345350aspproserileserproargmetglnthrserasnileprothrgly355360365proargalatyrglnargargproserleuserproargglyglygly370375380lysglymetlysalatrpglyargalathrpheglyargalaproser385390395400alathrglymetglnleulyslysasphisaspaspseraspgluarg405410415proprovalvalglualaileglnglnaspserproleuproalagln420425430argthrthrglngluservalvalalaasngluservalglnserthr435440445proproargserglyservalaspleuproileargvalserpropro450455460proalathrlysproglnthrglnglnhisthrhisthrglualaglu465470475480ileserseralaalaasnasnglnvalproglyglnleugluglyile485490495hisglugluargargglumetasnalaglnalaalaproglnvalglu500505510thrvalglulysthrgluthrthrgluleuaspalaglnglugluglu515520525glugluglugluglugluglugluasnvalvalphethrlysglutyr530535540leuglugluarglysglnlyspheglulysaspmetglnserleuarg545550555560alaglumetprometproproleugluaspprothrilevalserleu565570575leuleulysileglnmetleuglylysvalalahisaspglnarghis580585590glyglnserileglyprovalleuserglugluglulysgluilepro595600605serthralaprovalaspaspgluvalproservalvalproprogly610615620progluasplysileaspserthrservalthrileproprolysthr625630635640prometglnglugluargvalvalaspserleupropheleuhisser645650655glyproprothrproileseraspmetaspthrserleuthrasplys660665670valthrlysglnhisleuasnglupheileargthrgluleuilearg675680685argglnlysgluvalalaglulysasnalaalaleuargaspglutyr690695700metserhistyrlysargtrpargleugluvaltrpgluleuasparg705710715720leulysglulyslysprometthrproglyprovalserproproala725730735proprovalprothrproproalaalavalsergluserargglugly740745750argargtyrlysglyasnsergluleuasppheleuasnalaleulys755760765alasergluileseralaglnglugluleugluargargargthrarg770775780metalathralaargproaspleualaargglualaileileproasp785790795800metleugluproargglnvallysalaglyilephelysaspvalasn805810815asnthrvalaspproseraspalametgluvalpheglypheleupro820825830proproasnaspphethrproglugluhisglnleuphethraspala835840845phemetalatyrprolyslystrpglylysilealagluserleupro850855860glyargasppheargglncysileilehistyrtyrleuthrlysglu865870875880gluilelystyrlysalalysleuasnlysargtrpserargarggly885890895argglylysalaargserserargprolysserasnalaleuileala900905910aspleuglyvalvallysproasppheaspglygluglugluglnpro915920925proprovalthraspthrglyargproargargalaalaalaprothr930935940pheglyaspserasnaspsergluglyalavalalaglyserargarg945950955960glyglnservallysaspglygluleuthrglulysproalavalarg965970975argglyglyargalathrglythrargthrglnargargglyalalys980985990valvalglnglnaspprolysserglnproserthrproglnglyser99510001005asnthrprovalproproalaprolysilegluserglyileasp101010151020alaleuvalgluvalalaleuproproglulysgluleuvalglu102510301035lysgluproleuproseralaserargprolysalaglyarggly104010451050argalalysaspglyiletyrvalphegluserthrgluthrasp105510601065prothrthralathrprolyspro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