植物基因组改造中常用的在核苷酸序列上修饰植物基因组的方法和工具与流程
发明领域
本发明涉及农业领域。更具体而言，本发明提供了在转基因植物的基因组中精确定位的核苷酸序列上导入定向修饰的方法和工具，所述修饰包括插入、缺失或取代，其中核苷酸序列包含在植物转基因中常用的元件或dna片段中，所述元件或dna片段例如常用的可选择的标志物基因。在识别核苷酸序列处使用源自天然存在的大范围核酸酶、并经过重新设计而识别识别位点并对其进行切割的大范围核酸酶，诱导双链断裂，通过其在第一步触发修饰。
背景技术：
在植物基因组中导入定向修饰的需求(包括控制外来dna在植物中整合的位置)已变得日益重要，为了满足这一需求，已开发了若干方法(综述参见kumar和fladung,2001,trendsinplantscience,6，第155-159页)。这些方法大部分依赖于在定向位置初始导入双链dna断裂。
通过切点罕见内切核酸酶(如i-scei)诱导双链dna断裂，激活靶基因座和/或修复(repair)或贡献(donor)dna，表现出增加若干数量级的同源重组频率。(puchta等人，1996,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,93，第5055-5060页；chilton和que,plantphysiol.,2003；d’halluin等人，2008plantbiotechnol.j.6,93-102)。
wo96/14408描述了编码酶i-scei的分离的dna。该dna序列可以被掺入到克隆和表达载体、转化细胞系和转基因动物中。载体可用于基因定位和基因的定点插入。
wo00/46386描述了通过i-scei诱导的双链断裂，在细胞中修饰、修复、削弱和失活基因或其他染色体dna。还公开了在需要的个体中治疗或预防遗传疾病的方法。还公开了嵌合的限制性内切酶。
此外，还描述了允许切点罕见内切核酸酶改变酶的底物或序列特异性的方法，从而允许在目的位置诱导双链断裂，而不依赖于存在任何天然的切点罕见内切核酸酶。简而言之，可以使用在设计识别特定的核苷酸序列的锌指结构域和来自天然的限制性酶(如foki)的非特异性dna切割结构域之间的杂合体，制备嵌合的限制性酶。此类方法描述在例如wo03/080809、wo94/18313或wo95/09233中，和isalan等人，2001,naturebiotechnology19,656-660；liu等人，1997,proc.natl.acad.sci.usa94,5525-5530中。另一种通过选择自变体文库生产定制的大范围核酸酶的方法描述在wo2004/067736中。还可以通过wo2007/047859所述的合理设计，获得具有改变的序列特异性和dna结合亲和力的定制的大范围核酸酶或重新设计的大范围核酸酶。
wo2007/049095描述了在2个分开的亚结构域中具有突变的“ladglidadg”归巢内切核酸酶变体，每个亚结构域分别结合修饰的dna靶半位点的不同部分，使得内切核酸酶变体能够切割包含每个亚结构域结合的核苷酸的嵌合dna靶序列。
wo2007/049156和wo2007/093836描述了具有新的切割特异性的i-crei归巢内切核酸酶变体，及其用途。
wo2007/047859描述了合理设计的大范围核酸酶，其具有改变的序列特异性和dna结合亲和力。
wo2006/105946描述了用于通过同源重组在植物细胞和植物中精确将靶dna序列交换为目的dna序列的方法，从而可以在不遗留痕迹和不依赖于在去除步骤过程中进行体外培养的条件下，之后去除在同源重组阶段过程中使用的可选择的或可筛选的标志物，所述标志物用于临时选择基因取代事件，应用其中描述的方法用于通过小孢子特异性表达的诱导双链断裂的切点罕见内切核酸酶去除选定的dna。
us临时专利申请60/828,042和欧洲专利申请06020370.0和wo2008/037436描述了wo2006/105946的方法和工具的变体，其中通过诱导双链断裂的切点罕见内切核酸酶诱导的选定的dna片段的去除步骤处于种系特异性启动子控制下。方法的其他实施方案依赖于修复dna一端的非同源末端连接和另一端的同源重组。
gao等人，2009,theplantjournal，第1-11页描述了使用重新设计的内切核酸酶在玉米中进行可遗传的靶向诱变。
由于重新设计的大范围核酸酶源自天然存在的内切核酸酶，因此，可利用的潜在识别位点不完全是随机的，而表现出与重新设计的大范围核酸酶所基于的天然存在的内切核酸酶原始识别的核苷酸序列具有一定程度的相似性。如gao等人，2009(见上文)所述，基于结构的、修饰i-crei的dna结合特征的蛋白质设计方法是基于对i-crei-dna共结晶结构的目测的，导致预测出大量改变i-crei在其识别位点的特定位置上的碱基偏爱的氨基酸取代。在实验上评估了单个氨基酸取代，将产生理想的碱基偏爱改变的取代加入到可以被“混合和匹配”而产生识别高度多样化dna位点的i-crei衍生物的突变的数据库中。理论上，使用现有的突变数据库可获得的组合多样性足以在随机dna序列中约每1000bp定向改造过的内切核酸酶。
因此，仍然需要功能上重新设计的大范围核酸酶，所述酶识别之前作为转基因的常用部分而导入到转基因植物中的dna元件或区域内的识别位点，并且足够有效率的在所述区域诱导双链dna断裂，从而触发例如通过同源重组或非同源末端连接在双链断裂位点插入外来dna、缺失或取代所需的事件。鉴别此类成对的识别位点和重新设计的大范围核酸酶，通过在之前导入的转基因位置处诱导的双链dna断裂附近允许dna的插入、缺失或取代，而不必依赖于存在曾经导入过切点罕见内切核酸酶，例如i-scei(不天然存在于植物细胞中)的识别位点，增强了以定向方式修饰植物基因组可利用的工具。
上述问题如下文所述在本发明的不同的具体实施方案和权利要求中得以解决。
发明概述
在本发明的一个实施方案中，提供了向转基因植物细胞的基因组的预定位点导入外来dna分子的方法，包括步骤：
a.在预定位点诱导双链dna断裂；
b.将外来dna分子导入植物细胞中；
c.选择在预定位点导入了外来dna的植物细胞；和
d.任选的再生植物细胞为植物，
特征是预定位点是不同于天然存在的大范围核酸酶识别位点的核苷酸序列，预定位点是通常作为转基因植物的转基因的一部分导入的核苷酸序列，且其中双链dna断裂的诱导是通过导入非天然存在的单链大范围核酸酶或成对非天然存在的大范围核酸酶，所述大范围核酸酶识别或一致识别预定位点并诱导双链断裂。
在另一个实施方案中，本发明提供了向植物细胞的基因组的预定位点中导入外来dna分子的方法，包括步骤：
a.在预定位点诱导双链dna断裂；
b.将外来dna分子导入植物细胞中；
c.选择在预定位点导入了外来dna的植物细胞；和
d.任选的再生植物细胞为植物
特征是所述预定位点包含在来自吸水链霉菌(streptomyceshygroscopicus)的膦丝菌素乙酰转移酶编码区(bar编码区)内，所述膦丝菌素乙酰转移酶可以具有seqidno.：3的核苷酸序列，且双链dna断裂的诱导是通过导入单链大范围核酸酶或成对大范围核酸酶，所述大范围核酸酶识别或一致识别预定位点并诱导双链断裂。预定位点可以包含seqidno.1或seqidno.2的核苷酸序列。
在仍然另一个实施方案中，提供了向植物细胞的基因组的预定位点中导入外来dna分子的方法，包括步骤：
a.在预定位点诱导双链dna断裂；
b.将外来dna分子导入植物细胞中；
c.选择在预定位点导入了外来dna的植物细胞；和
d.任选的再生植物细胞为植物
特征是所述预定位点包括seqidno.1或seqidno.2的核苷酸序列，且双链dna断裂的诱导是通过导入单链大范围核酸酶或成对大范围核酸酶，所述大范围核酸酶识别或一致识别预定位点并诱导双链断裂，例如，大范围核酸酶或成对大范围核酸酶源自i-crei(用seqidno.16表示)且其中亚基之一中存在下列氨基酸：第32位的s；第33位的y；第38位的e；第40位的r；第66位的k；第80位的q；第42位的t；第77位的r；第68位的r；第70位的r；第44位的q；第24位的i；第26位的s；第28位的s和第30位的r或第70位的r；第44位的t；第24位的i；第26位的s；第28位的s；第30位的n；第32位的s；第33位的r；第38位的q；第80位的q；第40位的r；第66位的k；第42位的t；第77位的r和第68位的r(位置对应于i-cre-i氨基酸序列)。此类大范围核酸酶的实例是分别包含seqidno.5和seqidno.6的氨基酸序列，由这样的核酸编码的蛋白质，所述核酸包含seqidno.4的第2004位核苷酸至第2525位核苷酸或至第2522位核苷酸的核苷酸序列，或seqidno.4的第4885位核苷酸至第5405位或第5403位核苷酸的核苷酸序列。根据本发明的单链大范围核酸酶可以是包含seqidno.18的氨基酸序列，由这样的核苷酸序列编码的蛋白质，所述核苷酸序列包含seqidno.17的核苷酸第1267至1605位和第1795至2541位的核苷酸序列，或者所述单链大范围核酸酶是这样的蛋白质，所述蛋白质包含seqidno.18的氨基酸位置1至167和208至362位的氨基酸序列，由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含seqidno.17的核苷酸位置第1267至1605、1795至1956和2071至2541位的核苷酸序列。
在任何实施方案中，外来dna可以包含在修复dna中，修复dna包含至少一个侧翼核苷酸序列，其与seqidno.1或seqidno.2的核苷酸序列的上游或下游序列同源。外来dna可以包含可选择的标志物基因和/或植物可表达的目的基因，例如除草剂耐受性基因、昆虫抗性基因、疾病抗性基因、抗生素胁迫抗性基因、参与油生物合成、碳水化合物生物合成的酶、参与纤维强度或纤维长度的酶、参与次级代谢物生物合成的酶。外来dna同样也可以通过非同源末端连接整合，即，没有与预定的靶位点周围区域具有同源性的侧翼序列(没有任何其他dna)，用于整合。
大范围核酸酶或成对大范围核酸酶可以是由嵌合基因或成对嵌合基因表达的，每个基因包含植物可表达的启动子，所述启动子与编码所述大范围核酸酶或所述成对大范围核酸酶中之一的编码区有效连接，还与参与植物细胞的转录终止和多聚腺苷酸化功能的dna区域有效连接。
本发明还提供了植物细胞和植物和种子或繁殖部分，其中外来dna已被导入到通过本文提供的方法获得的预定位点中。
本发明还提供了生长植物的方法，在所述植物中外来dna已被导入到通过本文提供的方法获得的预定位点中，所述方法包括向所述植物或生长了所述植物的底物应用化学品的步骤。
本发明的仍然另一个实施方案涉及生产包含整合在bar编码区的外来dna的植物的方法，包括将基本由本发明的方法获得的植物细胞组成的植物与另一种植物或其自身杂交的步骤，和任选的收获种子。
本发明还涉及这样的方法，包括向植物或植物的种子应用化学化合物的步骤，在所述植物或植物的种子中通过本文提供的方法获得的预定位点中已经导入了外来dna。
本发明的另一个实施方案涉及如本文所述的大范围核酸酶或成对大范围核酸酶的用途，用于将外来dna导入植物细胞的bar编码区中。
本发明的仍然另一个实施方案涉及定制的大范围核酸酶的用途，用于将外来目的dna导入植物细胞中的预定位点中。
附图简述
图1：识别位点以及与不同的大范围核酸酶单体单元bay39和bay40的氨基酸相互作用的示意图。
图2：bay39/40单体单元2(“40”)的氨基酸序列(注意氨基酸序列包含sv40核定位信号(氨基酸1至10))。
图3：bay39/40单体单元1(“39”)的氨基酸序列(注意氨基酸序列包含sv40核定位信号(氨基酸1至10))。
图4：单链bay39/40大范围核酸酶的氨基酸序列(注意氨基酸序列包含sv40核定位信号(氨基酸1-12)和接头区(氨基酸168至205)).
图5：在源自包含植物可表达的bar基因和植物可表达的bay39/40单体单元基因的转基因植物的膦丝菌素敏感型株系中，bar编码区的识别位点周围的pcr扩增子的核苷酸序列比对。1.对照样品的核苷酸序列；2.膦丝菌素耐受性株系的核苷酸序列；3-9：膦丝菌素敏感型株系的核苷酸序列。
本发明不同实施方案的描述
本发明基于这样的发现，即，可以获得特异性识别和切割核苷酸序列(seqidno.1和seqidno.2–图1)的功能上重新设计的大范围核酸酶，所述核苷酸序列可见于吸水链霉菌的膦丝菌素乙酰转移酶基因的编码区(bar基因)的核苷酸序列中(thompson,c.,movva,r.,tizard,r.,crameri,r.,davies,j.,lauwereys,m.ansbotterman,j.(1987)characterizationoftheherbicide-resistancegenebarfromstreptomyceshygroscopicus.theembojournal6：2519-2523(登录号x05822))，所述核苷酸序列在植物转基因中常用的可选择的标志物基因中存在。
seqidno.3表示bar基因的核苷酸序列。seqidno.1的识别位点的互补体(seqidno.2)对应于seqidno.3的核苷酸第132至153位的核苷酸序列。因此，本文所述的大范围核酸酶能够识别和切割包含这样的植物可表达的基因的转基因植物中的核苷酸序列，所述基因具有植物可表达的启动子，所述启动子与编码吸水链霉菌的膦丝菌素乙酰转移酶基因(bar)的dna区域有效连接，后接在植物中有功能的3’转录终止和多聚腺苷酸化区域，bar编码区包含seqidno.1的核苷酸序列互补体的核苷酸序列，例如seqidno.3。
bar编码区已被掺入到多个已经、正在或将要商业化的转基因植物中，包括包含下列事件的植物：
菊苣(cichoriumintybus)：
●监管文件97-148-01p中所述事件rm3-3、rm3-4、rm3-6
油菜籽油菜(欧洲油菜(brassicanapus))
●监管文件dd95-04(ca)或98-278-01p(us)中所述事件ms1
●监管文件dd96-17(ca)或98-278-01p(us)或wo2001/041558中所述事件ms8
●监管文件dd95-04(ca)或98-278-01p(us)中所述事件rf1
●监管文件dd95-04(ca)或98-278-01p(us)中所述事件rf2
●监管文件dd96-17(ca)或98-278-01p(us)或wo2001/041558中所述事件rf3
●日本解除管制文件中所述事件phy14、phy35、phy36
棉花(陆地棉(gossypiumhirsutum))
●监管文件02-042-01p(us)或wo2003/013224中所述事件llcotton25
●wo2008/122406中所述事件t303-40
●监管文件08-340-01p(us)或wo2008/151780中所述事件ghb119
玉米(玉蜀黍(zeamays))
●监管文件03-181-01p(us)中所述事件tc-6275(＝das-06275-8)
●监管文件94-319-01p(us)中所述事件bt176
●us解除管制档案95-145-01p或wo9506128中所述事件b16(＝dll25)
●us解除管制档案96-291-01p(us)中所述事件dbt418
●事件zma101
●us解除管制档案97-265-01p(us)中所述事件cbh351
●us解除管制文件95-228-01p(us)中所述事件ms3
●us解除管制文件98-349-01p(us)中所述事件ms6
稻(oryzasativa)
●us解除管制档案98-329-01p或wo2001/083818中所述事件llrice62
●us解除管制档案06-234-01p或us专利申请2008289060中所述事件llrice601
大豆(glycinemax)
●监管文件96-068-01p(us)中所述事件w62和w98
因此，含有这些事件的转基因植物含有本文所述的大范围核酸酶的识别序列，是本发明方法的合适对象。此外，植物可表达的bar基因一般被用作可选择的标志物并产生了多种转基因植物，这些转基因植物也是本发明方法的合适对象。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及向转基因植物细胞的(核)基因组的预定或预先选择的位点中导入外来dna分子的方法，包括步骤：
a.在预定位点诱导双链dna断裂；
b.将外来dna分子导入所述植物细胞中；和
c.选择在预定位点导入了外来dna的植物细胞；
其中，预定位点是不同于天然存在的大范围核酸酶识别位点的核苷酸序列，预定位点是通常作为转基因植物的转基因的一部分导入的核苷酸序列，且其中双链dna断裂的诱导是通过导入非天然存在的单链大范围核酸酶或成对的非天然存在的大范围核酸酶单体单元，所述大范围核酸酶识别或一起识别预定位点并诱导双链断裂。
如本文中使用的，“通常作为植物的转基因的一部分导入的核苷酸序列”指这样的dna区域的核苷酸序列，所dna区域之前被用作导入植物中的嵌合基因的元件，从而易于获得所述转基因植物，特别是使转基因植物已经、正在或将要商业化且已经申请注册审批并为公众可获得的。若干总结并提供了关于注册审批申请的信息的数据库是可获得的，包括可以在线咨询的环境风险评估中心(centerofenvironmentalriskassessment)的gm作物数据库(http://www.cera-gmc.org/？action＝gm_crop_database&)，或由aphis授权或未决的非管制状态许可请求(petitionsofnonregulatedstatus)的综述表，可在线获得自http://www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html。
通过作为转基因的一部分导入植物中的dna区域包含启动子区，例如camv35s转录物的35s启动子(odell等人，(1985),nature313：810-812)；fmv35s启动子(richinsr.d.,scholthofh.b.,shepherdr.j.(1987)sequenceofthefigwortmosaicvirus(caulimovirusgroup).nucleicacidsresearch15：8451-8466)；拟南芥rubisco基因小亚基的启动子(krebberse.,seurinckj.,herdiesl.,cashmorea.r.,timkom.p.(1988).fourgenesintwodivergedsubfamiliesencodetheribulose-1,5-bisphosphatecarboxylasesmallsubunitpolypeptidesofarabidopsisthaliana.plantmolecularbiology,11,745-759)；木薯叶脉花叶病毒(casavaveinmosaicvirus)启动子(verdaguer等人，(1996)plantmol.biol.31：1129或verdaguer等人，(1998)plantmol.biol.37：1055)；拟南芥(any.q.,mcdowellj.m.,huangs.,mckinneye.c.,chamblisss.,meagherr.b.(1996)strong,constitutiveexpressionofthearabidopsisact2/act8actinsubclassinvegetativetissues.theplantjournal10：107-121)或稻(mcelroyd.,zhangw.,caoj.,wur.(1990)isolationofanefficientactinpromoterforuseinricetransfomation.theplantcell2：163-171)的actin2启动子；组蛋白h3启动子或组蛋白h4启动子(chaboutém,chaubetn,philippsg,ehlingm和gigotc(1987)genomicorganizationandnucleotidesequencesoftwohistoneh3andtwohistoneh4genesofarabidopsisthaliana.plantmol.biol.8：179-191)；玉米(zeamays)泛素-1基因的启动子(christensen等人，(1992)plantmol.biol.18：675)；5’utr前导序列，如cab22l前导子(harpsterm,townsendj,jonesj,bedbrookj和dunsmuirp.(1988)relativestrengthsofthe35scauliflowermosaicvirus,1′,2′andnopalinesynthasepromotersintransformedtobacco,sugarbeetandoilseedrapecallustissue.molgengenet.212:182-190)；或5’tev(carringtonj和freedd(1990)cap-independentenhancementoftranslationbyaplantpotyvirus5′nontranslatedregion.jvirol64(4)：1590-1597)；胭脂碱合酶基因的3’末端(depickera.,stachels.,dhaesep.,zambryskip.,goodmanh.m.(1982).nopalinesynthase：transcriptmappinganddnasequence.journalofmolecularandappliedgenetics1,561-573)；章鱼碱合酶基因的3’末端(degreveh.,dhaesep.,seurinckj.,lemmersm.,vanmontagum.,schellj.(1982).nucleotidesequenceandtranscriptmapoftheagrobacteriumtumefacienstiplasmid-encodedoctopinesynthasegene.journalofmolecularandappliedgenetics,1,499-511)；camv35s终止子(
在本发明上下文中优选的dna区域是上述bar基因编码区的核苷酸序列。
本文描述的重新设计的大范围核酸酶基于用作支架的天然存在的大范围核酸酶i-crei。i-crei是在chlamydomonasrheinhardti的叶绿体中发现的一种回归内切核酸酶(thompson等人，1992,gene119,247-251)。该内切核酸酶是识别23srrna基因中的假回文22bpdna位点的同二聚体，产生用于导入内含子的双链dna断裂。i-crei是一组携带单个laglidadg基序的内切核酸酶的成员。laglidadg酶含有一份或两份共同基序的拷贝。单基序酶(例如i-crei)作为同二聚体发挥功能，而双基序酶是具有2个分离结构域的单体。因此，当源自i-crei支架而重新设计大范围核酸酶以识别22bp的目的核苷酸序列时，设计2个单体单元，使每个单体单元识别22bp识别位点的一部分，上述部分是在22bp识别位点诱导双链断裂一致必需的(wo2007/047859)。通过将2个单体单元连接成1个单链大范围核酸酶，可以实现一致的行为，或者还可以通过促进异二聚体形成来实现，例如wo2007/047859中所述。
seqidno.16提供了天然存在的i-crei单体的氨基酸序列。为了重新设计i-crei单体单元，使其异二聚体识别seqidno.1和/或2的核苷酸序列，下列氨基酸存在于所述位置上：
1.在大范围核酸酶单元1中：
a.第32位的s；
b.第33位的y；
c.第38位的e；
d.第40位的r；
e.第66位的k；
f.第80位的q；
g.第42位的t；
h.第77位的r；
i.第68位的r；
j.第70位的r；
k.第44位的q；
l.第24位的i；
m.第26位的s；
n.第28位的s；
o.第30位的r。
2.在大范围核酸酶单元2中：
p.第70位的r；
q.第44位的t；
r.第24位的i；
s.第26位的s；
t.第28位的s；
u.第30位的n；
v.第32位的s；
w.第33位的r；
x.第38位的q；
y.第80位的q；
z.第40位的r；
aa.第66位的k；
bb.第42位的t；
cc.第77位的r；
dd.第68位的r。
图1提供了它们的示意图。
重新设计的诱导双链断裂的酶可包括，但不必需包括，核定位信号(nls)，例如sv40大t抗原的nls(raikhel,plantphysiol.100：1627-1632(1992)及其中的参考文献)(kalderon等人，cell39：499-509(1984)。核定位信号可位于蛋白质中的任何位置，但通常位于蛋白质的n末端。核定位信号可以替代诱导双链断裂的酶的一个或多个氨基酸。应该注意到，如果重新设计的大范围核酸酶在蛋白质的n端提供了nls，例如sv40的10或12个氨基酸的nls，则应该相应的移动(增加)氨基酸位置。同样的，在2个单体单元连接到单链大范围核酸酶的事件中，也可移动第2个单元的位置。还可以通过如下所述确定最佳比对，来鉴别相对于i-crei氨基酸序列的相应氨基酸位置。明显的是，在单链重新设计的大范围核酸酶中，单元的顺序是无关的，即，不论上述单元1和2是在氨基酸单链中实际存在的顺序，或是在氨基酸单链中单元2在单元1之前，对于组合的2个单元能够识别靶序列而言都不造成差异。
适用于本发明的重新设计的大范围核酸酶可以包含seqidno.5和6展示的氨基酸序列(单体单元可以作为异二聚体切割识别位点)，或者可以包含seqidno.18表示的氨基酸序列(包含2个单元的单链大范围核酸酶，所述单元分别由氨基酸1至167和208至362表示，通过氨基酸168至205表示的接头序列连接)，或者可以包含含有seqidno.18的1至167和206至362的氨基酸序列的氨基酸序列(分别是单链大范围核酸酶的单元1和2，不含接头)。
传统上，可以通过表达植物可表达的、编码此类大范围核酸酶的重组基因，来提供重新设计的大范围核酸酶。出于该目的，可以将包含编码重新设计的大范围核酸酶或大范围核酸酶单体单元的核苷酸序列的dna区与植物可表达的启动子和参与转录终止和多聚腺苷酸化的dna区域有效连接，并导入到植物或植物细胞中。可以瞬时或稳定的导入编码重新设计的大范围核酸酶的重组基因。
出于本发明的目的，术语“植物有效启动子”和“植物可表达的启动子”意指能够在植物、植物组织、植物器官、植物部分或植物细胞中驱动转录的启动子。这包括能够在植物细胞中指导转录的任何植物起源的启动子，以及任何非植物起源的启动子。
可用于这一方面的启动子是组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒(camv)35s转录物的启动子(hapster等人，1988,mol.gen.genet.212：182-190)、camv19s启动子(美国专利号5,352,605；wo84/02913；benfey等人，1989,emboj.8:2195-2202)、地下三叶草病毒启动子no4或no7(wo96/06932)、rubisco小亚基启动子(美国专利号4,962,028)、泛素启动子(holtorf等人，1995,plantmol.biol.29:637-649)、t-dna基因启动子，例如农杆菌(agrobacterium)的章鱼碱合酶(ocs)和胭脂碱合酶(nos)启动子，和其它的本领域技术人员已知在植物中组成型表达的基因的启动子。
可用于该方面的其他启动子是组织特异性或器官特异性的启动子，优选的种子特异性启动子，例如2s白蛋白启动子(joseffson等人，1987,j.biol.chem.262:12196-12201)、菜豆蛋白启动子(美国专利号5,504,200；bustos等人，1989,plantcell1.(9):839-53)、豆球蛋白启动子(shirsat等人，1989,mol.gen.genet.215(2):326-331)、“未知的种子蛋白”(usp)启动子(baumlein等人，1991,mol.gen.genet.225(3):459-67)、油菜籽蛋白启动子(美国专利号5,608,152；stalberg等人，1996,planta199:515-519)、拟南芥油质蛋白启动子(wo98/45461)、芸苔属(brassica)bce4启动子(wo91/13980)，和其它本领域技术人员已知的在植物中种子特异性表达的基因的启动子。
可以使用的其他启动子是组织特异性或器官特异性的启动子，如器官原基特异性启动子(an等人，1996,plantcell8：15-30)、茎特异性启动子(keller等人，1988,emboj.7(12)：3625-3633)、叶特异性启动子(hudspeth等人，1989,plantmol.biol.12：579-589)、叶肉特异性启动子(例如光诱导型rubisco启动子)、根特异性启动子(keller等人，1989,genesdev.3：1639-1646)、块茎特异性启动子(keil等人，1989,emboj.8(5)：1323-1330)、维管组织特异性启动子(peleman等人，1989,gene84：359-369)、雄蕊选择性启动子(wo89/10396,wo92/13956)、裂区特异性启动子(wo97/13865)等。
编码适合本发明的重新设计的大范围核酸酶的核苷酸序列可以包含seqidno.4的核苷酸位置2004至核苷酸位置2525或2522的核苷酸序列，或者seqidno.4的核苷酸位置4885至核苷酸位置5405或5403的核苷酸序列。为了有利于克隆和其他重组dna技术，可以有利的在编码大范围核酸酶的区域中包含在植物中有功能的内含子，特别是单链大范围核酸酶。此类内含子可以包含例如seqidno.17的自核苷酸位置1606至1794的核苷酸序列。
编码重新设计的大范围核酸酶的dna区域可以被优化用于在植物中表达，通过调整gc含量、密码子选择、消除不需要的核苷酸序列。编码区可以被进一步优化用于在植物中表达，且合成的编码区可具有经设计满足下列规则的核苷酸序列：
a)核苷酸序列编码本文所述的功能上重新设计的回归内切核酸酶；
b)核苷酸序列具有约50％至约60％的gc含量；
c)核苷酸序列不包含选自gataat、tataaa、aatata、aatatt、gataaa、aatgaa、aataag、aataaa、aataat、aaccaa、atataa、aatcaa、atacta、ataaaa、atgaaa、aagcat、attaat、atacat、aaaata、attaaa、aattaa、aataca和cataaa的核苷酸序列；
d)核苷酸序列不包含选自ccaat、attgg、gcaat和attgc的核苷酸序列；
e)核苷酸序列不包含选自attta、aaggt、aggta、ggta和gcagg的序列；
f)核苷酸序列不包含由7个连续选自g或c的核苷酸组成的gc片段；
g)核苷酸序列不包含由5个连续选自a或t的核苷酸组成的at片段；
h)核苷酸序列不在第2或第3位包含含有ta或cg二链体的、编码leu、ile、val、ser、pro、thr、ala的密码子(即，核苷酸序列不包含密码子tta、cta、ata、gta、tcg、ccg、acg和gcg)。
此类优化序列的实例显示在seqidno.17的核苷酸位置1267至1605和核苷酸位置1795至2541(其中编码存在于2个大范围核酸酶单元之间的接头的核苷酸序列由nt1957至2070表示)。
此外明显的是，用于描述方法的术语，例如“导入dna片段”以及“从细胞再生植物”不暗示此类dna片段必需通过转化技术导入。实际上，对本领域技术人员明显的是，目的dna分子也可以通过一种植物与另一种的育种或杂交技术导入。
然而，明显的是可以通过本领域已知的任何方法将目的dna分子导入到植物细胞中，包括农杆菌介导的转化，以及也通过直接的dna转移方法。可以使用任何常规方法，将转化的dna分子转移到植物细胞中，包括但不限于直接的dna转移方法。如本文中使用的，“直接的dna转移”是将dna导入到植物细胞中的任何方法，所述方法不涉及使用天然的农杆菌属物种且能够将dna导入到植物细胞中。包括本领域普遍已知的方法，例如通过电穿孔将dna导入到原生质体中、通过电穿孔将dna导入到完整植物细胞或部分降解的组织或植物细胞中、通过活性剂(例如peg等)作用等导入dna到原生质体中、使用硅须和用dna包被的微粒轰击。
在预选位点导入双链断裂的能力开启了若干潜在的应用。可以将目标外来dna通过同源重组或者在存在非同源末端连接的过程中导入到预选位点。双链断裂可用于在预选位点诱导形成小缺失或插入，从而有效失活包含预选位点的核苷酸序列的嵌合基因。预选位点的双链断裂还可以促进在该位点附近将dna区域替换为目标dna区域，例如wo06/105946、wo08/037436或wo08/148559中所述。
为了通过同源重组将外来dna插入到预选位点，外来dna可以包含在修复dna内，其中，外来dna的侧翼是至少一个具有与预选位点上游或下游dna区域的核苷酸序列相似的核苷酸序列的侧翼dna区域。修复dna可以包含待插入的外来dna，其侧翼(在外来dna的上下游)是2个侧翼dna区域，与预选的位点的上游或下游的dna区域的核苷酸序列相似。可选的，外来dna可以同样通过非同源末端连接整合，即，不含与预定靶位点周围区域同源的侧翼序列(不含任何其他dna)。
如本文中使用的，“侧翼dna区域”是具有这样的核苷酸序列的dna，所述核苷酸序列与分别位于靶dna序列或预选的位点的上游或下游dna区域具有同源性。这允许更好的控制外来dna或目标dna分子的插入。实际上，通过同源重组整合将允许在核苷酸水平精确的连接外来dna片段和植物核基因组。
侧翼dna区域的长度可以改变，长度应该至少是约10个核苷酸。然而，侧翼区域可以是实践中尽可能的长(例如，多达约100-150kb，如完整的细菌人工染色体(bacs))。优选的，侧翼区域可以是约50bp至约2000bp。此外，目的外来dna侧翼的区域不需要与预选位点侧翼的dna区域相同，可以与预选位点侧翼的dna区域具有在约80％至约100％之间的序列同一性，优选约95％至约100％序列同一性。侧翼区域越长，同源性需要的严谨度越低。此外，优选的是，在外来dna精确插入的位置附近，序列同一性在实践中尽可能的高。此外，为了实现靶dna序列的交换，而不改变相邻dna序列的dna序列，侧翼dna序列应该优选的与预选位点侧翼的dna区域相同。
此外，目的外来dna侧翼的区域不必与紧邻预选位点侧翼的区域具有同源性，但可以与远离预选位点的核基因组的dna区域具有同源性。之后，插入外来dna可导致去除在预选的插入位点和同源性dna区域之间的靶dna。换言之，位于同源性区域之间的靶dna可被目的外来dna取代。因此，通过选择用于修复双链dna断裂的外来dna的恰当构象，通过导入根据本发明方法的外来dna分子，除插入外，还可以产生位于同源区域之间的基因组区域的定向取代或定向缺失。
待插入的外来dna还可以包含可选择的或可筛选的标志物，其可以在插入后去除或不去除。
如本文中使用的，“可选择的或可筛选的标志物”具有本领域通常的含义，包括但不限于植物可表达的膦丝菌素乙酰转移酶、新霉素磷酸转移酶、草甘膦氧化酶、草甘膦耐受性epsp酶、腈水解酶基因、变体乙酰乳酸合酶或乙酰羟基酸合酶基因、β-葡糖苷酸酶(gus)、r-基因座基因、绿色荧光蛋白等。
选择通过侧翼dna区域同源重组导入可选择的或可筛选的标志物和其余外来dna分子的植物细胞或植物可以如下实现，例如通过筛选存在于转化dna中，但位于侧翼dna区域外的序列的缺失。实际上，存在来自转化dna的侧翼dna区域外的序列表示转化植物细胞的起始是由于随机dna插入。出于此目的，可选择的或可筛选的标志物可以包含在侧翼dna区域外的转化dna分子中，然后可用于鉴别不具有位于转化dna外的可选择的或可筛选的标志物的那些植物细胞，所述植物细胞是通过侧翼dna区域同源重组产生的。可选的，转化dna分子可含有位于侧翼dna区域外的可选择的标志物，允许选择此类基因的缺失(负向可选择的标志物基因)。
明显的是，根据本发明的方法允许插入任何目的dna，所述目的dna包括包含具有特定核苷酸序列标签的核苷酸序列的dna，例如用于后续鉴别的标签。目的dna还可以是一种或多种植物可表达的基因，包括但不限于除草剂耐受性基因、昆虫抗性基因、疾病抗性基因、抗生素胁迫抗性基因、参与油生物合成或碳水化合物生物合成的酶、参与纤维强度和/或纤维长度的酶、参与次级代谢物生物合成的酶。
除草剂耐受性基因包括编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)的基因。此类epsps基因的实例是细菌鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)的aroa基因(变体ct7)(comai等人，1983,science221,370-371)、农杆菌的cp4基因(barry等人，1992,curr.topicsplantphysiol.7,139-145)、编码碧冬茄epsps的基因(shah等人，1986,science233,478-481)、西红柿epsps(gasser等人，1988,j.biol.chem.263,4280-4289)或穇epsps(wo01/66704)。还可以是突变的epsps，例如ep0837944、wo00/66746、wo00/66747或wo02/26995中所述。还可以通过表达编码草甘膦氧化还原酶的基因，获得草甘膦耐受性植物，如美国专利号5,776,760和5,463,175所述。还可以通过表达编码草甘膦乙酰转移酶的基因，获得草甘膦耐受性植物，例如wo02/36782、wo03/092360、wo05/012515和wo07/024782所述。还可以通过选择含有上述基因天然存在的突变的植物，获得草甘膦耐受性植物，例如wo01/024615或wo03/013226所述。产生草甘膦耐受性的epsps基因描述在例如美国专利申请号11/517,991、10/739,610、12/139,408、12/352,532、11/312,866、11/315,678、12/421,292、11/400,598、11/651,752、11/681,285、11/605,824、12/468,205、11/760,570、11/762,526、11/769,327、11/769,255、11/943801或12/362,774中。产生草甘膦耐受性的其他基因(例如，脱羧化酶基因)描述在例如美国专利申请11/588,811、11/185,342、12/364,724、11/185,560或12/423,926中。
其他除草剂耐受性基因可以编码解毒除草剂的酶或突变的谷氨酰胺合酶，所述酶耐受抑制，例如美国专利申请号11/760,602中描述的。一个此类有效解毒的酶是编码膦丝菌素乙酰转移酶的酶(例如来自链霉菌属物种的bar或pat蛋白)。膦丝菌素乙酰转移酶描述在例如美国专利号5,561,236；5,648,477；5,646,024；5,273,894；5,637,489；5,276,268；5,739,082；5,908,810和7,112,665中。
除草剂耐受性基因还可以产生对抑制羟苯基丙酮酸加双氧酶(hppd)的除草剂的耐受性。羟苯基丙酮酸加双氧酶是催化将对羟苯基丙酮酸(hrp)转化为尿黑酸的反应的酶。可以用编码天然存在的抗hppd酶的基因，或编码突变或嵌合hppd酶的基因转化耐受hppd抑制剂的植物，如wo96/38567、wo99/24585和wo99/24586、wo2009/144079、wo2002/046387或us6,768,044中所述。还可以通过用编码某些这样的酶的基因转化植物，来获得对hppd抑制剂的耐受性，所述酶即使在hppd抑制剂抑制天然hppd酶的条件下也能够形成尿黑酸。此类植物和基因描述在wo99/34008和wo02/36787中。除编码hppd耐受性酶的基因外，还可以通过用编码具有预苯酸脱氢酶(pdh)活性的酶的基因转化植物，来改善植物对hppd抑制剂的耐受性，如wo2004/024928所述。此外，通过在其基因组中加入编码能够代谢或降解hppd抑制剂的酶的基因，可以使植物更耐受hppd抑制剂除草剂，例如wo2007/103567和wo2008/150473中显示的cyp450酶。
其他的除草剂耐受性基因仍然编码变体als酶(也称为乙酰羟酸合酶，ahas)，例如tranel和wright(2002,weedscience50:700-712)所述，以及美国专利号5,605,011、5,378,824、5,141,870和5,013,659所述。磺酰脲耐受性植物和咪唑啉酮耐受性植物的生产描述在美国专利号5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937和5,378,824；和国际公开wo96/33270中。其他咪唑啉酮耐受性基因也描述在例如wo2004/040012、wo2004/106529、wo2005/020673、wo2005/093093、wo2006/007373、wo2006/015376、wo2006/024351和wo2006/060634中。其他磺酰脲和咪唑啉酮耐受性基因描述在例如wo07/024782和美国专利申请号61/288958中。
昆虫抗性基因可包括这样的编码序列，其编码：
1)苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)的杀虫性晶体蛋白或其杀虫性部分，例如crickmore等人(1998,microbiologyandmolecularbiologyreviews,62：807-813)列举的杀虫性晶体蛋白，由crickmore等人(2005)在苏云金芽孢杆菌毒素系统命名中更新，在线于：http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/，或其杀虫性部分，例如cry蛋白cry1ab、cry1ac、cry1b、cry1c、cry1d、cry1f、cry2ab、cry3aa或cry3bb类的蛋白质，或其杀虫性部分(例如，ep1999141和wo2007/107302)，或由合成基因编码的此类蛋白质，例如描述在美国专利申请号12/249,016中；或
2)苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白或其部分，所述晶体蛋白或其部分在存在第二种苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白或其部分的条件下是杀虫性的，例如由cry34和cry35晶体蛋白组成的二元毒素(moellenbeck等人，2001,nat.biotechnol.19：668-72；schnepf等人，2006,appliedenvironm.microbiol.71,1765-1774)或由cry1a或cry1f蛋白，与cry2aa或cry2ab或cry2ae蛋白组成的二元毒素(美国专利申请号12/214,022和ep08010791.5)；或
3)杂交的杀虫性蛋白，包含苏云金芽孢杆菌的不同的杀虫性晶体蛋白部分，例如上述1)的蛋白质的杂合体，或上述2)的蛋白质的杂合体，例如由玉米事件mon89034生产的cry1a.105蛋白(wo2007/027777)；或
4)上述1)至3)的任一项的蛋白质，其中一些(尤其是1至10个)氨基酸被另一种氨基酸取代，从而获得对目标昆虫物种更高的杀虫活性，和/或从而扩大了所影响的目标昆虫物种的范围，和/或是因为在克隆或转化过程中导入到编码dna中的变化，例如在玉米事件mon863或mon88017中的cry3bb1蛋白，或在玉米事件mir604中的cry3a蛋白；或
5)苏云金芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)的杀虫性分泌蛋白，或其杀虫性部分，例如营养期杀虫(vip)蛋白，列举在：http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/vip.html，例如vip3aa蛋白质类的蛋白质；或
6)苏云金芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌的分泌蛋白，所述分泌蛋白在存在第二种苏云金芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌的分泌蛋白的条件下是杀虫性的，例如由vip1a和vip2a蛋白组成的二元毒素(wo94/21795)；或
7)杂交的杀虫性蛋白，包含苏云金芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌的不同的分泌蛋白的部分，例如上述1)的蛋白质的杂合体，或上述2)的蛋白质的杂合体；或
8)上述5)至7)的任一项的蛋白质，其中一些(尤其是1至10个)氨基酸被另一种氨基酸取代，从而获得对目标昆虫物种更高的杀虫活性，和/或从而扩大了所影响的目标昆虫物种的范围，和/或是由于在克隆或转化过程中导入到编码dna中的变化(但仍编码杀虫性蛋白)，例如在棉花事件cot102中的vip3aa蛋白；或
9)苏云金芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌的分泌蛋白，所述分泌蛋白在存在苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白的条件下是杀虫性的，例如由vip3与cry1a或cry1f组成的二元毒素(美国专利申请号61/126083和61/195019)，或由vip3蛋白与cry2aa或cry2ab或cry2ae蛋白组成的二元毒素(美国专利申请号12/214,022和ep08010791.5)；
10)上述9)的蛋白质，其中一些(尤其是1至10个)氨基酸被另一种氨基酸取代，从而获得对目标昆虫物种更高的杀虫活性，和/或从而扩大了所影响的目标昆虫物种的范围，和/或是由于在克隆或转化过程中导入到编码dna中的变化(但仍编码杀虫性蛋白)。
如本文中使用的，“昆虫抗性基因”还包括这样的转基因，所述转基因包含在被植物昆虫害虫摄入后表达双链rna所产生的序列，抑制昆虫害虫的生长，描述在例如wo2007/080126、wo2006/129204、wo2007/074405、wo2007/080127和wo2007/035650中。
抗生素胁迫耐受性基因，包括
1)能够降低多聚(adp-核糖)聚合酶(parp)基因在植物细胞或植物中的表达和/或活性的转基因，如wo00/04173、wo/2006/045633、ep04077984.5或ep06009836.5所述。
2)能够降低植物或植物细胞的parg编码基因表达和/或活性的转基因，描述在例如wo2004/090140中。
3)编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成通路中的植物功能性酶的转基因，包括烟酰胺酶、烟酸盐磷酸核糖转移酶、烟酸单核苷酸腺嘌呤基转移酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶或烟碱酰胺磷酸核糖转移酶，描述在例如ep04077624.7、wo2006/133827、pct/ep07/002433、ep1999263或wo2007/107326中。
参与碳水化合物生物合成的酶包括如下所述的，例如，ep0571427、wo95/04826、ep0719338、wo96/15248、wo96/19581、wo96/27674、wo97/11188、wo97/26362、wo97/32985、wo97/42328、wo97/44472、wo97/45545、wo98/27212、wo98/40503、wo99/58688、wo99/58690、wo99/58654、wo00/08184、wo00/08185、wo00/08175、wo00/28052、wo00/77229、wo01/12782、wo01/12826、wo02/101059、wo03/071860、wo2004/056999、wo2005/030942、wo2005/030941、wo2005/095632、wo2005/095617、wo2005/095619、wo2005/095618、wo2005/123927、wo2006/018319、wo2006/103107、wo2006/108702、wo2007/009823、wo00/22140、wo2006/063862、wo2006/072603、wo02/034923、ep06090134.5、ep06090228.5、ep06090227.7、ep07090007.1、ep07090009.7、wo01/14569、wo02/79410、wo03/33540、wo2004/078983、wo01/19975、wo95/26407、wo96/34968、wo98/20145、wo99/12950、wo99/66050、wo99/53072、us6,734,341、wo00/11192、wo98/22604、wo98/32326、wo01/98509、wo2005/002359、us5,824,790、us6,013,861、wo94/04693、wo94/09144、wo94/11520、wo95/35026或wo97/20936，或参与下述生产的酶：多聚果糖生产，所述多聚果糖尤其是菊粉和levan-型，如公开在ep0663956、wo96/01904、wo96/21023、wo98/39460和wo99/24593中，α-1,4-葡聚糖的生产，如公开在wo95/31553、us2002031826、us6,284,479、us5,712,107、wo97/47806、wo97/47807、wo97/47808和wo00/14249中，α-1,6分支的α-1,4-葡聚糖的生产，如公开在wo00/73422中，alternan的生产，如公开在例如，wo00/47727、wo00/73422、ep06077301.7、us5,908,975和ep0728213中，透明质酸的生产，如公开在wo2006/032538、wo2007/039314、wo2007/039315、wo2007/039316、jp2006304779和wo2005/012529中。
本发明还提供了向转基因植物细胞的(核)基因组的预定或预选的位点中导入缺失的方法，包括步骤：
a.在预定位点诱导双链dna断裂；和
b.选择在所述预定位点具有缺失的植物细胞；
其中预定位点是不同于天然存在的大范围核酸酶识别位点的核苷酸序列，是通常作为转基因植物的转基因的一部分导入的核苷酸序列，且其中双链dna断裂的诱导是通过导入非天然存在的单链大范围核酸酶或成对非天然大范围核酸酶单体单元，所述大范围核酸酶识别或一起识别预定位点并诱导双链断裂。
作为本发明的实施方案，还提供了编码本文所述的重新设计的大范围核酸酶的嵌合基因，其中嵌合基因包含植物可表达的启动子，所述启动子与编码这样的蛋白质的dna区域有效连接，所述蛋白质包含的氨基酸序列对应于作为支架的i-crei的氨基酸序列，包含：第32位的s；第33位的y；第38位的e；第40位的r；第66位的k；第80位的q；第42位的t；第77位的r；第68位的r；第70位的r；第44位的q；第24位的i；第26位的s；第28位的s和第30位的r或第70位的r；第44位的t；第24位的i；第26位的s；第28位的s；第30位的n；第32位的s；第33位的r；第38位的q；第80位的q；第40位的r；第66位的k；第42位的t；第77位的r和第68位的r(位置对应于i-crei的氨基酸序列，可以通过比对确定重新设计的大范围核酸酶中的相应氨基酸位置)，例如包含seqidno.5和seqidno.6的氨基酸序列的蛋白质，或包含seqidno.18的氨基酸序列的蛋白质，或包含seqidno18的位置1至167的氨基酸序列和seqidno18的位置206至362的氨基酸序列的蛋白质。
可以理解，本发明的工具和方法可用于任何植物，包括玉米、烟草、谷类植物，包括小麦、燕麦、大麦、黑麦、稻、草坪草(turfgrass)、高粱、粟或甘蔗植物。本发明的方法还可以用于任何植物(被子植物门或裸子植物门)，包括但不限于棉花、油菜(canola)、油菜籽油菜(oilseedrape)、大豆、蔬菜、土豆、浮萍属(lemna)物种、烟草属(nicotiana)物种、拟南芥、苜蓿、大麦、菜豆、玉米、棉花、亚麻、豌豆、欧洲油菜(rape)、稻、黑麦、红花、高粱、大豆、向日葵、烟草、小麦、天门冬、甜菜和糖萝卜、椰菜、甘蓝、胡萝卜、花椰菜、芹菜、黄瓜、茄子、莴苣、洋葱、油菜籽油菜、胡椒、土豆、西葫芦、萝卜、菠菜、南瓜(squash)、番茄、夏南瓜(zucchini)、扁桃、苹果、杏、香蕉、黑莓、蓝莓、可可、樱桃、椰子、越橘、枣椰子、葡萄、葡萄柚、番石榴、猕猴桃、柠檬、来檬、芒果、瓜、油桃、桔、番木瓜、西番莲(passionfruit)、桃、花生、梨、凤梨、阿月浑子、李、悬钩子、草莓、红桔(tangerine)、核桃和西瓜。
本发明的目标还是提供根据本发明方法产生的植物细胞和植物。通过传统育种方法产生的、包含dna插入事件的植物的配子、种子、胚(合子或体细胞的)、后代或杂合体也包括在本发明的范围内。此类植物可含有插入到靶序列处或替代靶序列的异源或外来dna序列，且与其祖先植物的区别仅在于存在该异源dna或交换后的dna序列。
通过本文所述方法获得的植物可以进一步通过传统育种技术与其他植物杂交，获得包含根据本发明获得的靶向dna插入事件的后代植物。
可以用化学化合物进一步处理根据本发明的植物和种子，例如选自下列列表的化学化合物：
●水果/蔬菜除草剂：阿特拉嗪(atrazine)、除草定(bromacil)、敌草隆(diuron)、草甘膦(glyphosate)、利谷隆(linuron)、赛克津(metribuzin)、西马嗪(simazine)、氟乐灵(trifluralin)、吡氟禾草灵(fluazifop)、草铵膦(glufosinate)、halosulfurongowan、百草枯(paraquat)、拿草特(propyzamide)、稀禾定(sethoxydim)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、吡氯黄隆(halosulfuron)、indaziflam；
●水果/蔬菜杀虫剂：涕灭威(aldicarb)、苏云金芽孢杆菌(bacillusthuriengiensis)、甲萘威(carbaryl)、虫螨威(carbofuran)、毒死蜱(chlorpyrifos)、氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(deltamethrin)、齐墩螨素(abamectin)、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯(cyfluthrin/beta-cyfluthrin)、高氰戊菊酯(esfenvalerate)、λ-氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)、灭螨醌(acequinocyl)、联苯肼酯(bifenazate)、甲氧苯酰肼(methoxyfenozide)、双苯氟脲(novaluron)、环虫酰肼(chromafenozide)、噻虫啉(thiacloprid)、呋虫胺(dinotefuran)、嘧螨酯(fluacrypyrim)、螺螨酯(spirodiclofen)、γ-氯氟氰菊酯(gamma-cyhalothrin)、螺甲螨酯(spiromesifen)、艾克敌105(spinosad)、氯虫苯甲酰胺(rynaxypyr)、氰虫酰胺(cyazypyr)、杀铃脲(triflumuron)、螺虫乙酯(spirotetramat)、吡虫啉(imidacloprid)、氟虫酰胺(flubendiamide)、硫双威(thiodicarb)、氰氟虫腙(metaflumizone)、氟啶虫胺腈(sulfoxaflor)、丁氟螨酯(cyflumetofen)、cyanopyrafen、clothianidin、噻虫嗪(thiamethoxam)、spinotoram、硫双威(thiodicarb)、氟啶虫酰胺(flonicamid)、灭虫威(methiocarb)、埃玛菌素(emamectin-benzoate)、e二唑虫(indoxacarb)、克线磷(fenamiphos)、吡丙醚(pyriproxifen)、杀螨锡(fenbutatin-oxid)
●水果/蔬菜杀真菌剂：ametoctradin、腈嘧菌酯(azoxystrobin)、苯噻菌胺(benthiavalicarb)、啶酰菌胺(boscalid)、克菌丹(captan)、多菌灵(carbendazim)、百菌清(chlorothalonil)、铜(copper)、氰霜唑(cyazofamid)、环氟菌胺(cyflufenamid)、清菌脲(cymoxanil)、环唑醇(cyproconazole)、环丙嘧啶(cyprodinil)、醚唑(difenoconazole)、dimetomorph、二噻农(dithianon)、咪唑菌酮(fenamidone)、环酰菌胺(fenhexamid)、氟啶胺(fluazinam)、氟菌(fludioxonil)、氟吡菌胺(fluopicolide)、fluopyram、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、fluxapyroxad、灭菌丹(folpet)、藻菌磷(fosetyl)、异丙定(iprodione)、异丙菌胺(iprovalicarb)、isopyrazam、苯氧菊酯(kresoxim-methyl)、代森锰锌(mancozeb)、双炔酰菌胺(mandipropamid)、甲霜灵/mefenoxam(metalaxyl/mefenoxam)、代森联(metiram)、苯菌酮(metrafenone)、腈菌唑(myclobutanil)、戊菌唑(penconazole)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、百维灵(propamocarb)、丙环唑(propiconazole)、甲基代森锌(propineb)、丙氧喹啉(proquinazid)、丙硫菌唑(prothioconazole)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、二甲嘧菌胺(pyrimethanil)、喹氧灵(quinoxyfen)、螺茂胺(spiroxamine)、硫黄(sulphur)、戊唑醇(tebuconazole)、托布津-甲基(thiophanate-methyl)、肟菌酯(trifloxystrobin)
●谷类除草剂:2.4-d、磺氨黄隆(amidosulfuron)、溴苯腈(bromoxynil)、氟酮唑草-e(carfentrazone-e)、绿麦隆(chlorotoluron)、氯磺隆(chlorsulfuron)、炔草酯-p(clodinafop-p)、二氯皮考啉酸(clopyralid)、麦草畏(dicamba)、氯甲草-m(diclofop-m)、吡氟草胺(diflufenican)、e唑禾草灵(fenoxaprop)、双氟磺草胺(florasulam)、氟酮黄隆-na(flucarbazone-na)、氟噻草胺(flufenacet)、氟啶黄隆-m(flupyrsulfuron-m)、氟草烟(fluroxypyr)、呋草酮(flurtamone)、草甘膦(glyphosate)、碘黄隆(iodosulfuron)、碘苯腈(ioxynil)、异丙隆(isoproturon)、2甲4氯(mcpa)、甲基二黄隆(mesosulfuron)、甲黄隆(metsulfuron)、胺硝草(pendimethalin)、pinoxaden、丙苯磺隆(propoxycarbazone)、苄草丹(prosulfocarb)、pyroxsulam、乙黄黄隆(sulfosulfuron)、噻黄隆(thifensulfuron)、肟草酮(tralkoxydim)、醚苯黄隆(triasulfuron)、苯黄隆(tribenuron)、氟乐灵(trifluralin)、三氟甲黄隆(tritosulfuron)
●谷类杀真菌剂:腈嘧菌酯(azoxystrobin)、bixafen、啶酰菌胺(boscalid)、多菌灵(carbendazim)、百菌清(chlorothalonil)、环氟菌胺(cyflufenamid)、环唑醇(cyproconazole)、环丙嘧啶(cyprodinil)、醚菌胺(dimoxystrobin)、氧唑菌(epoxiconazole)、苯锈啶(fenpropidin)、丁苯吗啉(fenpropimorph)、fluopyram、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、喹唑菌酮(fluquinconazole)、fluxapyroxad、isopyrazam、苯氧菊酯(kresoxim-methyl)、环戊唑菌(metconazole)、苯菌酮(metrafenone)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、丙氯灵(prochloraz)、丙环唑(propiconazole)、丙氧喹啉(proquinazid)、丙硫菌唑(prothioconazole)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、喹氧灵(quinoxyfen)、螺茂胺(spiroxamine)、戊唑醇(tebuconazole)、托布津-甲基(thiophanate-methyl)、肟菌酯(trifloxystrobin)
●谷类杀虫剂:乐果(dimethoate)、lambda-cyhalthrin、溴氰菊酯(deltamethrin)、顺式氯氰菊酯(alpha-cypermethrin)、β-氟氯氰菊酯(β-cyfluthrin)、氟氯菊酯(bifenthrin)、吡虫啉(imidacloprid)、噻虫胺(clothianidin)、噻虫嗪(thiamethoxam)、噻虫啉(thiacloprid)、吡虫清(acetamiprid)、dinetofuran、clorphyriphos、抗蚜威(pirimicarb)、灭虫威(methiocarb)、sulfoxaflor
●玉米除草剂:阿特拉津(atrazine)、甲草胺(alachlor)、溴苯腈(bromoxynil)、乙草胺(acetochlor)、麦草畏(dicamba)、二氯皮考啉酸(clopyralid)、(s-)噻吩草胺((s-)dimethenamid)、草铵膦(glufosinate)、草甘膦(glyphosate)、异e氟草(isoxaflutole)、(s-)异丙甲草胺((s-)metolachlor)、甲基磺草酮(mesotrione)、烟黄隆(nicosulfuron)、氟嘧黄隆(primisulfuron)、玉嘧黄隆(rimsulfuron)、磺草酮(sulcotrione)、甲酰胺黄隆(foramsulfuron)、topramezone、tembotrione、saflufenacil、thiencarbazone、氟噻草胺(flufenacet)、pyroxasulfon
●玉米杀虫剂:虫螨威(carbofuran)、毒死蜱(chlorpyrifos)、氟氯菊酯(bifenthrin)、锐劲特(fipronil)、吡虫啉(imidacloprid)、λ-氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)、七氟菊酯(tefluthrin)、特丁磷(terbufos)、噻虫嗪(thiamethoxam)、噻虫胺(clothianidin)、螺甲螨酯(spiromesifen)、氟虫酰胺(flubendiamide)、杀虫隆(triflumuron)、rynaxypyr、溴氰菊酯(deltamethrin)、硫双威(thiodicarb)、β-氟氯氰菊酯(β-cyfluthrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、氟氯菊酯(bifenthrin)、氟丙氧脲(lufenuron)、tebupirimphos、乙虫清(ethiprole)、cyazypyr、噻虫啉(thiacloprid)、吡虫清(acetamiprid)、dinetofuran、阿佛菌素(avermectin)
●玉米杀真菌剂:腈嘧菌酯(azoxystrobin)、bixafen、啶酰菌胺(boscalid)、环唑醇(cyproconazole)、醚菌胺(dimoxystrobin)、氧唑菌(epoxiconazole)、种地酯(fenitropan)、fluopyram、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、fluxapyroxad、isopyrazam、环戊唑菌(metconazole)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、丙环唑(propiconazole)、丙硫菌唑(prothioconazole)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、戊唑醇(tebuconazole)、肟菌酯(trifloxystrobin)
●稻除草剂:丁草胺(butachlor)、敌稗(propanil)、四唑黄隆(azimsulfuron)、苄嘧黄隆(bensulfuron)、氰氟草酯(cyhalofop)、香草隆(daimuron)、四唑草胺(fentrazamide)、啶咪黄隆(imazosulfuron)、苯噻草胺(mefenacet)、氯e嗪草(oxaziclomefone)、吡嘧黄隆(pyrazosulfuron)、稗草畏(pyributicarb)、二氯喹啉酸(quinclorac)、杀草丹(thiobencarb)、茚草酮(indanofan)、氟噻草胺(flufenacet)、四唑草胺(fentrazamide)、吡氯黄隆(halosulfuron)、氯e嗪草(oxaziclomefone)、双环磺草酮(benzobicyclon)、环酯草醚(pyriftalid)、五氟磺草胺(penoxsulam)、双嘧苯甲酸(bispyribac)、炔丙e唑草(oxadiargyl)、乙氧嘧黄隆(ethoxysulfuron)、丙草胺(pretilachlor)、甲基磺草酮(mesotrione)、tefuryltrione、恶草灵(oxadiazone)、e唑禾草灵(fenoxaprop)、pyrimisulfan
●稻杀虫剂:二嗪农(diazinon)、丁苯威(fenobucarb)、丙硫克百威(benfuracarb)、噻嗪酮(buprofezin)、呋虫胺(dinotefuran)、锐劲特(fipronil)、吡虫啉(imidacloprid)、异丙威(isoprocarb)、噻虫啉(thiacloprid)、chromafenozide、噻虫胺(clothianidin)、乙虫清(ethiprole)、氟虫酰胺(flubendiamide)、rynaxypyr、溴氰菊酯(deltamethrin)、吡虫清(acetamiprid)、噻虫嗪(thiamethoxam)、cyazypyr、艾克敌105(spinosad)、spinotoram、埃玛菌素(emamectin-benzoate)、氯氰菊酯(cypermethrin)、chlorpyriphos、醚菊酯(etofenprox)、虫螨威(carbofuran)、丙硫克百威(benfuracarb)、sulfoxaflor
●稻杀真菌剂:腈嘧菌酯(azoxystrobin)、多菌灵(carbendazim)、氯环丙酰胺(carpropamid)、双氯氰菌胺(diclocymet)、醚唑(difenoconazole)、稻瘟光(edifenphos)、嘧菌腙(ferimzone)、庆大霉素(gentamycin)、己唑醇(hexaconazole)、土菌消(hymexazol)、异稻瘟净(iprobenfos(ibp))、稻瘟灵(isoprothiolane)、isotianil、春雷霉素(kasugamycin)、代森锰锌(mancozeb)、叉氨苯酰胺(metominostrobin)、肟醚菌胺(orysastrobin)、戊菌隆(pencycuron)、噻菌灵(probenazole)、丙环唑(propiconazole)、甲基代森锌(propineb)、咯喹酮(pyroquilon)、戊唑醇(tebuconazole)、托布津-甲基(thiophanate-methyl)、噻酰菌胺(tiadinil)、三环唑(tricyclazole)、肟菌酯(trifloxystrobin)、有效霉素(validamycin)
●棉花除草剂:敌草隆(diuron)、伏草隆(fluometuron)、msma、氟硝草醚(oxyfluorfen)、扑草净(prometryn)、氟乐灵(trifluralin)、氟酮唑草(carfentrazone)、烯草酮(clethodim)、吡氟禾草灵-丁酰(fluazifop-butyl)、草甘膦(glyphosate)、达草灭(norflurazon)、胺硝草(pendimethalin)、嘧硫苯甲酸钠(pyrithiobac-sodium)、三氟啶黄隆(trifloxysulfuron)、醌肟草(tepraloxydim)、草铵膦(glufosinate)、氟e嗪酮(flumioxazin)、赛二唑素(thidiazuron)
●棉花杀虫剂:高灭磷(acephate)、涕灭威(aldicarb)、毒死蜱(chlorpyrifos)、氯氰菊酯(cypermethrin)、溴氰菊酯(deltamethrin)、齐墩螨素(abamectin)、吡虫清(acetamiprid)、埃玛菌素(emamectinbenzoate)、吡虫啉(imidacloprid)、e二唑虫(indoxacarb)、λ-氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)、艾克敌105(spinosad)、硫双威(thiodicarb)、γ-氯氟氰菊酯(gamma-cyhalothrin)、螺甲螨酯(spiromesifen)、啶虫丙醚(pyridalyl)、氟啶虫酰胺(flonicamid)、氟虫酰胺(flubendiamide))、杀虫隆(triflumuron)、rynaxypyr、β-氟氯氰菊酯(beta-cyfluthrin)、螺虫乙酯(spirotetramat)
●噻虫胺(clothianidin)、噻虫嗪(thiamethoxam)、噻虫啉(thiacloprid)、dinetofuran、氟虫酰胺(flubendiamide)、cyazypyr、艾克敌105(spinosad)、spinotoram、γ-氯氟氰菊酯(gammacyhalothrin)、4-[[(6-氨基吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5h)-酮(4-[[(6-chlorpyridin-3-yl)methyl](2,2-difluorethyl)amino]furan-2(5h)-on)、硫双威(thiodicarb)、艾外麦汀(avermectin)、氟啶虫酰胺(flonicamid)、啶虫丙醚(pyridalyl)、螺甲螨酯(spiromesifen)、sulfoxaflor
●棉花杀真菌剂:腈嘧菌酯(azoxystrobin)、bixafen、啶酰菌胺(boscalid)、多菌灵(carbendazim)、百菌清(chlorothalonil)、铜(copper)、环唑醇(cyproconazole)、醚唑(difenoconazole)、醚菌胺(dimoxystrobin)、氧唑菌(epoxiconazole)、咪唑菌酮(fenamidone)、氟啶胺(fluazinam)、fluopyram、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、fluxapyroxad、异丙定(iprodione)、isopyrazam、isotianil、代森锰锌(mancozeb)、代森锰(maneb)、叉氨苯酰胺(metominostrobin)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、甲基代森锌(propineb)、丙硫菌唑(prothioconazole)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、五氯硝基苯(quintozene)、戊唑醇(tebuconazole)、氟醚唑(tetraconazole)、托布津-甲基(thiophanate-methyl)、肟菌酯(trifloxystrobin)
●大豆除草剂:甲草胺(alachlor)、噻草平(bentazone)、氟乐灵(trifluralin)、氯嘧磺隆(chlorimuron-ethyl)、唑嘧磺胺盐-甲基(cloransulam-methyl)、e唑禾草灵(fenoxaprop)、氟黄胺草醚(fomesafen)、吡氟禾草灵(fluazifop)、草甘膦(glyphosate)、咪草啶酸(imazamox)、灭草喹(imazaquin)、咪草烟(imazethapyr)、(s-)异丙甲草胺((s-)metolachlor)、赛克津(metribuzin)、胺硝草(pendimethalin)、醌肟草(tepraloxydim)、草铵膦(glufosinate)
●大豆杀虫剂:λ-氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)、灭多虫(methomyl)、吡虫啉(imidacloprid)、噻虫胺(clothianidin)、噻虫嗪(thiamethoxam)、噻虫啉(thiacloprid)、吡虫清(acetamiprid)、dinetofuran、氟虫酰胺(flubendiamide)、rynaxypyr、cyazypyr、艾克敌105(spinosad)、spinotoram、埃玛菌素(emamectin-benzoate)、锐劲特(fipronil)、乙虫清(ethiprole)、溴氰菊酯(deltamethrin)、β-氟氯氰菊酯(β-cyfluthrin)、γ和λ氯氟氰菊酯(gammaandlambdacyhalothrin)、4-[[(6-氨基吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5h)-酮(4-[[(6-chlorpyridin-3-yl)methyl](2,2-difluorethyl)amino]furan-2(5h)-on)、螺虫乙酯(spirotetramat)、spinodiclofen、杀虫隆(triflumuron)、氟啶虫酰胺(flonicamid)、硫双威(thiodicarb)、β-氟氯氰菊酯(beta-cyfluthrin)
●大豆杀真菌剂:腈嘧菌酯(azoxystrobin)、bixafen、啶酰菌胺(boscalid)、多菌灵(carbendazim)、百菌清(chlorothalonil)、铜(copper)、环唑醇(cyproconazole)、醚唑(difenoconazole)、醚菌胺(dimoxystrobin)、氧唑菌(epoxiconazole)、氟啶胺(fluazinam)、fluopyram、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、粉唑醇(flutriafol)、fluxapyroxad、isopyrazam、异丙定(iprodione)、isotianil、代森锰锌(mancozeb)、代森锰(maneb)、环戊唑菌(metconazole)、叉氨苯酰胺(metominostrobin)、腈菌唑(myclobutanil)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、丙环唑(propiconazole)、甲基代森锌(propineb)、丙硫菌唑(prothioconazole)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、戊唑醇(tebuconazole)、氟醚唑(tetraconazole)、托布津-甲基(thiophanate-methyl)、肟菌酯(trifloxystrobin)
●糖萝卜(sugarbeet)除草剂:杀草敏(chloridazon)、异苯敌草(desmedipham)、乙呋草黄(ethofumesate)、苯敌草(phenmedipham)、野麦畏(triallate)、二氯皮考啉酸(clopyralid)、吡氟禾草灵(fluazifop)、环草定(lenacil)、苯嗪草(metamitron)、喹草酸(quinmerac)、噻草酮(cycloxydim)、氟胺黄隆(triflusulfuron)、醌肟草(tepraloxydim)、喹禾灵(quizalofop)
●糖萝卜杀虫剂:吡虫啉(imidacloprid)、噻虫胺(clothianidin)、噻虫嗪(thiamethoxam)、噻虫啉(thiacloprid)、吡虫清(acetamiprid)、dinetofuran、溴氰菊酯(deltamethrin)、β-氯氟氰菊酯(β-cyfluthrin)、γ/λ氯氟氰菊酯(gamma/lambdacyhalothrin)、4-[[(6-氨基吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5h)-酮(4-[[(6-chlorpyridin-3-yl)methyl](2,2-difluorethyl)amino]furan-2(5h)-on)、七氟菊酯(tefluthrin)、rynaxypyr、cyaxypyr、锐劲特(fipronil)、虫螨威(carbofuran)
●油菜除草剂:二氯皮考啉酸(clopyralid)、氯甲草(diclofop)、吡氟禾草灵(fluazifop)、草铵膦(glufosinate)、草甘膦(glyphosate)、吡草胺(metazachlor)、氟乐灵(trifluralin)、胺苯黄隆(ethametsulfuron)、喹草酸(quinmerac)、喹禾灵(quizalofop)、烯草酮(clethodim)、醌肟草(tepraloxydim)
●油菜杀真菌剂:腈嘧菌酯(azoxystrobin)、bixafen、啶酰菌胺(boscalid)、多菌灵(carbendazim)、环唑醇(cyproconazole)、醚唑(difenoconazole)、醚菌胺(dimoxystrobin)、氧唑菌(epoxiconazole)、氟啶胺(fluazinam)、fluopyram、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、氟硅唑(flusilazole)、fluxapyroxad、异丙定(iprodione)、isopyrazam、助壮素(mepiquat-chloride)、环戊唑菌(metconazole)、叉氨苯酰胺(metominostrobin)、paclobutrazole、吡噻菌胺(penthiopyrad.)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、丙氯灵(prochloraz)、丙硫菌唑(prothioconazole)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、戊唑醇(tebuconazole)、托布津-甲基(thiophanate-methyl)、肟菌酯(trifloxystrobin)、烯菌酮(vinclozolin)
●油菜杀虫剂:虫螨威(carbofuran)、噻虫啉(thiacloprid)、溴氰菊酯(deltamethrin)、吡虫啉(imidacloprid)、噻虫胺(clothianidin)、噻虫嗪(thiamethoxam)、吡虫清(acetamiprid)、dinetofuran、β-氟氯氰菊酯(β-cyfluthrin)、γ和λ氯氟氰菊酯(gammaandlambdacyhalothrin)、tau-fluvaleriate、乙虫清(ethiprole)、艾克敌105(spinosad)、spinotoram、氟虫酰胺(flubendiamide)、rynaxypyr、cyazypyr、4-[[(6-氨基吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5h)-酮(4-[[(6-chlorpyridin-3-yl)methyl](2,2-difluorethyl)amino]furan-2(5h)-on
如本文中使用的，“包含”视为说明存在所述特征、整数、步骤或组分，表示但不排除存在或加入一种或多种特征、整数、步骤或组分，或其组合。因此，例如，包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可以包含多于实际所述的核苷酸或氨基酸的核苷酸或氨基酸，即，嵌入到更大的核酸或蛋白质中。包含功能上或结构上定义的dna区域的嵌合基因可以包含其他的dna区域等。
如本文中使用的，“植物部分”包括任何植物器官或植物组织，包括但不限于果实、种子、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、枝条、花、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
出于本发明的目的，2条相关的核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”(用百分比表示)指2条最佳比对的序列中具有相同残基的位置的数量(x100)除以比较的位置数。空位(即，在比对中残基存在于一条序列而不存在于另一条中的位置)被视为具有不同残基的位置。通过needleman和wunsch算法实施2条序列的比对(needleman和wunsch1970)。常规可以使用标准的软件程序，实施上述计算机辅助的序列比对，例如gap，其是wisconsinpackage10.1版的一部分(geneticscomputergroup,madison,wisconsin、usa)，使用默认的评分矩阵，具有空位创建罚分50和空位延伸罚分3。
明显的是，当参照相应的dna分子的核苷酸序列定义rna分子的核苷酸序列时，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)应该被尿嘧啶(u)取代。不论参考rna或dna分子，根据本申请的上下文都是明确的。
下列非限制性实施例描述了使用重新设计的大范围核酸酶在已存在于植物基因组中的bar编码区的位点修饰植物。
除非实施例中另外提及，则所有重组dna技术都是根据标准规程进行的，如sambrook等人，(1989)molecularcloning：alaboratorymanual，第2版，coldspringharborlaboratorypress,ny和ausubel等人，(1994)currentprotocolsinmolecularbiology,currentprotocols、usa的第1和第2卷中所述。用于植物分子工作的标准材料和方法描述在r.d.d.croy与biosscientificpublicationsltd(uk)和blackwellscientificpublications,uk联合出版的plantmolecularbiologylabfax(1993)中。标准分子生物学技术的其他参考文献包括sambrook和russell(2001)molecularcloning：alaboratorymanual，第3版，coldspringharborlaboratorypress,ny，brown(1998)的第i和第ii卷，molecularbiologylabfax,第二版,academicpress(uk)。用于聚合酶链式反应的标准材料和方法可见于dieffenbach和dveksler(1995)pcrprimer：alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress，和mcpherson等人，(2000)pcr-basics：frombackgroundtobench,firstedition,springerverlag,germany中。
出于任何目的，本文提及的所有专利、专利申请和出版物都通过引用全文整合到本文中。
在说明书和实施例全文中，引用下列序列：
seqidno.1：重新设计的大范围核酸酶bay39/bay40的识别位点的核苷酸序列
seqidno.2：重新设计的大范围核酸酶bay39/bay40的识别位点的互补体的核苷酸序列
seqidno.3：bar基因编码区的核苷酸序列
seqidno.4：表达成对异二聚体大范围核酸酶bay39和bay40的载体pcv177的核苷酸序列
seqidno.5：大范围核酸酶bay39/40单体单元2(“40”)的氨基酸序列
seqidno.6：大范围核酸酶bay39/40单体单元1(“39”)的氨基酸序列
seqidno.7：在bay39/40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子的核苷酸序列(对照)
seqidno.8：在bay39/40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子的核苷酸序列(ppt耐受性株系)
seqidno.9：在bay39/40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子的核苷酸序列(ppt敏感型株系1)
seqidno.10：在bay39/40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子的核苷酸序列(ppt敏感型株系2)
seqidno.11：在bay39/40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子的核苷酸序列(ppt敏感型株系3)
seqidno.12：在bay39/40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子的核苷酸序列(ppt敏感型株系4)
seqidno.13：在bay39/40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子的核苷酸序列(ppt敏感型株系5)
seqidno.14：在bay39/40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子的核苷酸序列(ppt敏感型株系6)
seqidno.15：在bay39/40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子的核苷酸序列(ppt敏感型株系7)
seqidno.16：i-crei天然变体(单体)的氨基酸序列
seqidno.17：表达单链bay39/bay40大范围核酸酶的载体pcv170的核苷酸序列
seqidno.18：单链bay39/40大范围核酸酶的氨基酸序列
实施例
本文描述的所有重新设计的大范围核酸酶都是由precisionbiosciencesinc.,104t.w.alexanderdrive,researchtrianglepark,nc27713设计的。
实施例1：描述根据本发明的编码重新设计的大范围核酸酶的t-dna载体
使用常规重组dna技术，构建了编码成对的重新设计的大范围核酸酶单体的嵌合基因，所述单体作为异二聚体识别seqidno.1或2(hdbay39/40)的核苷酸序列，所述嵌合基因包含下列有效连接的dna片段：
●编码camv35s启动子的dna区域(seqidno6的自第1516位核苷酸至1933位核苷酸，例如seqidno4的自第1516位核苷酸至1997位核苷酸)
●包含bay39/40单体单元2编码区的dna区域，在n端与sv40nls有效连接(seqidno4的第2004至2525位核苷酸，包含终止密码子，或至2522位核苷酸，不包含终止密码子)
●来自胭脂碱合酶基因的参与3’末端转录终止和多聚腺苷酸化的dna区域(seqidno4的第2530至2783位核苷酸)
●编码camv35s启动子的dna区域(seqidno4的第4397至4814位核苷酸，如seqidno4的第4397至4878位核苷酸)
●包含bay39/40单体单元1的dna区域，在n端与sv40nls有效连接(seqidno4的第4885至5405位核苷酸，包含终止密码子，或至5403，不包含终止密码子)
●来自胭脂碱合酶基因的参与3’末端转录终止和多聚腺苷酸化的dna区域(seqidno4的第5411至5664位核苷酸)。
seqidno.4展示了获得的质粒的核苷酸序列。
使用常规重组dna技术，构建了编码识别seqidno.1或2(scbay39/40)的核苷酸序列的重新设计的单链大范围核酸酶的嵌合基因，包含下列有效连接的dna片段：
●编码camv35s启动子的dna区域(seqidno17的自第691位核苷酸至1223位核苷酸)
●拟南芥(arabidopsisthaliana)rbcsats1a基因的前导序列；seqidno17的自第1224位核苷酸至1266位核苷酸；krebbers等人，1988plantmolecularbiology11:745-759)
●编码单链bay39/40大范围核酸酶的n端区域的dna区域，在n端与sv40nls有效连接，经过优化用于在烟草中表达(seqidno17的第1267至1605位核苷酸)
●编码土豆光诱导型组织特异性st-ls1基因的第二内含子的dna区域(seqidno17的第1606至1794位核苷酸；x04753；eckes等人，1986mol.gen.genet.205,14-22)
●编码单链bay39/40大范围核酸酶c端区域的dna区域(seqidno17的第1795至1798位核苷酸，包含终止密码子，或至2541位核苷酸，不包含终止密码子)，包含编接头序列的dna区域(seqidno17的第1757至2070位核苷酸)，经过优化用于在烟草中表达。
●来自35s基因的参与3’末端转录终止和多聚腺苷酸化的dna区域(seqidno.17的第2545至2678位核苷酸)。
seqidno.17展示了获得的质粒的核苷酸序列。
实施例2：描述靶烟草株系和测定
为了研发用于双链dna断裂诱导的测定，选择了膦丝菌素(ppt)耐受性烟草转基因植物株系，该株系含有处于植物可表达的启动子控制下的bar编码区。
该转基因株系用作转化的起始材料，其中编码hdbay39/40大范围核酸酶的嵌合基因与植物可表达的嵌合基因一起稳定或瞬时的导入，所述嵌合基因包含产生潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶。
通过表达植物可表达的编码bay39/40异二聚体的嵌合基因，在bar编码区中的识别位点诱导双链dna断裂后，可以通过在缺少修复dna的条件下非同源末端连接修复断裂，导致一个或多个碱基对的缺失或插入，从而破坏bar编码区，获得膦丝菌素敏感性。
选择若干表现出膦丝菌素敏感性和潮霉素抗性的植物株系。从这些植物株系中，使用位于bar编码区识别位点(seqidno1或2)任一侧的引物，通过pcr扩增dna片段，并确定扩增子的核苷酸序列。图5展示了不同核苷酸序列的比对。
明显的，在ppt敏感型植物株系(3至9)中，通过缺失(3至8)或插入(9)改变了bay39/40的识别位点，而在ppt抗性植物株系(2)中未发现任何改变。
根据上述实验，可以得出结论，hdbay39/40在预选的位点表现出切割活性。
实施例3：通过非同源末端连接靶向插入
向包含在其基因组中整合了植物可表达的嵌合bar基因的植物细胞共递送pcv177(含有编码hdbay39/40大范围核酸酶的嵌合基因)或pcv170(包含编码scbay39/40的嵌合基因)与包含可选择的标志物的修复dna，所述标志物例如植物可表达的嵌合基因，其包含2mepsp编码区(与靶区域物其它同源性)，并选择耐受选择化合物(例如草甘膦)的膦丝菌素敏感型植物，所述共递送和选择允许鉴别在bar编码区整合了修复dna序列的植物细胞。
实施例4：通过同源末端连接靶向插入
向包含在其基因组中整合的植物可表达的嵌合bar基因的植物细胞共递送pcv177(含有编码hdbay39/40大范围核酸酶的嵌合基因)或pcv170(包含编码scbay39/40的嵌合基因)与包含可选择的标志物的修复dna，所述标志物例如这样的植物可表达的嵌合基因，其包含2mepsp编码区，编码区侧翼上游是包含与seqidno3的第1至第132位核苷酸的bar编码区具有序列相似性的核苷酸序列的侧翼序列，侧翼下游是包含与seqidno3的第154至第552位核苷酸的bar编码区具有序列相似性的核苷酸序列的侧翼序列，并选择耐受选择化合物(例如草甘膦)的膦丝菌素敏感型植物，所述共递送和选择允许鉴别在bar编码区整合了修复dna的植物细胞。
实施例5：在棉花中使用bay39/40单链和异二聚体大范围核酸酶导入靶向的双链dna断裂
在具有2g/l活性炭的m100底物(ms盐、b5维生素、mes0.5g/l、mgcl2.6h2o0.94g/l、脱乙酰吉兰糖胶2g/l、葡萄糖30g/l、ph5.8)上生长来自含有嵌合基因的ppt-抗性棉花植物的胚胎发生愈伤组织，所述嵌合基因包含处于csvmv启动子控制下的bar基因。这些愈伤组织经过微粒轰击，基本如sanford等人，1992所述的使用bioradpps_1000/hebiolisticparticle递送系统，使颗粒被编码异二聚体bay39/40大范围核酸酶的pcv177载体或编码单链bay39/40大范围核酸酶的pcv170载体包被。使用大范围核酸酶载体和含有处于植物可表达的启动子控制下的2mepsps基因的载体进行共递送，后者作为可选择的标志物基因赋予草甘膦耐受性。在轰击后，将愈伤组织移至含有1mm草甘膦的培养基上，获得约3000个草甘膦抗性的胚胎发生愈伤组织。其中，85个事件表现为ppt敏感型，进一步在分子上分析其中79个事件。使用在靶位点两侧的引物进行pcr，之后测序pcr产物，来表征这79个事件的基因型。缺少pcr产物表示在靶位点周围大的缺失(表1)。
表1：ppt-敏感型草甘膦-抗性转化事件的表征
因此，这些结果证实单链和异二聚体bay39/40大范围核酸酶能够在想要的位置诱导靶向的双链dna断裂，并且在棉花中使用这些大范围核酸酶可以获得靶向缺失、取代和插入事件。
序列表
<110>拜尔作物科学公司(bayerbiosciencen.v.)
<120>植物基因组改造中常用的在核苷酸序列上修饰植物基因组的方法和工具
<130>bcs10-2010
<160>16
<170>patentin版本3.3
<210>1
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<212>dna
<213>人工
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<223>bay39/40的识别位点
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<210>2
<211>22
<212>dna
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<223>bay39/40的识别位点的互补体
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<212>dna
<213>人工
<220>
<223>来自吸水链霉菌（s.hygroscopicus）的膦丝菌素乙酰转移酶基因(bar)的编码区
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<223>bay39-40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子(ppt耐受性植物株系)
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<223>bay39-40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子(ppt敏感性植物株系1)
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<223>bay39-40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子(ppt敏感性植物株系2)
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<223>bay39-40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子(ppt敏感性植物株系3)
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<223>bay39-40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子(ppt敏感性植物株系4)
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<223>bay39-40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子(ppt敏感性植物株系5)
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<220>
<223>bay39-40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子(ppt敏感性植物株系6)
<400>14
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<210>15
<211>68
<212>dna
<213>人工
<220>
<223>bay39-40识别位点周围的bar编码区的pcr扩增子(ppt敏感性植物株系7)
<400>15
cggtcaacttccgtaccgagccgcaggaaccgcaggagtggacggacgacctcgtccgtc60
tgcgggac68
<210>16
<211>163
<212>prt
<213>人工
<220>
<223>i-crei
<400>16
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151015
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202530
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serserpro
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