本发明涉及检测莲草直胸跳甲obp基因转录水平的引物及方法,属于生物技术领域。
背景技术:
莲草直胸跳甲属鞘翅目,叶甲科,是空心莲子草的主要生防天敌之一。georgevogt于1962年首次发现了莲草直胸跳甲对空心莲子草有很好的控制作用。其后,莲草直胸跳甲在美国、澳大利亚等地被广泛应用于空心莲子草的控制,并取得了较好的防治效果。我国于1986年从美国引进莲草直胸跳甲,并应用于空心莲子草的生物防治,在四川、浙江、福建、广西等地取得一定的成功。
昆虫经过长期的进化,演化出复杂、灵敏且具有选择性的化学感受机制。昆虫依靠化学感受来完成与外界化学信息的交流,通过识别这些信息来指导昆虫的取食、交配、雌性产卵以及躲避天敌等行为,昆虫对信息化合物的识别通常是通过昆虫的化学感器。
vogt等首次在多音天蚕蛾的雄虫触角中发现了气味结合蛋白,这个结合蛋白可以与雌蛾性信息素特异结合,被称为性信息素结合蛋白pbps。breer发现在其触角中也具备可以结合普通气味的蛋白分子,称为普通气味结合蛋白(generalodorantbindingprotein,gobp)。gobp不仅可以与环境中的气味分子结合,还可以运输这些分子穿过触角淋巴液到达气味受体。此后,在大量的昆虫中都鉴定到obps,有学者认为98%以上的昆虫种类的嗅觉感器中都存在obps。obps是一种相对分子质量比较低的蛋白质,一般在15~17kda之间,其等电点一般处于4.4~5.2之间,obps在氨基酸序列上都具有6个距离比较固定的半胱氨酸位点,这6个半胱氨酸形成3个相互交联的二硫键。成熟的obps长度都在120~150个氨基酸左右,很少有大的差别,这表明多肽链的长度可能对蛋白质的功能起到重要作用。
当前已知的昆虫obps多数是在触角嗅觉神经元周围表达,但也有研究发现部分obps的表达出现在别的部位,例如棉铃虫和烟夜蛾的obp10在其性腺表达;蜜蜂的obp21在下颚腺也有表达。
昆虫obps的作用机理可概括为以下几类:(1)在淋巴液中,obps充当溶剂和载体以溶解和转运气味分子;(2)obp可以依据其自身的结构特点,识别并结合气味分子;(3)obp将气味分子运输至气味受体附近,协助信号传导;(4)obp可能用于清理外围感器中多余或有害的化合物;(5)气味分子在激活受体以后,obp可快速使气味分子失去活性,避免让受体重复受到连续刺激;(6)obp在性腺和直肠腺的发现,推测其可能参与化学信息素的释放。
近年来的研究表明,obps类蛋白并不都与嗅觉感知相关,即存在部分obps与嗅觉的过程没有关系。例如在34个果蝇的obps当中,其中在化学感受器官中表达的有22个,但有5个在其他器官内表达,有的在味觉器官足和翅中表达。地中海实蝇mssp-α血清蛋白的氨基酸序列与昆虫的obps序列相似度很高,但是没有与气味分子结合的功能。与obps具有类似结构和特征的分子还有黄粉甲的血淋巴蛋白。最新的研究结果显示埃及伊蚊的obp45可能与其卵母细胞的成熟有关。
关于莲草直胸跳甲obp基因的表达等研究国内外未见报道,因此采用实时荧光定量pcr研究不同co2浓度处理下莲草直胸跳甲obp基因的转录水平,结果表明,随着co2浓度的升高,雌雄虫obp基因的表达量均升高,这与转录组表达量上调的变化趋势一致,说明co2浓度升高可以影响obp基因的表达调控。通过昆虫化学感受相关基因作为靶标,依据分子的结构设计配体型药物,从而研发新一代害虫行为干扰化合物,是未来在害虫防治研究领域的前进方向。
研究莲草直胸跳甲的化学感受基因可以加深对化学感受基因的认知,同时也为将来对其功能研究奠定科学基础。
技术实现要素:
本发明的目的是提供检测莲草直胸跳甲obp基因转录水平的引物及方法,为全面了解莲草直胸跳甲obp基因的转录水平而设计的不同处理co2浓度。
为实现上述目的,本发明所采用的技术方案如下:
将取食不同co2浓度培育的空心莲子草的莲草直胸跳甲雌雄虫各采9只到eppendorf管中,分为3个生物学重复,共12组样品。
设计一对检测莲草直胸跳甲obp基因转录水平的引物,包括符合荧光定量pcr反应特点的上下游引物:
obp-f:5`-gcgagcttaaagtgtacggttat-3`
obp-r:5`-gaatgcacgagtcatcagaagaa-3`
以及作为内参基因的上下游引物:
tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`
tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`
本发明所述检测莲草直胸跳甲obp基因转录水平的荧光定量pcr法,按如下步骤进行:
(1)cdna第一链合成:提取样本的总rna并纯化,采用反转录试剂盒得到以提取的rna为模板反转录得到的cdna;
(2)对下述引物进行常规pcr检测
该基因的荧光定量上下游引物:
obp-f:5`-gcgagcttaaagtgtacggttat-3`
obp-r:5`-gaatgcacgagtcatcagaagaa-3`
以及作为内参基因的上下游引物:
tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`
tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`
常规pcr扩增体系为25µl:10×buffer2.5µl,dntp1.0µl,上游引物0.5µl,下游引物0.5µl,100ng/µlcdna模板1.0µl,ex-taqe0.15µl,水19.35µl;
常规pcr反应程序如下:94℃预变性5min,然后94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,此条件下35个循环,最后72℃再延伸10min;
(3)实时荧光定量pcr反应:
以步骤(1)得到的cdna为模板,加入步骤(2)所述的引物,进行荧光定量pcr反应,每个样品设置3个重复,扩增后取平均值。
实时荧光定量pcr扩增体系为:sybr®premixextaqtm12.5µl,上游引物0.5µl,下游引物0.5µl,100ng/µlcdna1.0µl,补足水至25µl;
实时荧光定量pcr反应程序如下:95℃预变性30s,然后95℃变性5s、60℃退火30s,40个循环。
本发明更加详细的试验方法如下:
莲草直胸跳甲obp基因的实时荧光定量pcr检测方法可通过以下步骤实现:
(1)引物设计:根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲obp基因的序列,使用dnaman软件设计适合荧光定量pcr检测的特异性引物,引物序列如下:
obp-f:5`-gcgagcttaaagtgtacggttat-3`
obp-r:5`-gaatgcacgagtcatcagaagaa-3`
同时,根据转录组测序结果得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列,设计用于荧光定量pcr内对照物的引物,引物序列如下:
tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`
tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`
(2)莲草直胸跳甲处理试验:在对照co2浓度(420μl·l-1)和高co2浓度(750μl·l-1)的人工气候箱里培育空心莲子草,用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫,不同co2浓度的雌雄虫各采9只到eppendorf管中,分为3个生物学重复,共12组样品。虫样处理后迅速放入液氮中固定,于-80℃保存备用。
(3)cdna第一链合成:参照全式金公司的transzoltmupplusrnakit试剂盒说明书提取总rna,按照transscript公司的one-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒说明书,合成cdna第一链。
(4)实时荧光定量pcr反应:实时荧光定量pcr采用tobpara公司的sybr®premixextaqtm试剂盒进行。以上述合成的cdna第一链为模板,上述obp-f、obp-r和tubulin-f、tubulin-r为特异性引物,进行荧光定量pcr程序,每个样品设3个平行重复,扩增后取所得平行ct值的平均数。
实时荧光定量pcr扩增体系为:sybr®premixextaqtm12.5µl,上游引物0.5µl,下游引物0.5µl,100ng/µlcdna1.0µl,补足水至25µl;实时荧光定量pcr反应程序如下:95℃预变性30s,然后95℃变性5s、60℃退火30s,40个循环。
(5)莲草直胸跳甲obp基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为:相对mrna表达=2-δδct×100%,其中ct值=靶基因ct值-tubulinct值。
(6)图3和图4分别为莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同co2浓度培育的空心莲子草后obp基因的差异表达。结果表明,随着co2浓度的升高,雌雄虫obp基因的表达量均升高,并与转录组的表达量变化趋势一致,这为我们深入开展莲草直胸跳甲obp基因的研究提供了重要的基础数据。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明中的不同co2浓度处理措施,对昆虫绝大部分气味结合蛋白基因都适用,这对全面深入研究基因转录水平具有重要的意义。
(2)本发明所述高效快捷的荧光定量pcr法,包括荧光定量pcr程序等,实际用时50min,相对于现有技术大大缩短了反应时间,具有高效快捷的特性。
(3)本发明所述的荧光定量pcr法,提供常规pcr电泳结果图,可以直观快捷的反映出引物的特异性。
附图说明
附图为莲草直胸跳甲雌雄虫obp基因转录水平的荧光定量pcr检测结果。
图1:莲草直胸跳甲obp基因荧光定量引物常规pcr产物电泳结果:产物长度为148bp,marker条带从上到下依次为:2000、1000、750、500、250、100bp。
图2:莲草直胸跳甲tubulin基因荧光定量引物常规pcr产物电泳结果:产物长度为199bp,marker条带从上到下依次为:2000、1000、750、500、250、100bp。
图3:莲草直胸跳甲雌虫(f)取食不同co2浓度培育的空心莲子草后obp基因的差异表达,柱形和左边坐标轴为荧光定量的表达量,散点和右边坐标轴为转录组的表达量。
图4:莲草直胸跳甲雄虫(m)取食不同co2浓度培育的空心莲子草后obp基因的差异表达,柱形和左边坐标轴为荧光定量的表达量,散点和右边坐标轴为转录组的表达量。
具体实施方式
以下结合具体实施例及附图说明本发明,这里所述实施例的方案,不限制发明,其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
实施例1
试验材料的处理
在对照co2浓度(420μl·l-1)和高co2浓度(750μl·l-1)的人工气候箱里培育空心莲子草,用于饲养莲草直胸跳甲雌雄虫,不同co2浓度的雌雄虫各采9只到eppendorf管中,分为3个生物学重复,共12组样品。虫样收集后迅速放入液氮中固定,于-80℃保存备用。
实施例2
引物的设计
(1)引物设计:根据转录组测序得到的莲草直胸跳甲obp基因的序列,使用dnaman软件设计适合荧光定量pcr检测的特异性引物,引物序列如下:
obp-f:5`-gcgagcttaaagtgtacggttat-3`
obp-r:5`-gaatgcacgagtcatcagaagaa-3`
莲草直胸跳甲obp基因荧光定量pcr产物长度为148bp,琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致,且为单一条带,说明所设计的引物具有很强的特异性,适合用于实时荧光定量pcr检测,琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
(2)同时,根据转录组测序得到的莲草直胸跳甲tubulin基因的序列,设计用于荧光定量pcr内对照物的引物,引物序列如下:
tubulin-f:5`-agatgtccgccaccttca-3`
tubulin-r:5`-gcctcttggtattgttggtattca-3`
莲草直胸跳甲tubulin基因荧光定量pcr产物长度为199bp,琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致,且为单一条带,说明所设计的引物具有很强的特异性,适合用于实时荧光定量pcr检测,琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。
实施例3
总rna的提取
参照全式金公司的transzoltmupplusrnakit试剂盒说明书提取总rna,用液氮将虫体研磨成粉,加入1mltranszoltmup,转到1.5ml转离心管中,室温静置5min后,加入200μl氯仿/1mltranszoltmup,剧烈振荡30s,室温孵育3min。4℃10000g离心15min后,移上层水相(一般<80%)于新的离心管中,加入1/3体积的无水乙醇,轻轻颠倒混匀。将rna离心柱套于2ml收集管中,将上步混合物全部转入离心柱中,12000g,30~60s离心,弃流动相,重复使用收集管。加入500μlcb9,室温12000g离心30s,弃流动相,再加入500μlcb9,室温12000g离心30s,弃流动相。加入稀释的500μlwb9,12000g离心30s,弃流动相,再加入稀释的500μlwb9,12000g离心30s,弃流动相。12000g离心2min,彻底去除残留的乙醇,在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。将离心柱放入rnase-freetube中,加50μlrnase-freewater在离心柱的中央,室温静置1min,12000g离心1min,洗脱rna。所得的rna置于-80℃备用。
实施例4
cdna第一链合成:按照transscript公司的one-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒说明书步骤,以实施例3中的rna为模板,反转录生成cdna第一链,具体步骤如下:
(1)反转录体系
(2)42℃温育30min。
(3)85℃加热5min,产物可放在-20℃、-80℃保存。
实施例5
进行荧光定量pcr反应。实时荧光定量pcr采用tobpara公司的sybr®premixextaqtm试剂盒进行。以实施例4中的cdna为模板,用实施例2中的引物进行实时荧光定量pcr扩增反应,每个样品设3个平行重复,扩增后取所得平行ct值的平均数。
(1)实时荧光定量pcr扩增体系如下:sybr®premixextaqtm12.5µl,上游引物0.5µl,下游引物0.5µl,100ng/µlcdna1.0µl,补足水至25µl;
(2)实时荧光定量pcr反应程序如下:95℃预变性30s,然后95℃变性5s、60℃退火30s,40个循环。
(3)实时荧光定量pcr完成后,根据ct值计算不同处理条件下相对表达量的比值2-δδct。莲草直胸跳甲obp基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为:相对mrna表达=2-δδct×100%,其中ct值=靶基因ct值-tubulinct值。
表1:莲草直胸跳甲雌虫(f)取食不同co2浓度培育的空心莲子草后obp基因的c(t)值、平均值、标准偏差、荧光定量表达量及转录组的表达量
表2:莲草直胸跳甲雄虫(m)取食不同co2浓度培育的空心莲子草后obp基因的c(t)值、平均值、标准偏差、荧光定量表达量及转录组的表达量
(4)图3和图4分别为莲草直胸跳甲雌雄虫取食不同co2浓度培育的空心莲子草后obp基因的差异表达。结果表明,随着co2浓度的升高,雌雄虫obp基因的表达量均升高,与转录组的表达量上调的变化趋势一致。这为我们深入开展莲草直胸跳甲obp基因的研究提供了重要的基础数据。
sequencelisting
<110>福建省农业科学院植物保护研究所
<120>检测莲草直胸跳甲obp基因转录水平的引物及方法
<130>4
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<170>patentinversion3.3
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<212>dna
<213>人工序列
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gcgagcttaaagtgtacggttat23
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