一种区域选择性修饰壳聚糖的方法与流程

本发明涉及一种修饰壳聚糖的方法，尤其涉及一种区域选择性修饰壳聚糖的方法。

背景技术：

壳聚糖是一种具有手性、无毒性、生物相容性、抗菌性等优良性质的可降解循环再生材料，在生物医学、农业、食品保鲜等多种领域具有广阔的应用前景。然而，壳聚糖不溶于任何有机溶剂，只溶于水的弱酸性溶液的性质，极大地阻碍了壳聚糖的商业开发。研究表明，壳聚糖具有三个反应活性不同的官能团，分别为糖单元3,6-位的羟基和2-位的氨基，这使得壳聚糖可以通过区域选择性修饰方法来提高溶解性，制备出其结构与功能则会更为多样化的衍生物，从而扩大其应用范围。

1991年，nishimura等先采用邻苯二甲酸酐在n,n-二甲基甲酰胺溶剂体系中对壳聚糖2-位进行修饰，再在以吡啶为溶剂的条件下于壳聚糖6-位引入三苯基甲基作为保护基团，进一步地，采用酸酐与壳聚糖3-位羟基进行反应，合成了2，3，6-位上拥有不同种侧基的壳聚糖类衍生物。2015年，柏正武等人报道了壳聚糖-二(苯基氨基甲酸酯)-(酰胺)类衍生物的制备方法，该方法利用壳聚糖与过量的酸酐反应得到n-酰化壳聚糖，再将n-酰化壳聚糖溶解在含有氯化锂的n,n-二甲基乙酰胺溶液中，与过量的苯基异氰酸酯反应，得到目标产物。该类衍生物，利用羟基与氨基反应活性的差异，在壳聚糖2-位与3,6-位先后引入了不同类基团。2016年，张丽丽等人制备了2-位氨基先被邻苯二甲酰亚胺保护，3,6-位羟基被4种苯基异氰酸酯分别修饰的壳聚糖衍生物。2017年，陈伟等人先用苯甲酸酐对氨基进行修饰得到n-苯甲酰壳聚糖，再将其分别与3,5-二甲基苯基异氰酸酯和4-甲基苯基异氰酸酯反应，制备了两种新型壳聚糖衍生物。上述制备的壳聚糖衍生物均是先修饰氨基再反应3,6-位羟基制得的，结构较为多样化。但是此类壳聚糖衍生物的衍生化试剂只能与壳聚糖的氨基反应，而与羟基不发生化学反应，因此，此类衍生化试剂选择种类较少，从而也部分限制壳聚糖的结构。

2017年，张丽丽等人专利报道了壳聚糖-2-苯基脲-3-苯基氨基甲酸酯-6-羟基类衍生物的制备方法，该方法先采用三苯基氯甲烷对壳聚糖6-位进行保护，再与具有不同侧基的苯基异氰酸酯反应，最后脱保护得到目标衍生物。其中，6-位羟基可进一步修饰，用于制备结构功能更为多样化的壳聚糖衍生物。本专利将采用对2-位氨基的保护和脱保护的方法加强对壳聚糖氨基的有效利用，制备出结构功能更为多样化的壳聚糖衍生物。

技术实现要素：

本发明的目的是为了使壳聚糖衍生物结构更加多样化，为后期研究壳聚糖的活性、位置和其衍生物的性能与结构的构效关系而提供一种区域选择性修饰壳聚糖的方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种区域选择性修饰壳聚糖的方法，先采用4-甲基邻苯二甲酸酐对壳聚糖2-位氨基进行保护，之后壳聚糖3,6-位的氨基进行甲酸酯化反应，之后对壳聚糖2-位氨基进行脱保护，最后对壳聚糖2-位氨基进行酰基化，得到壳聚糖-二(苯基氨基甲酸酯)-(苯基脲)，其结构式为：

其中，r¹、r²为苯环上的取代基且不相同，所述取代基为1-5个，当取代基的个数大于1时，各取代基相同或者不相同，所述取代基为卤素原子、烷基、烷氧基、硝基、氨基或烷硫基。

本发明还包括这样一些特征：

1.所述先采用4-甲基邻苯二甲酸酐对壳聚糖2-位氨基进行保护具体包括：将完全脱乙酰化的壳聚糖溶于氯化锂的溶剂中，加入4-甲基邻苯二甲酸酐，在反应温度为100-140℃下回流8-12h，其中壳聚糖与4-甲基邻苯二甲酸酐的摩尔数之比为1：1-3，得到壳聚糖-2-n-(4-甲基邻苯二甲酰亚胺)；

2.所述壳聚糖3,6-位的氨基进行甲酸酯化反应具体为：将壳聚糖-2-n-(4-甲基邻苯二甲酰亚胺)溶于氯化锂的溶剂中，加入带有侧基的苯基异氰酸酯，在反应温度为50-150℃下反应12-36h，其中苯基异氰酸酯和3,6-位羟基的总摩尔数之比为1.5-3：1，得到壳聚糖-2-n-(4-甲基邻苯二甲酰亚胺)-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)；

3.所述对壳聚糖2-位氨基进行脱保护具体为：将壳聚糖-2-n-(4-甲基邻苯二甲酰亚胺)-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)溶于水合肼中，在反应温度为80-120℃下反应9-24h，得到壳聚糖-2-氨基-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)；

4.所述对壳聚糖2-位氨基进行酰基化具体为：将壳聚糖-2-氨基-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)溶于氯化锂的溶剂中，加入带有侧基的苯基异氰酸酯，在反应温度为50-150℃下反应12-36h，其中苯基异氰酸酯和2-位氨基的摩尔数之比为1.5-3：1，得到壳聚糖-2-苯基脲-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)，即壳聚糖-二(苯基氨基甲酸酯)-(苯基脲)；

5.所述带有侧基的苯基异氰酸酯为结构式为：

6.所述带有侧基的苯基异氰酸酯为结构式为：

7.所述溶剂为二甲基亚砜、吡啶或n,n-二甲基甲酰胺；

8.所述氯化锂的浓度为0.075-0.100g/ml；

9.所述反应在氮气的保护下进行。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明提供了一种通过对壳聚糖2-位氨基的保护与脱保护方法，在壳聚糖2-位和3,6-位上可控引入两种不同取代基的方法；

2.本发明提供的新型壳聚糖衍生物由于3,6-位与2-位引入了不同结构的基团，可用于壳聚糖衍生物构效关系的研究；

3.本发明提供的区域选择性修饰壳聚糖的方法可以对壳聚糖氨基进行有效利用，提高壳聚糖的可设计性，从而获得结构更多样的壳聚糖衍生物，进而拓展壳聚糖的应用范围。

附图说明

图1是本发明实施例步骤(1)所制备的壳聚糖-2-n-(4-甲基邻苯二甲酰亚胺)的¹h-nmr谱图；

图2是本发明实施例步骤(2)所制备的壳聚糖-2-n-(4-甲基邻苯二甲酰亚胺)-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)的¹h-nmr谱图；

图3是本发明实施例步骤(3)所制备的壳聚糖-2-氨基-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)的¹h-nmr谱图；

图4是本发明实施例步骤(4)所制备的壳聚糖-2-(3,5-二甲基苯基脲)-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)的¹h-nmr谱图；

图5是本发明所涉及的反应方程式；

图6是本发明的取代基r¹、r²的示例。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。

本发明提供了一种先后修饰壳聚糖3,6-位羟基与2-位氨基的方法，并用此方法制得了壳聚糖-二(苯基氨基甲酸酯)-(苯基脲)类衍生物。此方法不仅为合成含有两种不同侧基的壳聚糖衍生物提供了新途径，同时也使壳聚糖衍生物结构更加多样化，为后期研究壳聚糖的活性、位置和其衍生物的性能与结构的构效关系提供了一种有效的途径，将该类衍生物制备成手性固定相更是具有较好的应用前景。

本发明的壳聚糖-二(苯基氨基甲酸酯)-(苯基脲)有如下结构：

其中r1、r2为卤素原子、烷基、烷氧基、硝基、氨基和烷硫基中的一种或多种，占据苯基2-6位中的一个或多个

本发明的壳聚糖-二(苯基氨基甲酸酯)-(苯基脲)的制备方法为：

步骤(1)：2-位氨基的保护：将完全脱乙酰化的壳聚糖溶于氯化锂的溶剂中，加入过量的4-甲基邻苯二甲酸酐，于100-140℃下回流8-12h，其中壳聚糖与4-甲基邻苯二甲酸酐的摩尔数比为1：1-3，制得壳聚糖-2-(4-甲基邻苯二甲酰亚胺)。

步骤(2)：壳聚糖3,6-位的氨基甲酸酯化：将步骤(1)得到的壳聚糖-2-(4-甲基邻苯二甲酰亚胺)溶于氯化锂的溶剂中，加入过量的含有不同取代基的苯基异氰酸酯，于50-150℃反应12-36h，其中苯基异氰酸酯和3,6-位羟基的总摩尔数之比为1.5-3：1，制得壳聚糖-2-(4-甲基邻苯二甲酰亚胺)-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)。

步骤(3)：2-位氨基的脱保护：将步骤(2)得到的壳聚糖-2-(4-甲基邻苯二甲酰亚胺)-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)溶于水合肼(nh2-nh2/h2o)中，于80-120℃下反应9-24h，制得壳聚糖-2-氨基-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)。

步骤(4)：2-位氨基的酰基化：将步骤(3)得到的壳聚糖-2-氨基-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)溶于氯化锂的溶剂中，加入过量的不同于步骤(2)中的含有不同取代基的苯基异氰酸酯，于50-150℃反应12-36h，其中苯基异氰酸酯和2-位氨基的摩尔数之比为1.5-3：1,制得壳聚糖-2-苯基脲-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)，即壳聚糖-二(苯基氨基甲酸酯)-(苯基脲)。

上述步骤中，壳聚糖经过完全脱乙酰化,分子量在50000-300000；反应均在氮气保护下进行；氯化锂的浓度为0.075-0.100g/ml。

步骤(1)(2)、(4)中所述的溶剂为n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基亚砜(dmso)和吡啶中的一种，与壳聚糖或壳聚糖衍生物配置成质量浓度为0.013-0.025/ml的溶液。

步骤(2)、(4)中所述的含有不同取代基的苯基异氰酸酯结构式分别为：

其中r¹、r²为卤素原子、烷基、烷氧基、硝基、氨基和烷硫基中的一种或多种，占据苯基2-6位中的一个或多个。

本发明所使用的壳聚糖脱乙酰度大于99％，壳聚糖及其衍生物、氯化锂在使用前于60℃下真空干燥12h。

壳聚糖-2-(3,5-二甲基苯基脲)-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)衍生物的制备：

(1)2-位氨基的保护：氮气氛围中,0.4g壳聚糖在12ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，于80℃溶胀24h；加入0.8g氯化锂于室温下搅拌4h；加入1.20g4-甲基邻苯二甲酸酐于120℃回流12h；反应结束，采用胶头滴管将溶液滴入200ml蒸馏水中，析出壳聚糖衍生物沉淀；用甲醇洗涤沉淀，最后于60℃真空干燥48h，制得壳聚糖-2-(4-甲基邻苯二甲酰亚胺)衍生物。

¹h-nmr谱图如附图1所示：¹h-nmr(500mhz,80℃,dmso-d6,δ/ppm)：3.19-5.32(m,9h,glucose-h、-oh)，7.26(s,3h,phenyl-h)，2.45(s,3h,-ch3)。从核磁图中ppm＝7.26处出现苯基峰，ppm＝2.45处出现的甲基峰可以说明壳聚糖2-位被4-甲基邻苯二甲酸酐修饰并保护。

(2)壳聚糖3,6-位的氨基甲酸酯化：氮气氛围中，0.6g步骤(1)制得的壳聚糖衍生物，在20ml无水吡啶中，于80℃溶胀24h；加入1.2g氯化锂于室温下搅拌4h；加入0.94ml苯基异氰酸酯于80℃反应12h；反应结束，用甲醇析出壳聚糖衍生物沉淀，洗涤后于60℃真空干燥48h，制得壳聚糖-2-(4-甲基邻苯二甲酰亚胺)-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)衍生物。

¹h-nmr谱图如附图2所示：¹h-nmr(500mhz,80℃,dmso-d6,δ/ppm)：9.06(s,1h,carbamate-h)，8.74(s,1h,carbamate-h)，6.30-7.67(m,13h,phenyl-h)；3.31-5.92(m,7h,glucose-h)，2.09-1.88(m,3h,-ch3)。

(3)2-位氨基的脱保护：氮气氛围中，0.45g步骤(2)制得的壳聚糖衍生物，在9ml水合肼(nh2-nh2/h2o,1/2,v/v)中，于100℃反应18h；反应结束，用200ml蒸馏水析出壳聚糖衍生物沉淀，甲醇洗涤后于60℃真空干燥48h，制得壳聚糖-2-氨基-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)衍生物。

¹h-nmr谱图如附图3所示：¹h-nmr(500mhz,80℃,dmso-d6,δ/ppm)：9.35(s,1h,carbamate-h)，9.00(s,1h,carbamate-h)，6.74-7.61(m,10h,phenyl-h)，3.35-5.66(m,9h,glucose-h、-nh2)。

(4)2-位氨基的脲基化：氮气氛围中，0.4g步骤(3)制得的壳聚糖衍生物，在16ml二甲基亚砜中，于80℃溶胀24h；加入0.8g氯化锂于室温下搅拌4h；加入0.37ml3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯于80℃下反应12h；反应结束，用甲醇析出壳聚糖衍生物沉淀，洗涤后于60℃真空干燥48h，制得壳聚糖-2-(3,5-二甲基苯基脲)-3,6-二(苯基氨基甲酸酯)衍生物。

¹h-nmr谱图如附图4所示：¹h-nmr(500mhz,80℃,dmso-d6,δ/ppm)：9.07(s,1h,carbamate-h)，8.83(s,1h,carbamate-h)，7.99(s,1h,phenyl-nh)；6.25-7.73(m,13h,phenyl-h)，5.93(s,1h,glucose-nh)，3.22-5.14(m,7h,glucose-h)；2.13(s,6h,-ch3)。

综上所述：本发明涉及一种在壳聚糖3,6-位和2-位先后引入不同基团的区域选择性取代方法及壳聚糖-二(苯基氨基甲酸酯)-(苯基脲)衍生物的制备。壳聚糖氨基被4-甲基邻苯二甲酸酐保护，然后与苯环上含有不同取代基的苯基异氰酸酯反应，脱保护后再与苯环上含有不同取代基的苯基异氰酸酯反应，两次反应采用不同异氰酸酯，得到壳聚糖-二(苯基氨基甲酸酯)-(苯基脲)衍生物。此方法有利于壳聚糖氨基的充分利用，有益于壳聚糖类特定功能材料的开发及构效关系的研究。