本发明涉及农作物秸秆转化利用技术领域，尤其涉及一种利用微生物菌剂降解农作物秸秆中木质纤维的方法。
背景技术：
农作物秸秆是仅次于煤、石油、天然气的世界第四大能源，是一种非常重要的可再生生物质资源。我国是一个农业大国，有着极其丰富的农作物秸秆资源，每年全世界秸秆产量有30亿吨之多，而我国农作物秸秆年产量已超过9亿吨。我国每年产生的秸秆大部分被就地焚烧或者用作生活燃料，不仅污染环境，而且浪费资源，秸秆并没有得到有效的利用。此外，焚烧产生的高温还会杀灭土壤中的微生物，不利于土壤微生物的生存，还会造成土壤板结，肥力下降等。与其它转化技术相比，利用沼气发酵技术处理利用秸秆，不仅可以产生高效、清洁的高品位能源，同时产生的沼渣和沼液还可以直接用作有机肥料，不失为一种行之有效的出路。沼气发酵技术本身是一种非常成熟的技术，利用该技术转化秸秆为新型能源，可以缓解我国常规能源紧张状况、提高农村人民的生活质量；另一方面，又可解决作物秸秆的出路问题，减少因其露天焚烧、乱堆乱置等带来的对环境不利影响。实际上，我国已经明确将秸秆沼气作为一项主要的可再生能源进行重点支持发展。
众所周知，秸秆复杂的木质纤维结构是阻碍其生物降解的重要因素，因此在进行沼气发酵之前，通常需要对秸秆进行预处理。常用的预处理方法包括物理预处理、化学预处理和生物预处理，从目前的应用来看，主要采用物理预处理+化学预处理相结合的方法，即切碎/粉碎+酸/碱预处理。然而，目前采用的酸碱预处理方法主要为强酸或强碱预处理，例如盐酸、硫酸、氢氧化钠、氢氧化钾，这种预处理方法普遍存在设备腐蚀问题，且需要大量的水对预处理后的原料进行清洗或需要大量的酸碱进行中和。当用水进行清洗时，会损失溶解性有机质，当用酸碱中和时，又会产生大量的钠离子和氯离子，不仅可能抑制厌氧发酵，还可能造成环境污染，而且会影响沼渣的后续利用。而生物预处理方法对于纤维素、半纤维素、木质素的降解并未达到良好的技术效果。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用微生物菌剂降解农作物秸秆中木质纤维的方法，该方法对于降解纤维素、半纤维素和木质素具有很高的效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利用微生物菌剂降解农作物秸秆中木质纤维的方法，包括以下步骤：
1)将农作物秸秆、乳酸菌菌液和水混合得到第一原料，所述第一原料的总固体质量百分含量为3％～12％；
2)对步骤1)所述第一原料进行第一微曝气水解处理，固液分离，收集固体得到一级降解产物；
3)将所述步骤2)中的一级降解产物、复合菌菌液和水混合得到第二原料，所述第二原料的总固体质量百分含量为3％～12％；
4)对所述步骤3)中的第二原料进行第二微曝气水解处理，得到二级降解产物；
所述乳酸菌菌液占第一原料的体积百分数为5％～20％；
所述复合菌菌液占第二原料的体积百分数为5％～20％；
所述复合菌菌液包括黑曲霉菌液、木霉菌液、草酸青霉菌液和黄孢原毛平革菌菌液。
优选的，所述农作物秸秆的长度为2～3cm。
优选的，所述乳酸菌为植物乳杆菌；所述植物乳杆菌的菌株保藏编号为cicc22703。
优选的，所述乳酸菌的浓度为1×107～9×109cfu/ml。
优选的，所述黑曲霉的菌株保藏编号为acccno.30171、木霉的菌株保藏编号为acccno.31490、草酸青霉的菌株保藏编号为acccno.32576、黄孢原毛平革菌的菌株保藏编号为ciccno.40299。
优选的，所述复合菌菌液的浓度为4×109～3.6×1010cfu/ml。
优选的，所述复合菌菌液中黑曲霉、木霉、草酸青霉和黄孢原毛平革菌的活菌数比例为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)。
优选的，所述第一微曝气水解处理的时间为3～8d；所述第一微曝气水解处理的温度为20～40℃。
优选的，所述第一微曝气水解处理的曝气溶氧量为0.2～1mg/l；所述第一微曝气水解处理过程伴随搅拌，所述搅拌的转速为20～100rpm。
优选的，所述第二微曝气水解处理的时间为3～8d；所述第二微曝气水解处理的温度为22～28℃；所述第二微曝气水解处理的曝气溶氧量为0.2～1mg/l；所述第二微曝气水解处理过程伴随搅拌，所述搅拌的转速为20～100rpm
本发明的有益技术效果：本发明提供了一种利用微生物菌剂降解农作物秸秆中木质纤维的方法，该方法采用了两次微生物水解处理的过程，其中第一微曝气水解处理采用乳酸菌菌液，第二微曝气水解处理采用包括包括黑曲霉菌液、木霉菌液、草酸青霉菌液和黄孢原毛平革菌菌液在内的复合菌液；经过上述水解处理，可在10天之内有效破坏木质纤维素结构，并可以将纤维素和半纤维素分解成沼气发酵可以直接利用的小分子物质，大大加快整体的产气速率。并且，本发明利用的是好氧微生物复合体系，在微曝气条件下，可显著提高秸秆中木质纤维素的降解效率，在加速秸秆底物分解的同时，还能增加了体系中脂肪酸产量、减少有毒气体h2s、nh3的生成。
具体实施方式
本发明提供了一种利用微生物菌剂降解农作物秸秆中木质纤维的方法，包括以下步骤：
1)将农作物秸秆、乳酸菌菌液和水混合得到第一原料，所述第一原料的总固体质量百分含量为3％～12％；
2)对步骤1)所述第一原料进行第一微曝气水解处理，固液分离，收集固体得到一级降解产物；
3)将所述步骤2)中的一级降解产物、复合菌菌液和水混合得到第二原料，所述第二原料的总固体质量百分含量为3％～12％；
4)对所述步骤3)中的第二原料进行第二微曝气水解处理，得到二级降解产物。
在本发明中，将农作物秸秆、乳酸菌菌液和水混合得到第一原料，所述第一原料的总固体质量百分含量为3％～12％，优选为5％～10％，更优选为8％；所述农作物秸秆优选为青贮玉米秸秆；所述青贮玉米秸秆来源于市售；所述农作物秸秆的长度为2～3cm，优选为2.5cm；本发明中，所述混合的温度优选为16～25℃，更优选为20℃；本发明对混合的时间、方式及设备等没有特殊限制，以混合均匀为准。
本发明中，所述乳酸菌菌液占第一原料的体积百分数为5％～20％，优选为10％～15％，更优选为12％；所述乳酸菌的浓度为1×107～9×109cfu/ml，优选为1×108～1×109cfu/ml；所述所述乳酸菌优选为植物乳杆菌。
在本发明中，所述乳酸菌的作用是水解木质纤维素。
在本发明中，所述植物乳杆菌菌液的制备方法包括以下步骤：
a)将植物乳杆菌接种于固体沙氏琼脂培养基(sda)上，进行静置培养；
b)将所述步骤a)中经过静置培养的植物乳杆菌接种于液体种子培养基，进行种子培养，获得种子培养液；
c)将所述步骤b)中的种子培养液接种于液体发酵培养基中，进行发酵培养，获得植物乳杆菌菌液。
本发明中，将植物乳杆菌接种于沙氏琼脂培养基(sda)上，进行静置培养；所述静置培养的方式优选为斜面培养；本发明对所述植物乳杆菌的接种量没有特殊限制；所述静置培养的温度优选为22～37℃，更优选为25～35℃，最优选为30℃；所述静置培养的时间优选为40～90h，更优选为50～80h，最优选为60～70h。
本发明中，将经过静置培养的植物乳杆菌接种于种子培养基，进行振荡培养，获得种子培养液；本发明对接种量没有特殊限制；所述接种过程在无菌条件下进行；所述种子培养基优选为液体沙氏培养基；所述液体沙氏培养基的配方为：以1l计，蛋白胨10g/l、葡萄糖40g/l和余量的水；所述振荡培养的温度优选为22～37℃，更优选为25～35℃，最优选为30℃；所述振荡培养的转速优选为150～200rpm，更优选为180rpm；所述振荡培养的时间优选为24～48h，更优选为36h。
本发明中，将种子培养液接种于发酵培养基中，进行发酵培养，获得植物乳杆菌菌液；所述种子培养液的接种体积百分数优选为3％～10％，更优选为5％～8％，最优选为6％～7％；所发酵培养基的配方为：以1l计，葡萄糖10g/l、麸皮20g/l、蛋白胨0.5g/l、(nh4)2so41.4g/l、kh2po42g/l、cacl20.3g/l、feso40.005g/l、mnso40.0016g/l、znso40.0014g/l、cocl20.002g/l和余量的水；所述发酵培养的温度优选为22～37℃，更优选为25～35℃，最优选为30℃；所述发酵培养的培养的时间优选为24～48h，更优选为36h。
在本发明的具体实施过程中，所述植物乳杆菌(lactobacillus)购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；所述植物乳杆菌的菌株保藏编号为cicc22703；所述植物乳杆菌cicc22703为好氧菌。
本发明在得到第一原料后，对第一原料进行第一微曝气水解处理，固液分离得到一级降解产物；所述第一微曝气水解处理的时间为3～8d，优选为4～7d，更优选为5～6d；所述第一微曝气水解处理的温度为20～40℃，优选为25～38℃，更优选为35℃；所述第一微曝气水解处理的曝气溶氧量为0.2～1mg/l，优选为0.3～0.8mg/l，更优选为0.5mg/l；所述第一微曝气水解处理过程伴随搅拌，所述搅拌的转速为20～100rpm；优选为40～80rpm，更优选为60rpm。
本发明在进行第一微曝气水解处理后，将固体物质捞出后，对固体物质进行沥水处理，得到一级降解产物；本发明对一级降解产物的含水量没有特殊限制。
本发明在得到一级降解产物后，将一级降解产物、复合菌菌液和水混合得到第二原料，所述第二原料的总固体质量百分含量为3％～12％，优选为5％～10％，更优选为8％。
本发明中，所述复合菌菌液占第二原料的体积百分数为5％～20％，优选为10％～15％，更优选为12％；所述复合菌菌液的浓度为4×109～3.6×1010cfu/ml，优选为8×109～1×1010cfu/ml；所述复合菌菌液包括黑曲霉菌液、木霉菌液、草酸青霉菌液和黄孢原毛平革菌菌液；所述复合菌菌液中黑曲霉菌液、木霉菌液、草酸青霉菌液和黄孢原毛平革菌菌液的活菌数比例为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)，优选为1:1:1:1。
在本发明的具体实施过程中，所述黑曲霉(aspergillus)购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心；所述黑曲霉的菌株保藏编号为acccno.30171；所述黑曲霉acccno.30171为好氧真菌，具有较强的纤维素分解能力。
在本发明的具体实施过程中，所述木霉(trichoderma)购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心；所述木霉的菌株保藏编号为acccno.31490；所述木霉acccno.31490为好氧真菌，产纤维素酶。
在本发明的具体实施过程中，所述草酸青霉(penicllium)购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心；所述草酸青霉的菌株保藏编号为acccno.32576；所述草酸青霉acccno.32576为好氧真菌，可分解秸秆中的纤维素物质和用于纤维素酶的工业化生产。
在本发明的具体实施过程中，所述黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心；所述黄孢原毛平革菌的菌株保藏编号为ciccno.40299；所述黄孢原毛平革菌ciccno.40299为好氧真菌，可分解利用秸秆中的木质素成分。
在本发明中，所述黑曲霉、木霉和草酸青霉都可分泌纤维素酶，这是一种复合酶，由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，这3种酶共同作用把纤维素降解成葡萄糖；黑曲霉、木霉和草酸青霉降解半纤维素的酶主要也有3种酶：内切酶、外切酶和糖苷酶，这3种酶把半纤维素降解为单糖和糖醛酸；白腐真菌是目前发现能同时分解植物聚合物的少数微生物之一，因能产生分解木质素的过氧化物酶，所以它能分解秸秆中的纤维素和木质素，且降解木质素的能力优于降解纤维素的能力。本申请利用黑曲霉、木霉、草酸青霉和白腐真菌的发酵底物功能的互补性，共同发挥降解木质素、纤维素和半纤维素的作用。
在本发明中，所述复合菌液的制备方法包括以下步骤：
a)将黑曲霉、木霉、草酸青霉和黄孢原毛平革菌分别接种于沙氏琼脂培养基(sda)上，进行静置培养；
b)将所述步骤a)中经过静置培养的黑曲霉、木霉、草酸青霉和黄孢原毛平革菌分别接种于液体种子培养基中，进行振荡培养，得到四种种子培养液；
c)将所述步骤b)中的四种种子培养液分别接种于发酵培养基中，进行发酵培养，获得四种菌液；
d)将所述步骤c)中的四种菌液分别稀释至1～9×109cfu/ml浓度后，进行混合，得到复合菌液。
本发明中，将黑曲霉、木霉、草酸青霉和黄孢原毛平革菌分别接种于沙氏琼脂培养基(sda)上，进行静置培养；所述静置培养的方式优选为斜面培养；本发明对所述黑曲霉、木霉、草酸青霉和黄孢原毛平革菌的接种量没有特殊限制；所述静置培养的温度优选为22～28℃，更优选为24～26℃，最优选为25℃；所述静置培养的时间优选为40～90h，更优选为50～80h，最优选为60～70h。
本发明将经过静置培养的黑曲霉、木霉、草酸青霉和黄孢原毛平革菌分别接种于液体种子培养基中，进行振荡培养，得到种子培养液；本发明对接种量没有特殊限制；所述接种过程在无菌条件下进行；所述振荡培养的温度优选为22～28℃，更优选为24～26℃，最优选为25℃；所述振荡培养的转速优选为150～200rpm，更优选为180rpm；所述振荡培养的时间优选为36～72h，更优选为48h；所述种子培养基的为固体沙氏培养基；所述固体沙氏培养基的配方为：以1l计，蛋白胨10g、琼脂20g、葡萄糖40g和余量的水。
本发明在得到四种种子发酵液后，将四种种子培养液分别接种于发酵培养基中，进行发酵培养，获得四种菌液；所述四种种子发酵液的接种体积百分数优选为3％～10％，更优选为5％～8％，最优选为6％～7％；所述发酵培养的温度优选为22～28℃，更优选为24～26℃，最优选为25℃；所述发酵培养的时间优选为24～72h，更优选为36～48h；所述发酵培养基的配方为：以1l计，葡萄糖10g/l、麸皮浸出液20g/l、硫酸铵1.4g/l、磷酸氢二钾2g/l、氯化钙0.3g/l、蛋白胨0.5g/l和余量的水。
本发明在获得四种菌液后，将所述四种菌液分别稀释至1～9×109cfu/ml浓度后，进行混合，得到复合菌液；所述混合比例参照上述方案，此处不再赘述。
本发明在得到第二原料后，对第二原料进行第二微曝气水解处理，得到二级降解产物；所述第二微曝气水解处理的时间为3～8d，优选为4～7d，更优选为5～6d；所述第二微曝气水解处理的温度为22～28℃，优选为24～26℃，更优选为25℃；所述第二微曝气水解处理的曝气溶氧量为0.2～1mg/l，优选为0.3～0.8mg/l，更优选为0.5mg/l；所述第二微曝气水解处理过程伴随搅拌，所述搅拌的转速为20～100rpm，优选为30～80rpm，更优选为50rpm.
本发明中，经过第二次微曝气水解处理后得到的二级降解产物相对于处理前的农作物秸秆中的纤维素、半纤维素以及木质素的含量明显降低。
本发明提供了上述方案中制备得到的二级降解产物在厌氧发酵制沼气中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种利用微生物菌剂降解农作物秸秆中木质纤维的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1一种利用微生物菌剂降解农作物秸秆中木质纤维的方法
1、制备植物乳杆菌菌液
1)将植物乳杆菌1ml接种于含有65g/l的沙氏琼脂培养基(sda)上，30℃条件下，静置培养60h；
2)将经过斜面培养的植物乳杆菌在无菌条件下接一接种环菌接种到种子培养基(种子培养基采用液体沙氏培养基，液体沙氏培养基的配方为：蛋白胨10g/l、葡萄糖40g/l和水)中，30℃条件下，180rpm震荡培养36h，制得种子培养液；
3)按体积百分数为5％的接种量将种子培养液接入到发酵培养基(发酵培养基配方：葡萄糖10g/l、麸皮20g/l、蛋白胨0.5g/l、(nh4)2so41.4g/l、kh2po42g/l、cacl20.3g/l、feso40.005g/l、mnso40.0016g/l、znso40.0014g/l、cocl20.002g/l和水)中，在30℃环境下培养36h。
2、第一微曝气水解处理
将长度为2.5cm青贮玉米秸秆(来源于市售)、植物乳杆菌菌液(浓度为108cfu/ml)和自来水混合得到第一原料，其中植物乳杆菌菌液占第一原料的体积百分数为10％，总固体质量百分含量为8％，搅拌频率为50r/min，反应时间为5d、温度控制在38℃，曝气溶氧量控制为1mg/l，进行第一微曝气水解处理，处理结束后，捞出，沥水，得到第二原料。
3、制备复合菌菌液
1)将黑曲霉、木霉、草酸青霉和黄孢原毛平革菌分别接种于含有65g/l的沙氏琼脂培养基(sda)上，25℃条件下，静置培养60h；
2)将经过斜面培养的四种菌在无菌条件下分别接种到固体沙氏培养基培养基中，25℃条件下，180rpm震荡培养48h，制得种子培养液；
3)按体积百分数为5％的接种量将上述四种种子培养液分别接入到发酵培养基(发酵培养基配方：葡萄糖10g/l、麸皮浸出液20g/l、硫酸铵1.4g/l、磷酸氢二钾2g/l、氯化钙0.3g/l、蛋白胨0.5g/l和水)中，在25℃环境下培养36h，得到四种菌液；
4)将上述四种菌液分别按照浓度为109cfu/ml进行稀释，然后按照体积比为1:1:1:1的比例进行混合，即为复合菌液。
4、第二微曝气水解处理
将步骤2)中得到的第二原料、步骤3)中得到的复合菌液和自来水混合；其中复合菌液占第二原料的体积百分数为10％，总固体质量百分含量为8％，处理时间为5天，温度控制在28℃，搅拌频率为50r/min，曝气溶氧量控制为1mg/l，进行第二微曝气水解处理。
对比例1
除不添加植物乳杆菌菌液和复合菌液外，其他条件与实施例1相同。
实施例2
以实施例1作为实验组，对比例1作为对照组进行对照实验。检测每天的纤维素、半纤维素和挥发性有机酸的含量，并计算降解率；其中纤维素、半纤维素和挥发性有机酸的检测方法依据文献【《玉米秸秆中纤维素_半纤维素和木质素的测定》，王金主、王元秀、李峰、高艳华、徐军庆、袁建国，山东食品发酵，2010.3(总第158期)】中记载的方法。
纤维素降解率＝已分解纤维素量/总纤维素量；
半纤维素降解率＝已分解半纤维素量/总半纤维素量；
木质素降解率＝已分解木质素量/总木质素量。
对照实验结果如下：连续运行10天，实验组中玉米秸秆的纤维素降解率达到68.1％，半纤维素的降解率为56.4％，木质素的降解率为18.5％；而未使用菌剂的玉米秸秆纤维素降解率为7.7％，半纤维素的降解率为11.2％，木质素的降解率为5.6％。
由以上实施例可知，本发明提供的利用微生物菌剂降解农作物秸秆中木质纤维的方法能有效的分解秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素成分，并且与对照组相比效果显著。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。