用于检测人参根尖干细胞的特异性基因PgWOX5及其检测方法与应用与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于检测人参根尖干细胞的特异性基因pgwox5及其检测方法与应用。

背景技术：

人参(panaxginsengc.a.mey.)为五加科多年生宿根草本植物，在我国已有5000多年的用药历史，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生精养血、安神益智的功效，被列为《神农本草经》的“上品”，享有“百草之王”的美誉。自然条件下，野山参具有极强的修复能力，可以抵御病原菌及食草动物的侵蚀。人参的“艼变”现象表明人参干细胞具有极强的恢复能力及再生潜力。根尖干细胞对维持植物生长及损伤修复具有重要作用，然而如何检测人参根尖干细胞尚未见报道。

通过原位杂交方法来观察植物干细胞标记基因的表达情况是一种常用的检测植物干细胞的方法。edu染色技术可以检测细胞增殖情况，同样也是检测植物干细胞的常用方法。但至今尚未见到采用干细胞标记基因的原位杂交及edu染色方法检测人参干细胞的报道。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2或序列4所示的蛋白质；

b)在序列2或序列4所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2或序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2或序列4所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2或序列4所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1或序列3所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2或序列4所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述a1)至a12)中的任一种：

a1)编码上述蛋白质的核酸分子；

a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；

a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；

a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；

a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；

a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；

a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；

a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物；

a9)含有a1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

a10)含有a2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

a11)含有a3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

a12)含有a4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，a1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1或序列3所示的cdna分子或基因组dna分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cdna分子或基因组dna分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cdna分子或基因组dna分子。

其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2或序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述生物材料中，a2)所述的含有编码上述蛋白质的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述蛋白质的dna，该dna不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用于构建a3)所述的重组载体的表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明又有一个目的是提供上述蛋白质或上述生物材料或edu染色法的新用途。

本发明提供了上述蛋白质或上述生物材料在检测人参根尖干细胞部位或位置中的应用。

本发明还提供了上述蛋白质或上述生物材料在定位人参根尖干细胞中的应用。

本发明还提供了上述蛋白质或其编码基因在作为人参根尖干细胞标志物中的应用。

本发明还提供了edu染色法在检测人参根尖干细胞的部位或位置中的应用。

本发明还提供了edu染色法在检测人参根尖干细胞的扩增情况中的应用。

本发明还提供了edu染色法在检测人参根尖干细胞分裂程度中的应用。

上述应用中，所述根尖干细胞为不定根根尖干细胞或须根根尖干细胞。

本发明还有一个目的是提供一种检测人参根尖干细胞部位或位置的方法。

本发明提供的检测人参根尖干细胞部位或位置的方法是通过检测待测人参样品中的上述蛋白质或其编码基因的表达部位或位置来实现的。所述蛋白质或其编码基因的表达部位或位置即为人参根尖干细胞部位或位置。

上述方法中，所述根尖干细胞为不定根根尖干细胞或须根根尖干细胞。

上述方法中，通过整体原位杂交方法检测待测人参样品中的上述蛋白质或其编码基因的表达部位或位置。

进一步的，所述整体原位杂交方法中所用的rna探针由序列7所示的单链rna分子和序列8所示的单链rna分子组成。

本发明的最后一个目的是提供一种rna探针。

本发明提供的rna探针由序列7所示的单链rna分子和序列8所示的单链rna分子组成。

上述rna探针在检测人参根尖干细胞部位或位置中的应用也属于本发明的保护范围。

上述rna探针在定位人参根尖干细胞中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供了用于检测人参根尖干细胞的特异性基因pgwox5，本发明提供的用于检测人参根尖干细胞的特异性基因pgwox5可用于标记人参不定根和须根根尖干细胞。本发明还提供了一种检测人参不定根和须根根尖干细胞部位或位置的方法。本发明填补了非模式植物干细胞检测领域的空白，为非模式植物干细胞定位提供了一套可行的检测方案，具有非常好的研究潜能和应用前景。

附图说明

图1为pgwox5基因序列及存在的snps位点。其中，wox5-a和wox5-b分别为人参pgwox5基因最主要的两种基因型。

图2为采用整体原位杂交方法检测人参不定根的根尖干细胞。

图3为采用edu染色法检测人参不定根根尖干细胞的增殖。

图4为采用整体原位杂交方法检测人参须根根尖干细胞。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的4％pfa溶液的配制方法如下：将1×pbs(ph7.4)65℃放置2-3小时，恢复室温后，加入10％dmso，0.1％tween20，3％np-40，现配现用。

下述实施例中的预杂交液1的配方如下：50％甲酰胺，5×ssc，3％sds，0.1％dtt，0.1％tween20。

下述实施例中的预杂交液2的配方如下：50％甲酰胺，5×ssc，0.1％tween20，0.1mg/ml肝素。

实施例1、pgwox5基因及其编码的蛋白的获得

1、rna的提取

取人参须根及不定根的样品用液氮研磨粉碎，采用trizolplantrnakit根据trizolplantrnakit说明书提取总rna，并用1％琼脂糖凝胶电泳确定rna完整性，核酸/蛋白定量仪测定rna含量。

2、cdna的合成

采用m-mlvrtasecdnasynthesiskit(takara)按m-mlvrtasecdnasynthesiskit(takara)说明书合成cdna。

3、pcr扩增

以步骤2获得的cdna为模板，采用wox5-f和wox5-r进行pcr扩增，得到pcr产物。引物序列如下：

wox5-f：5′-atggatgaaggaatgtcaggc-3′：

wox5-r：5′-ttaagattggaagcttaaacgc-3′。

4、克隆测序

对pcr产物进行胶回收后克隆测序，测序结果采用smartblast比对后确认为人参的wox5基因。由于人参为四倍体且杂合度高，pgwox5基因存在一些snps位点，常见的两种核苷酸序列分别为wox5-a和wox5-b(图1)，将图1所示的基因序列及相似度>95％以上的基因序列统一命名为pgwox5。wox5-a的核苷酸序列如序列1所示，wox5-a编码的wox5-a蛋白的氨基酸序列如序列2所示，wox5-b的核苷酸序列如序列3所示，wox5-b编码的wox5-b蛋白的氨基酸序列如序列4所示。

实施例2、整体原位杂交方法检测人参不定根根尖干细胞

一、pgwox5探针的制备

1、探针模板的制备

以人参cdna为模板对pgwox5基因的开放阅读框进行pcr扩增，获得的pcr产物(此处pcr产物为序列1和序列3所示的基因片段的混合物，序列1和序列3所示的基因片段的比例约为1:1)即为探针合成的模板dna。pcr扩增的引物如下：

正向引物：5′-atggatgaaggaatgtcaggc-3′；

反向引物：5′-ttaagattggaagcttaaacgc-3′。

2、单链探针的合成

取1μg步骤1获得的模板dna，加水补齐到11μl，65℃变性5分钟，迅速置于冰上。配制单链探针合成的体系：5×transbuffer4μl，diglabellingntpmix(购于roche公司，货号11277073910)2μl，rnaseinhibitor(购于takara公司，货号2313a)1μl，探针引物1μl(对照组使用的正向探针引物，实验组使用的反向探针引物)，单链rna合酶2μl(对照组使用的正向探针合成的rna合酶为sp6rnapolymerase，实验组使用的反向探针合成的rna合酶为t7rnapolymerase)。37℃保温2h。加入2μlrnase-free的dnasei，37℃温育15min。温育结束后，加20μl去离子甲酰胺。取1-2μl的单链探针，电泳检测确定探针条带为单一条带。

正向探针引物：5′-atttaggtgacactatagaataggactccgaactcctagcactgat-3′；

反向探针引物：5′-aattaatacgactcactatagggaacgacgccttctccttgtattcac-3′。

正向rna探针由序列5所示的单链rna分子和序列6所示的单链rna分子组成；

反向rna探针由序列7所示的单链rna分子和序列8所示的单链rna分子组成。

二、整体原位杂交方法检测人参不定根根尖干细胞

将采集的新鲜完整的人参不定根作为样品材料，运用步骤一制备的pgwox5基因的rna探针对人参不定根根尖干细胞进行检测。具体步骤如下：

1、将样品材料放入固定液(4％pfa溶液)中进行固定，材料在固定液中真空抽气至无气泡产生为止。抽气完成后，材料均沉于底部，换新的4％pfa/pbst溶液(含0.1％tween20)，抽真空后，4℃过夜。

2、完成步骤1后，采用pbst溶液与4％pfa溶液置换，使得材料悬浮于pbst溶液中。然后用乙醇与pbst溶液梯度置换(20％乙醇/pbst，20min；40％乙醇/pbst，20min；60％乙醇/pbst，20min；80％乙醇/pbst，20min；100％乙醇，20min，2次)。再用乙醇到二甲苯梯度置换(乙醇:二甲苯＝2:1，30min；乙醇:二甲苯＝1:1，30min；乙醇:二甲苯＝1:2，30min；纯二甲苯，1h)。最后再用二甲苯到乙醇梯度置换(二甲苯:乙醇＝2:1，30min；二甲苯:乙醇＝1:1，30min；二甲苯:乙醇＝1:2，30min；纯乙醇，30min，3次)。

3、完成步骤2后，将材料放于预杂交液1中，55℃孵育5-10小时，然后用蛋白酶k在37℃下消化30min，再用5％的甘氨酸/pbst处理5min以终止反应。最后将材料放于预杂交液2中，55℃杂交2-4小时。

4、完成步骤3后，向预杂交液2中加入1mg/ml的trna(购于roche，货号为1093274910)及1μg的pgwox5变性探针(步骤一中制备的正向探针和反向探针)，杂交24h。

5、完成步骤4后，洗掉未结合的探针，采用5％bsa/pbst在室温中封闭1小时。然后按1:2000的比例，在封闭液中加入dig抗体(购于roche，货号为1093274910)，室温反应16小时。再用nbt/bcip进行显色反应，避光反应2-6小时，采用4％pfa终止反应。最后用pbst溶液洗后采用体式镜与显微镜检测人参不定根中的根尖干细胞。

结果如图2所示，从图中可以看出：蓝色标记的位置即为人参不定根根尖干细胞，pgwox5基因的反向rna探针(实验组)在人参不定根根尖干细胞中与pgwox5基因的mrna杂交，说明pgwox5基因主要在人参不定根根尖干细胞中表达，而pgwox5基因的正向rna探针(对照组)不能发生杂交。上述结果表明：pgwox5基因可作为人参不定根根尖干细胞的标记基因，且基于本发明的pgwox5基因的反向rna探针的整体原位杂交方法可有效的检测人参不定根根尖干细胞的位置，并可直观、清楚的观察到人参不定根根尖干细胞。

实施例3、edu染色法检测人参不定根根尖干细胞的扩增

采用edu染色法检测人参不定根根尖干细胞的扩增，具体步骤如下：

一、edu标记

取长度约为2cm的人参不定根根尖，将其放入5ml的ms液体培养基中摇配48小时，然后使用click-eduimagingkit(thermofisher)进行edu标记。edu染色法按照click-eduimagingkit(thermofisher)中说明书的步骤进行。

二、人参不定根根尖干细胞的扩增情况

运用双光子激光共聚焦显微镜(lsm880)检测人参不定根根尖干细胞的扩增，edu荧光的激发光波长为590nm、发射光波长为615nm，采用层扫的方法，观察人参不定根根尖干细胞的扩增情况，干性强的细胞具有较强的分生能力。

结果如图3所示，从图中可以看出：根尖细胞分裂的情况，edu标记上的细胞核即是正在分裂的细胞，分裂能力强的部位即为人参不定根的根尖干细胞区域。

实施例4、人参须根根尖干细胞的检测

采用整体原位杂交方法检测人参须根根尖干细胞，具体步骤如下：将采集的新鲜完整的人参须根作为样品材料。按照实施例2步骤二中的整体原位杂交方法，运用实施例2步骤一中的pgwox5基因探针对人参须根根尖干细胞进行检测。

结果如图4所示，蓝色标记的位置即为人参须根根尖干细胞，pgwox5基因的反向rna探针(实验组)在人参须根根尖干细胞中与pgwox5基因的mrna杂交，说明pgwox5基因主要在人参须根根尖干细胞中表达，而pgwox5基因的正向rna探针(对照组)不能发生杂交。上述结果表明：pgwox5基因可作为人参须根根尖干细胞的标记基因，且基于本发明的pgwox5基因的反向rna探针的整体原位杂交方法可有效的检测人参须根根尖干细胞的位置，并可直观、清楚的观察到人参须根根尖干细胞。

序列表

<110>中国中医科学院中药研究所

<120>用于检测人参根尖干细胞的特异性基因pgwox5及其检测方法与应用

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>516

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atggatgaaggaatgtcaggcttttccatcaaacacccacgcggcggcagtggcggtgct60

ggtggtggaaataagtgcgggcggtggaatccgacgactgaacaggttaaagttttgact120

gagctgttcaggtccggactccgaactcctagcactgatcagattcaaaagatatcttca180

cagttgagcttttatggtaagatcgagagcaagaatgttttttactggtttcagaatcat240

aaagctagggaaagacaaaaacgccgtagggtttttgttggtgaaacaaatgaaatccaa300

cacaaagacaagatttcttcaacaaaacagataaatgagggttccgagcctgaaacattg360

cagctgtttccattaaattcattgactgaatctgaatcagagaagctgagattatttgca420

cgtgaatacaaggagaaggcgtcgtttgtttatgcttttgggagagaaatggatgatcat480

ccaccattggatctgcgtttaagcttccaatcttaa516

<210>2

<211>171

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metaspgluglymetserglypheserilelyshisproargglygly

151015

serglyglyalaglyglyglyasnlyscysglyargtrpasnprothr

202530

thrgluglnvallysvalleuthrgluleupheargserglyleuarg

354045

thrproserthraspglnileglnlysileserserglnleuserphe

505560

tyrglylysilegluserlysasnvalphetyrtrppheglnasnhis

65707580

lysalaarggluargglnlysargargargvalphevalglygluthr

859095

asngluileglnhislysasplysileserserthrlysglnileasn

100105110

gluglysergluprogluthrleuglnleupheproleuasnserleu

115120125

thrglusergluserglulysleuargleuphealaargglutyrlys

130135140

glulysalaserphevaltyralapheglyargglumetaspasphis

145150155160

proproleuaspleuargleuserpheglnser

165170

<210>3

<211>525

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atggatgaaggaatgtcaggcttttccatcaaacacccacgcggcggcagtggcggtgct60

ggtggtggaaataagtgcgggcggtggaatccgacgactgaacaggttaaagttttgact120

gagctgttcaggtccggactccggactcctagcacggatcagattcaaaagatatcttca180

cagttgagcttttatggtaagatcgagagcaagaatgttttttactggtttcagaatcat240

aaagctagggaaagacaaaaacgccgtagggtttttgttggtgaaacaaatgaattccaa300

cacaaagacaagatttcttcaacaaaacattttgcagagataaatgagggttccgagcct360

gaaacattgcagctgtttccattaaattcatggactgaatctgaatcagagaagctgaga420

ttatttgcacgtgaatataaggagaaggcgtcgtttgtttatgcttttggtagagaaatg480

gatgatcatccaccattggatctgcgtttaagcttccaatcttaa525

<210>4

<211>174

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

metaspgluglymetserglypheserilelyshisproargglygly

151015

serglyglyalaglyglyglyasnlyscysglyargtrpasnprothr

202530

thrgluglnvallysvalleuthrgluleupheargserglyleuarg

354045

thrproserthraspglnileglnlysileserserglnleuserphe

505560

tyrglylysilegluserlysasnvalphetyrtrppheglnasnhis

65707580

lysalaarggluargglnlysargargargvalphevalglygluthr

859095

asnglupheglnhislysasplysileserserthrlyshispheala

100105110

gluileasngluglysergluprogluthrleuglnleupheproleu

115120125

asnsertrpthrglusergluserglulysleuargleuphealaarg

130135140

glutyrlysglulysalaserphevaltyralapheglyargglumet

145150155160

aspasphisproproleuaspleuargleuserpheglnser

165170

<210>5

<211>311

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ggacuccgaacuccuagcacugaucagauucaaaagauaucuucacaguugagcuuuuau60

gguaagaucgagagcaagaauguuuuuuacugguuucagaaucauaaagcuagggaaaga120

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<210>6

<211>320

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ggacuccggacuccuagcacggaucagauucaaaagauaucuucacaguugagcuuuuau60

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uauaaggagaaggcgucguu320

<210>7

<211>311

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

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guucggagucc311

<210>8

<211>320

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

aacgacgccuucuccuuauauucacgugcaaauaaucucagcuucucugauucagauuca60

guccaugaauuuaauggaaacagcugcaauguuucaggcucggaacccucauuuaucucu120

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