本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaam基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法。
背景技术：
青蒿素是从植物黄花蒿中提取的含过氧基团的倍半萜内酯药物，是当今疟疾治疗的最理想药物，能有效治疗对传统药物氯奎产生抗药性的疟原虫感染。青蒿素主要从黄花蒿(artemisiaannual.)中直接提取，或提取黄花蒿中含量较高的青蒿酸，然后半合成而成。目前除黄花蒿外，尚未发现含有青蒿素的其它天然植物资源。因此黄花蒿仍是青蒿素药物生产的惟一药源。
虽然黄花蒿系世界广泛分布品种，但青蒿素含量随产地不同差异极大。研究证明黄花蒿中合成青蒿素的主要部位是其叶片表面的腺毛细胞。由于其合成部位的特异性，黄花蒿中青蒿素的含量仅占叶片干重的0.8％—1.4％，因而使其分离成本高、产量低、废弃物多。
野生黄花蒿中青蒿素含量很低，主要集中在0.1％—0.60％之间，高者也仅为0.8％左右。通过杂交和定向育种开展了大量提高黄花蒿中青蒿素含量的尝试，但目前报道的最高青蒿素含量也未超过1.4％，说明了常规选育方法的局限性。
青蒿素主要在黄花蒿腺毛中合成、分泌及储存，通过增大黄花蒿腺毛的密度及大小，能够有效地增加黄花蒿中青蒿素的含量。因此，将生长素合成酶关键基因iaam转入能够促进黄花蒿腺毛细胞的生长发育，增大其密度或大小；提高腺毛细胞代谢水平从而增加黄花蒿中青蒿素的合成，进而提高黄花蒿中青蒿素的含量。
技术实现要素：
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaam基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaam基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法包括如下步骤：
(1)黄花蒿腺毛细胞特异表达基因的载体重组构建：
将黄花蒿腺毛特异启动子aagtpro和iaam基因构建到ti质粒的t-dna区，以hpt基因为选择标记基因，以pwm101作为出发载体进行改造和载体构建；得到重组ti质粒pwm101-aagtpro::iaam，所述黄花蒿腺毛特异启动子aagtpro的序列如seqidno.1所示；
(2)工程化根癌农杆菌的制备：
构建的重组ti质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌lba4404(市售)，经过抗生素筛选和分子检测验证工程农杆菌，培养工程农杆菌至对数生长后期；
(3)黄花蒿悬浮细胞系的建立：
将深绿色或淡黄色生长快、结构疏松颗粒状的黄花蒿愈伤组织置于100mlms液体培养基中，将愈伤轻轻夹碎，摇床150r/min，光照周期为16h/8h光暗交替，温度为25±2℃振荡培养；培养15—20d左右为悬浮细胞的快速增长且细胞活性较高期，选取该时期期的直径在5mm以内的小细胞团及含有单细胞的黄花蒿悬浮细胞系悬浮液，备用；
(4)黄花蒿悬浮细胞的共培浸染转化：
将步骤(3)所得的黄花蒿悬浮细胞系悬浮液与步骤(2)中生长至对数生长后期的工程农杆菌共培2.5—3.5d，优选为3d，然后转入筛选培养基上培养；
(5)转化细胞的筛选和获得抗性愈伤组织：
经步骤(4)共培2.5—3.5d，优选为3d后的黄花蒿悬浮细胞经ms液体培养基冲洗(洗3遍)后，置于含200mg/l羧苄青霉素和30mg/lhpt抗性的诱导愈伤及丛生芽分化的培养基上，培养至愈伤上有丛生芽的分化(6周左右)，获得抗性丛生芽并继代增殖；
(6)诱导根分化和获得转基因苗：
当抗性丛生芽生长至3—5cm大小时，将抗性丛生芽转移到生根培养基诱导根分化，分化后幼苗经过炼苗后移栽至营养基质中，获得转基因植株；
(7)转基因植株的分子检测和腺毛细胞发育观察：
提取转基因植株叶片的dna，用pcr法进行目的基因的分子检测验证，通过体视荧光显微镜观察转基因植株叶片腺毛细胞的密度、大小及荧光强度，通过与对照的比较判断腺毛的发育情况，对腺毛发育具有显著促进的植株进行青蒿素含量测定；
(8)建立转基因黄花蒿品系：
筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。
其中，步骤(1)是用hindiii和bamh1双酶切pwm101载体，将aagtpro替换pwm101中的35spro，完成pwm101-aagtpro重组载体构建，再用bamh1和pst1酶切重组载体pwm101-aagtpro，将iaam基因插入，构建得到腺毛特异表达的重组ti质粒pwm101-aagtpro::iaam。步骤(1)是从genbank中的nucleotide数据库中获得黄花蒿腺毛特异启动子aadb2序列信息，设计克隆和同源重组引物，以黄花蒿基因组dna为模板，通过pcr扩增技术，获得黄花蒿腺毛特异启动子aagtpro序列。
下面对本发明作进一步说明：
本发明通过转基因技术，将生长素合成酶关键基因iaam转入黄花蒿，利用黄花蒿腺毛特异性启动子aagtpro驱动iaam在黄花蒿腺毛细胞中特异表达，促进黄花蒿腺毛细胞发育和代谢，增加腺毛的密度和长度，从而提高其青蒿素含量。
具体而言，本发明采用黄花蒿叶片诱导愈伤，对黄花蒿愈伤进行振荡培养，获得大量的黄花蒿单细胞及小细胞团(悬浮细胞系)，通过农杆菌介导，将生长素合成酶关键基因iaam导入黄花蒿单细胞及小细胞团中，经过共培转化后，诱导黄花蒿抗性愈伤组织、分化丛生芽和诱导生根的过程，从而获得转基因黄花蒿植株。
利用黄花蒿单细胞及小细胞团为转化受体，转化生长素合成酶关键基因iaam(iaam基因是植物通过色氨酸途径合成生长素(iaa)的关键酶)，使用黄花蒿腺毛细胞特异性表达的基因启动子aagtpro，能在黄花蒿腺毛细胞中有效作用，保证其功能基因在腺毛细胞中表达，从而不影响植株的整体发育。
本发明独特之处在于利用黄花蒿单细胞及小细胞团(悬浮细胞系)进行生长素合成相关基因的遗传转化。
总之，本发明采用基因工程的植物遗传转化技术开展黄花蒿的转基因，涉及到生长素合成酶关键基因在其腺毛细胞中特异表达，是一种运用现代生物技术开展的黄花蒿育种新方法。
具体实施方式
1.腺毛细胞特异表达载体的构建
从genbank中的nucleotide数据库中获得黄花蒿腺毛特异启动子aadb2序列信息，设计克隆和同源重组引物，以黄花蒿基因组dna为模板，通过pcr扩增技术，获得黄花蒿腺毛特异启动子aagtpro序列，构建腺毛特异表达的重组ti质粒pwm101-aagtpro::iaam。
(1)黄花蒿腺毛特异启动子aadb2序列的获得
从genbank中的nucleotide数据库中获得黄花蒿腺毛特异启动子aadb2序列(登录号为：kc347592.1)，通过pcr技术扩增获得黄花蒿腺毛特异启动子aadb2序列，并与pmd18-t连接，转化至e.colidh5α中保存，经测序确定所克隆基因的正确性，构建pwm101-aagtpro::iaamti质粒表达载体。其中所克隆的aadb2启动子序列与genbank报道的同源性为95％(与所用黄花蒿的基因型不同)，因此自命名为aagtpro。
具体操作步骤为：
设计aagtpro特异性引物。
上游引物aagtproup1cccaagctttgaaggatgaccaaaagcataa(seqidno.2)
下游引物aagtprodn1agtcataggagctaacaccaccct(seqidno.3)
以黄花蒿dna为模版，利用上述aagtpro特异性引物，pcr扩增得到aagtpro基因片段，pcr反应体系别为：
黄花蒿dna(约100-200ng)1μl，10×buffer2.5μl，dntps(10mmol/l)2μl，aagtproup1(10μmol/l)1μl，aagtprodn1(10μmol/l)1μl，pfutaqdna聚合酶(1u/μl)0.5μl，补ddh2o至25μl。
aagtpropcr反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性1min、56℃退火2min、72℃延伸2min，共30个循环，终72℃延伸10min。
pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测、切胶回收后，与pmd18-t连接，连接体系为：pmd18-tvector1μl，ddh2o补至10μl。16℃连接过夜，转化大肠杆菌e.colidh5α。
(2)构建pwm101-aagtpro::iaamti质粒表达载体
以pwm101为出发载体，利用载体上的hindiii和bamhⅰ酶切位点，设计aagtpro扩增引物。
上游引物aagtproup2：
下游引物aagtprodn2：
iaam基因扩增引物(注：iaam由深圳华大基因公司合成pmd18-iaam)
iaamup
iaamdn
以pmd18-aagtpro质粒为模板，利用上述aagtproup2和dn2基因特异性引物，pcr技术扩增aagtpro。pcr反应体系为pmd18-aagtpro(约100ng)1μl，10×buffer2.5μl，dntps(10mmol/l)2μl，up2(10μmol/l)1μl，dn2(10μmol/l)1μl，taqdna聚合酶(1u/μl)1μl，补ddh2o至25μl。反应程序为：95℃预变性4min，94℃变性1min、56℃退火1min、72℃延伸2min、30个循环，最后72℃延伸7min。
pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收aagtpro片段，将aagtpro回收片段与双酶切后的pwm101载体连接，用aagtpro替换pwm101中的35spro，完成pwm101-aagtpro重组载体构建，再用bamh1和pst1酶切重组载体pwm101-aagtpro，将iaam基因插入，完成pwm101-aagtpro::iaam黄花蒿腺毛特异性表达载体构建。
本实施例获得的aagtpro基因，构建了黄花蒿腺毛特异性启动子与生长素合成关键酶基因iaam的重组特异表达载体pwm101-aagtpro::iaam。通过转化上述基因，促进黄花蒿腺毛细胞的发育和代谢，从而提高其青蒿素含量。
2.质粒的检测和根癌农杆菌转化
构建的重组ti质粒经过酶切检测，验证其构建的正确性。然后用电激转化法转化到根癌农杆菌lba4404。具体方式是：制备的质粒dna0.1μg与200μl感受态农杆菌混合后置于电激杯，biorad电激转化仪以细菌转化模式进行电激转化。转化后的根癌农杆菌铺于含卡那霉素50mg/l、利福平50mg/l和链霉素50mg/l的yeb培养基上筛选，将筛选获得的阳性菌落，经菌落pcr验证表明，所构建的在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体aagtpro::iaam已成功转化到根癌农杆菌菌株中，可用于后续遗传转化。
3.工程农杆菌共培养转化
将上述筛选鉴定的工程农杆菌接种至yeb液体培养基，28℃摇瓶培养过夜至对数生长后期，按1:50接种到扩大的培养体系继续摇瓶至od600nm＝1.0。1/2ms液体培养基将菌体重悬，将菌液加入黄花蒿悬浮细胞液中进行转化：按每平皿8ml的细胞悬浮液与200μl的工程农杆菌菌悬液避光共培养3d。
4.农杆菌的抑制、愈伤诱导和丛生芽分化
将共培后的黄花蒿悬浮细胞系以ms液体培养基冲洗3遍，然后转接到含2.0mg/l6-ba+1.0mg/lnaa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂的ms固体培养基上。其中加入200mg/l羧苄青霉素和30mg/lhpt(潮霉素)，分别抑制农杆菌和诱导并筛选抗性愈伤组织及丛生芽。25±2℃，16h/8h进行光暗交替培养。约6周后可以诱导出抗性的丛生芽。
5.诱导根分化与炼苗
待抗性丛生芽生长至3-5cm后，将其从愈伤组织基部切下，移入1/2ms+0.1mg/lnaa/0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂的生根培养基中诱导其生根，此时对每一株阳性植株进行编号，25±2℃左右，16h/8h进行光暗交替培养。诱导根分化2周后，室温下炼苗1周。然后移栽至营养土中生长。
6.pcr检测转基因黄花蒿植株、黄花蒿腺毛发育观察及青蒿素含量分析
提取转基因黄花蒿植株叶片dna，利用转入的目的基因引物对其进行pcr分子检测验证；并对转基因黄花蒿植株叶片腺毛发育情况进行观察与分析，具体操作为：取转基因黄花蒿植株叶片，置于体视荧光显微镜下进行荧光显微观察，统计单位叶面积的腺毛细胞数，与对照非转基因黄花蒿比较，可以估测青蒿素含量提高情况，采用高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定转基因黄花蒿中青蒿素的含量。
7.建立转基因黄花蒿品系
测定转基因黄花蒿中的青蒿素含量，筛选青蒿素显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养或有性繁殖，筛选稳定遗传的转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。
以上实施例利用带有特异性表达载体的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿悬浮细胞系，获得经pcr检测的转基因黄花蒿植株，成功建立了黄花蒿悬浮培养细胞遗传转化体系。通过荧光显微观察黄花蒿腺毛细胞的发育情况，结果表明黄花蒿叶片上的腺毛密度和腺毛长度明显增加。利用黄花蒿悬浮细胞系与根癌农杆菌共培转化，经筛选诱导分化可实现同期获得大量均一的转化植株，提高转基因植株的效率。本发明获得的转基因黄花蒿中青蒿素含量显著提高，转iaam基因的黄花蒿中青蒿素的含量最高可达21.6mg/gdw，是非转化黄花蒿含量的1.8倍。
seqidno.1：
seqidno.8：
序列表
<110>湖南农业大学
<120>一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaam基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法
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