三个粉蝶霉素类天然产物及其在制备抗肾癌药物中的应用的制作方法

本发明属于微生物天然产物领域，具体涉及三个粉蝶霉素类天然产物及其在制备抗肾癌药物中的应用。

背景技术：

长期以来，恶性肿瘤已成为严重危害人类生命和生活质量的主要疾病之一。据报道，恶性肿瘤已经成为我国居民首要死因，而且，中国恶性肿瘤死亡率近20年来不断呈现上升趋势，甚至处于世界恶性肿瘤死亡率的前列。对于恶性肿瘤的治疗，天然产物及其衍生物药物发挥着重要作用。据报道，1981年到2008年间，天然产物来源的抗肿瘤药物占上市抗肿瘤药物的60％以上，而且，新型天然产物及其衍生物作为新的抗肿瘤药物所占数量还在不断增加。肾癌是世界十大致死癌症之一，在我国泌尿系肿瘤中发病率仅次于膀胱癌。研究发现，肾癌患者中30％发生转移，另有30％在10年内有发生转移的危险，并且转移性肾癌对放化疗及系统性治疗具有较高的耐受性。

粉蝶霉素类(piericidins)是微生物来源的α-pyridone类抗生素，截至2017年，现已发现41个piericidins天然产物，均由陆地和海洋来源的放线菌产生。粉蝶霉素类报道有杀虫、抗菌等活性，对部分肿瘤细胞也有抑制活性，但是作用机制研究非常薄弱，抗肿瘤潜力有待进一步挖掘。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供3个粉蝶霉素类新天然产物piericiding、piericidini和piericidinj。

所述的piericiding、piericidini和piericidinj，其结构式如式(i)所示：

所述的粉蝶霉素类化合物piericiding，其

所述的粉蝶霉素类化合物piericidini，其

所述的粉蝶霉素类化合物piericidinj，其

本发明人通过对一株红树林底泥来源的链霉菌streptomycessp.hberc-58855(专利申请号201710344174.3中已经公开)进行摇床放大发酵和提取纯化，获得3个粉蝶霉素类化合物piericiding,piericidini和piericidinj。

通过对这粉蝶霉素类化合物的体外抗肾癌活性评价，发现粉蝶霉素类化合物piericidinsg,i和j对人肾小管上皮细胞(正常组织细胞)hk-2的细胞毒作用较弱，显示毒性较小；而对人肾癌细胞os-rc-2细胞和achn细胞具有一定的选择性抑制活性(ic500.02-30μm)，其中piericiding对肾癌achn具有非常显著的抑制活性(ic500.02μm)，大大强于阳性药索拉菲尼(ic503.3μm)和同类天然产物piericidina(ic500.40μm)。piericidinsi和j对肾癌achn的半数抑制率ic50(2.4-3.8μm)与索拉菲尼相当，对肾癌os-rc-2的半数抑制率ic50(4.1-5.3μm)强于阳性药索拉菲尼(ic5014μm)，与piericidina活性相当(ic505.2μm)。同时，piericidinsg,i和j亲水性优于piericidina，比piericidina具有更好的成药性。因此，该类化合物可以做为抗肾癌药物开发的先导化合物。

因此本发明的第二个目的是提供如式(ⅰ)所示的化合物piericidinsg、i和/或j，或其药用盐在制备抗肾癌药物中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种抗肾癌药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成份的如式(ⅰ)所示的化合物piericidinsg、i和/或j，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。

本发明的第四个目的是提供上述化合物piericidinsg、i和/或j的制备方法，是从链霉菌streptomycessp.hberc-58855的发酵培养物中制备分离得到的。

优选，具体步骤如下：将链霉菌streptomycessp.hberc-58855的发酵物用乙酸乙酯萃取后，萃取物浓缩后得到提取物，提取物经硅胶柱层析，顺序用石油醚；石油醚：二氯甲烷1:1v/v；二氯甲烷；二氯甲烷：甲醇100:1v/v；100:2v/v；100:3v/v；100:4v/v；100:5v/v；甲醇洗脱，收集二氯甲烷洗脱的流份s3和二氯甲烷：甲醇100:1v/v洗脱的流份s4，s3经纯化得到化合物piericiding，s4经纯化得到化合物piericidini和piericidinj。

本发明的第五个目的是提供链霉菌streptomycessp.hberc-58855在制备上述化合物piericidinsg、i和/或j中的应用。

本发明的三个粉蝶霉素类化合物piericidinsg,i和j是未经报道的新化合物。本发明揭示粉蝶霉素类化合物piericidinsg,i和j对两种肾癌细胞具有明显抑制活性，这类粉蝶霉素可以用于制备抗肾癌药物。因此本发明为开发新的抗肾癌药物提供了备选化合物，对开发中国海洋微生物药物资源具有重要的意义。

本发明涉及的链霉菌streptomycessp.hberc-58855，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2017年4月20日，保藏编号为cctccno:m2017186。(其保藏信息公开于专利申请号cn201710344174.3中)

附图说明

图1是piericidinsg,i和j的重要cosy,hmbc和noesy相关信息；

图2是化合物piericiding的实验和计算ecd图谱；

图3是化合物piericidini和piericidinj的实验和计算ecd图谱。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：粉蝶霉素类化合物piericidinsg,i,和j的制备

1、streptomycessp.hberc-58855的固体培养

链霉菌streptomycessp.hberc-58855(保藏编号为cctccno:m2017186)是从红树林底泥分离得到，该菌种保存于isp-2培养基斜面，isp-2培养基组成为：酵母提取粉4g，葡萄糖4g，麦芽提取粉10g，粗海盐30g，琼脂粉20g，水1000ml，ph7.2-7.4，灭菌备用。

2、streptomycessp.hberc-58855的放大发酵

取少量streptomycessp.hberc-58855斜面菌种进行种子发酵培养，培养基为甘露醇20克，豆胨10克，豆油2.5克，磷酸氢二钾0.35克，950毫升去离子水，调ph7.0，定容至1000毫升，500毫升三角瓶装100毫升，灭菌备用。培养条件为：28℃，120转/每分。培养96小时后，进行扩大培养，培养体积扩大到3l，培养基和培养条件不变。培养48小时后，进行罐体发酵，发酵体积为30l，发酵培养基为葡萄糖10克，可溶性淀粉10克，棉籽粉25克，酵母提取物3克，碳酸钙5克，氯化钠2克，950毫升去离子水，调ph7.0，定容至1000ml，灭菌备用。28℃，培养120小时后，收取发酵液，用乙酸乙酯萃取，萃取物经浓缩后得到streptomycessp.hberc-58855菌株发酵物的干燥提取物。

3、提取分离

streptomycessp.hberc-58855菌株发酵物的干燥提取物用少量甲醇溶解后硅胶拌样，进行中压硅胶柱层析(200-300目)，用石油醚；石油醚：二氯甲烷1:1v/v；二氯甲烷；二氯甲烷：甲醇100:1v/v；100:2v/v；100:3v/v；100:4v/v；100:5v/v；甲醇顺序洗脱得到9个洗脱部位s1-s9。s3部位(二氯甲烷洗脱流份)经制备hplc(hitachi-l2130液相色谱仪,hitachil-2455dad检测器,phenomenexods色谱柱,250mm×10.0mmi.d.,5μm,流动相：乙腈:水45:55v/v洗脱，流速1.5ml/min)进行反复分离纯化，得到纯化的化合物piericiding(rt＝17.3min,45％乙腈，4.36mg)。s4部位(二氯甲烷：甲醇100:1v/v洗脱流份)经制备hplc(hitachi-l2130液相色谱仪,hitachil-2455dad检测器,phenomenexods色谱柱,250mm×10.0mmi.d.,5μm,流动相：乙腈:水45:55v/v洗脱，流速1.5ml/min)进行反复分离纯化，得到纯化的化合物piericidini(rt＝15.3min,45％乙腈，1.8mg)和piericidinj(rt＝15.8min,45％乙腈，0.91mg)。

实施例2：piericidinsg,i,和j的结构鉴定

1.piericidinsg,i,和j理化性质数据

对化合物piericidinsg,i,和j进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：

化合物piericiding：无色油状物，-5.5(c0.218,meoh)；ir(atr)νmax3312,2945,2835,1635,1472,1417,1126,1018,667,600,562cm^-1；cd(0.2mg/ml,meoh),λmax(δε)240(5.8),223(-7.8)；¹h和¹³cnmr数据见表1和表2；(+)-hr-esimsm/z414.2657[m+h]⁺(calcdforc25h36no4414.2600)。

化合物piericidini：无色油状物，0.08(c0.12,meoh)；ir(atr)νmax3335,2945,2833,1448,1416,1020,667,600,552cm^-1；cd(0.342mg/ml,meoh),λmax(δε)237(-1.5),205(3.5)；¹h和¹³cnmr数据见表1和表2；(+)-hr-esimsm/z504.3320[m+h]⁺(calcdforc29h45no6504.3280)。

化合物piericidinj：无色油状物，2.22(c0.063,meoh)；ir(atr)νmax3352,2945,2833,1472,1412,1124,1018,667,600,555cm^-1；cd(0.336mg/ml,meoh),λmax(δε)230(-0.9),218(-0.2),205(-2.8)；¹h和¹³cnmr数据见表1和表2；(+)-hr-esimsm/z504.3320[m+h]⁺(calcdforc29h45no6504.3280)。

表1.piericidinsg,i,和j的¹hnmr(700mhz，cdcl3)数据.

*信号重叠

表2.piericidinsg,i,和j的¹³cnmr(175mhz，cdcl3)数据.

2.piericidinsg,i,和j平面和立体结构的推导。

化合物piericidinsg,i,和j化学平面结构由核磁共振二维谱(2dnmr)分析推导获得，其主要的cosy,hmbc和noesy相关信息如图1：

piericiding的c-9,c-10的绝对立体构型由计算ecd方法确定，如图2。9r,10r立体构型的计算ecd曲线与piericiding实验ecd曲线吻合较好，确定piericiding的绝对立体构型为9r,10r。同理确认piericidini和piericidinjc-9,c-10的绝对立体构型，都为9r,10r。piericidini和piericidinj的差别仅为c-13,c-19羟基的绝对立体构型，经计算ecd方法确定piericidini为13s,19r构型，如图3。piericidinj则为13r,19s构型。

根据以上理化数据和波谱解析分析可知，化合物piericidinsg,i,和j的具体结构如式(ⅰ)所示。

piericiding：

piericidini：

piericidinj：

综上，确定化合物piericidinsg,i,和j的平面和立体结构，该3个化合物均为未见报道的新化合物。

实施例3：粉蝶霉素piericidinsg,i,和j对肾癌细胞的抑制活性

两株人肾癌细胞株订购于中科院上海细胞资源中心：achn人肾癌细胞株(cat#tchu199)；os-rc-2人肾癌细胞株(cat#tchu40)；人肾小管上皮细胞hk-2由南方医科大学药学院提供。

同类型天然产物粉蝶霉素a(piericidina)和用于治疗肾癌的上市药物索拉菲尼(sorafenib)作为阳性对照。

细胞抑制活性实验采用cck-8检测法。收集对数生长期细胞，计数，用完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓度(依照细胞密度优化试验结果确定)，接种96孔板，每孔加100μl细胞悬液。细胞在37℃，100％相对湿度，5％co2培养箱中孵育24小时。用培养基将待测化合物稀释至合适的作用浓度，按25μl/孔加入细胞。对于achn细胞，受试化合物的作用终浓度从20μm开始，4倍梯度稀释，9个浓度点；对于os-rc-2和hk-2细胞，受试化合物的作用浓度从100μm开始，4倍梯度稀释，9个浓度点。细胞置于37℃，100％相对湿度，5％co2培养箱中孵育72小时。吸弃培养基，加入含10％cck-8的新鲜完全培养基置于37℃培养箱中孵育2-4小时。轻轻震荡后在spectramaxm5microplatereader上测定450nm波长处的吸光度，以650nm处吸光度作为参比，计算抑制率。

按下式计算化合物对细胞生长的抑制率：

细胞生长抑制率％＝[(ac-as)/(ac-ab)]×100％

as:样品的吸光度oa(细胞+cck-8+待测化合物)

ac:阴性对照的吸光度oa(细胞+cck-8+dmso)

ab:阳性对照的吸光度oa(培养基+cck-8+dmso)

运用软件graphpadprism5并采用计算公式log(inhibitor)vs.normalizedresponse进行ic50曲线拟合并计算出ic50值。

化合物对三株细胞株的增殖抑制作用见表3：

表3.受试化合物对肾癌细胞的增殖抑制作用和油水分配系数(logp)

通过对这粉蝶霉素类化合物的体外抗肾癌活性评价，发现粉蝶霉素类化合物piericidinsg,i,和j对人肾小管上皮细胞(正常组织细胞)hk-2的细胞毒作用较弱，显示毒性较小；而对人肾癌细胞os-rc-2细胞和achn细胞具有一定的选择性抑制活性(ic500.02-30μm)，其中piericiding对肾癌achn具有非常显著的抑制活性(ic500.02μm)，大大强于阳性药索拉菲尼(ic503.3μm)和同类天然产物piericidina(ic500.40μm)。piericidinsi和j对肾癌achn的半数抑制率ic50(2.4-3.8μm)与索拉菲尼相当，对肾癌os-rc-2的半数抑制率ic50(4.1-5.3μm)强于阳性药索拉菲尼(ic5014μm)，与piericidina活性相当(ic505.2μm)。

相对于piericidina的化学结构，粉蝶霉素类化合物piericidinsg,i,和j在结构上增加了羰基或者羟基，增大了化合物的极性。我们测定了，粉蝶霉素类化合物的油水分配系数(logp)进行比较，发现piericidinsg,i,和j的logp值小于piericidina的logp值，说明piericidinsg,i,和j亲水性优于piericidina，比piericidina具有更好的成药性。

综上，本发明为研制新的抗肾癌药物提供了新的候选化合物，对中国自主知识产权的新药开发具有重要的意义。