一个血红素结合蛋白基因TaHBP1及其重组干扰载体和应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，公开了一个具血红素结合(heme-binding)结构域的基因tahbp1及其重组干扰载体和应用。

背景技术：

小麦是我国乃至世界最重要的粮食作物之一，其生长发育却受多种非生物和生物胁迫。由专性寄生真菌小麦白粉病菌(blurmeriagraminisf.sp.tritici,bgt)侵染引起的小麦白粉病是世界性真菌病害，主要侵害小麦植株地上部分，包括叶片和叶鞘，也可侵害茎秆和麦穗。小麦白粉病多发于小麦苗期和成株期，白粉菌侵染小麦后，不仅掠夺植株养分，其菌丝层还覆盖小麦植株表面造成植株光合作用效能降低，碳水化合物累积和输送减少，进而减少分蘖数、穗数、穗粒数和千粒重，使小麦严重减产(董金皋.农业植物病理学.北京:中国农业出版社,2001)。一般情况下，小麦白粉病能够引起小麦减产5-19％，严重情况下能够使小麦减产30％以上。从九十年代以后，全国每年小麦白粉病的发病面积在600万公顷以上，严重危害小麦生产安全，因此小麦白粉病的防治越来越受到人们的关注，选育抗白粉病小麦品种是最有效的方法。

植物和病原菌在长期的进化过程中形成了复杂的互作系统，一方面植物进化出了一系列抗病基因和复杂的抗病机制去抵抗病原菌的侵染达到抗病目的，所以在植物中导入抗病基因可以提高小麦对病原菌的抗性；另一方面病原菌也进化出了一系列致病效应因子和复杂的致病机制去侵染植物达到致病目的，病原菌致病性的发挥不仅需要病原菌自身致病效应因子的参与，还需要激活或利用植物的感病基因去达到成功侵染的目的，所以在植物中降低感病基因的表达可以干扰白粉菌的侵染，同样可以达到提高植物对病原菌抗性的目的。活体营养型病原菌是植物与病原菌长期斗争和进化的高级形式(panstrugar,schulze-lefertp.corruptionofhostseven-transmembraneproteinsbypathogenicmicrobes:acommonthemeinanimalsandplants？[j].microbesandinfection,2003,5(5):429-437)，基因组学研究表明活体营养型真菌基因数目要远少于其他真菌，其自身缺少某些物质合成的功能途径(kemene,gardinera,etal.genegainandlossduringevolutionofobligateparasitisminthewhiterustpathogenofarabidopsisthaliana[j].plosbiology,2011,9(7):e1001094)，只有借助部分寄主基因的功能，才能够从寄主体内获取营养物质以维持生长繁殖，因此它们只能在活体寄主组织或细胞上正常生存(kemene,jonesj.obligatebiotrophparasitism:canwelinkgenomestolifestyles？trendsinplantscience,2012,17(8):448-457)。小麦白粉菌是一种活体营养型病原菌，对小麦侵染成功侵染需要激活小麦部分基因的表达(panstrugar,schulze-lefertp.corruptionofhostseven-transmembraneproteinsbypathogenicmicrobes:acommonthemeinanimalsandplants？[j].microbesandinfection,2003,5(5):429-437)，突变或者干扰这部分基因表达可达到抑制小麦白粉病菌侵染的目的，然而目前可供基因工程利用的小麦感白粉病基因相对缺乏。

南农9918是南京农业大学细胞遗传所运用现代生物技术与常规育种技术相结合，以扬麦158/92r137//扬麦158杂交选育而成的抗病、高产、优质小麦新品种，sm-1是南农9918的ems感病突变体，广谱高抗小麦白粉病stpk-v转基因株系是南京农业大学细胞遗传所将stpk-v基因转入受体扬麦158中获得，其感病受体扬麦158是江苏里下河地区农科所培育的大面积推广的小麦品种。南农9918和sm-1是一对近等基因系，stpk-v转基因株系与扬麦158是一对近等基因系。利用转录谱技术获得抗病南农9918、stpk-v转基因株系和感病sm-1、扬麦158受白粉菌诱导前后的基因转录谱，通过比较抗感材料之间转录谱的差异，获得了一个在感病sm-1和扬麦158中受白粉菌诱导特异上调表达的基因tahbp1，该基因可能在白粉菌侵染过程中起到协助病原菌入侵和发育的作用，从而导致扬麦158和sm-1感病。所以在感病材料中降低tahbp1的表达，可以干扰病原菌的生产，起到提高感病材料抗白粉病的能力。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种具血红素结合(heme-binding)结构域的基因tahbp1的重组干扰载体和应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

具血红素结合(heme-binding)结构域的基因tahbp1来自普通小麦(triticumasetivuml.)扬麦158，其核苷酸序列为seqidno.1。

该具血红素结合(heme-binding)结构域的基因的蛋白质为tahbp1，其氨基酸序列为seqidno.2。

含有所述的具血红素结合(heme-binding)结构域的基因tahbp1的重组干扰载体。

所述的重组干扰载体pwmb006:tahbpas优选以pwmb006为出发载体，将tahbp1基因的正向序列插入到pwmb006的bamhi和kpni酶切位点间、同时反向序列插入到pwmb006的spei和saci之间所得。

所述的基因tahbp1在构建抗白粉病小麦品种中的应用；优选抑制易感白粉病小麦品种中所述的基因tahbp1的表达，能够提高易感白粉病小麦品种的对白粉病的抗性。

所述的含具血红素结合(heme-binding)结构域的基因tahbp1的表达载体在构建抗白粉病小麦品种中的应用；优选将所述的重组干扰表达载体导入易感白粉病小麦品种中，可以提高易感白粉病小麦品种对白粉病的抗性。

有益效果

本发明从小麦中克隆得到了一个具血红素结合(heme-binding)结构域的基因tahbp1，该基因在含有感白粉病的小麦扬麦158中受白粉菌诱导表达，而抗白粉病的小麦南农9918中不受白粉菌诱导表达。将其插入表达载体pwmb006，得到的该基因的重组干扰表达载体pwmb006:tahbp1rnai导入感病小麦品种中，可以提高感白粉病小麦品种对白粉病的抗性。tahbp1用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，能够提高小麦的白粉病抗性。

附图说明

图1利用q-pcr分析tahbp1在抗白粉病石麦14、内麦8号、兰天7号中的表达

0小时：tahbp1在未诱导样品中的相对表达量；24小时：tahbp1在白粉菌诱导样品中的相对表达量

图2tahbp1rnai载体pwmb006:tahbp1rnai的构建

a：pwmb006；b：pwmb006:tahbp1中间载体；c：pwmb006:tahbp1rnai干扰载体；

图3pbi220:tahbp1转基因植株t0代pcr分子鉴定

marker：dl2000dna标准分子量；质粒(p)：pwmb006:tahbp1rnai阳性对照；扬麦158(y)：阴性对照；t0-4，t0-7，t0-15，t0-68，t0-266：阳性转基因植株。

图4tahbp1转化扬麦158的阳性t0-42和t0-177衍生的t1代植株的白粉病抗性鉴定

a：t0-42衍生t1代转基因植株的抗白粉病鉴定；b：t0-266衍生t1代转基因植株的抗白粉病鉴定

具体实施方式

实施例1扬麦158中受白粉菌诱导表达的具血红素结合(heme-binding)结构域基因tahbp1的克隆

南农9918是南京农业大学细胞遗传所运用现代生物技术与常规育种技术相结合，以扬麦158/92r137//扬麦158杂交选育而成的抗病、高产、优质小麦新品种(陈佩度，张守忠，王秀娥，王苏玲，周波，冯祎高，刘大钧.抗白粉病高产小麦新品种南农9918.南京农业大学学报,2002,25(4):1438-1444)，sm-1是南农9918的ems感病突变体(xingl,hup,liuj,witekk,zhous,xuj,zhouw,gaol,huangz,zhangr,wangx,chenp,wangh,jonesjdg,karafiátovám,vránaj,j,j,tiany,wuy,caopm21fromhaynaldiavillosaencodesacc-nbs-lrrproteinconferringpowderymildewresistanceinwheat.molecularplant,201811(4):874-878)，广谱高抗小麦白粉病stpk-v转基因株系是南京农业大学细胞遗传所将stpk-v基因转入受体扬麦158中获得(aizhongcao,lipingxing,xiaoyunwang,xuemingyang,weiwang,yuleisun,chenqian,jinlongni,yapingchen,dajunliu,xiuewang,andpeiduchen.serine/threoninekinasegenestpk-v,akeymemberofpowderymildewresistancegenepm21,conferspowderymildewresistanceinwheat.proceedingsofthenationalacademyofsciences,usa,2011,108(19):7727-7732)，其感病受体扬麦158是江苏里下河地区农科所培育的大面积推广的小麦品种。

为了筛选感白粉病sm-1和扬麦158在感白粉病过程中哪些基因受白粉菌诱导表达，本实验室在前期研究中，采用高通量测序的方法获得抗白粉病南农9918、stpk-v转基因植株与感白粉病小麦sm-1和扬麦158中在白粉菌诱导前后的转录谱，并通过比较获得感白粉病扬麦158和sm-1中受白粉菌诱导特异上调表达的基因。具体流程如下：将抗白粉病小麦南农9918、stpk-v转基因植株的种子和感白粉病小麦sm-1和扬麦158的种子播于培养皿中发芽，露白后移栽到盆钵，一叶期把从感白粉病小麦材料上搜集的白粉菌孢子接种到苗上进行诱导，并于接种前和接种24小时取样，分别提取rna(用invitrogen公司的trizol试剂提取)，形成八个样品nn9918-0(南农9918诱导0小时的样品)、nn9918-24(南农9918诱导24小时的样品)、stpk-0(stpk-v转基因植株诱导0小时的样品)、stpk-24(stpk-v转基因植株诱导24小时的样品)和sm-0(sm-1诱导0小时的样品)、sm-24(sm-1诱导24小时的样品)、y0(扬麦158诱导0小时的样品)、y24(扬麦158诱导24小时的样品)，并送交华大公司进行转录谱测序。将nn9918-24与nn9918-0的转录谱进行比较，筛选在南农9918中受白粉菌诱导上调表达的基因形成数据库南农9918-data；将stpk-24与stpk-0的转录谱进行比较，筛选在stpk-v转基因植株中受白粉菌诱导上调表达的基因形成数据库stpk-v-data；同时将y24与y0的转录谱进行比较，筛选在扬麦158中受白粉菌诱导上调表达的基因形成数据库y-data；将sm-24与sm-0的转录谱进行比较，筛选在sm-1中受白粉菌诱导上调表达的基因形成数据库sm-data。进一步将南农9918-data与sm-data进行比较，筛选只出现在sm-data中的基因，这类基因即为只在感病sm-1中受白粉菌诱导上调表达、而在南农9918中受白粉菌诱导不改变甚至下调表达的基因；同时将stpk-v-data与y-data进行比较，筛选只出现在y-data中的基因，这类基因即为只在感病sm-1中受白粉菌诱导上调表达、而在stpk-v转基因植株中受白粉菌诱导不改变甚至下调表达的基因。仅在扬麦158和sm-1受白粉菌诱导表达的基因中，有一个基因ta#s52541791具有血红素结合(heme-binding)结构域，初步判断该基因与扬麦158的感病性具有相关性。

以扬麦158经白粉菌诱导24小时的叶片提取出的rna反转录成cdna为模板、以根据芯片探针ta#s52541791设计的引物p1(gactgatcaaatggcgttcc,seqidno.3)和p2(tcaggaggctctatccagtcg,seqidno.4)为引物进行rt-pcr，获得了tahbp1的全长基因，其orf包含885个核苷酸(seqidno.1)，编码的蛋白序列包含294个氨基酸(seqidno.2)。

实施例2tahbp1在抗病南农9918和感病扬麦158中的表达分析

为了研究tahbp1在其他抗病材料中是否也受白粉菌诱导下调表达，利用含有抗白粉病基因pm21的抗病小麦品种石麦14(公知公用，冀审麦2004005)、内麦8号(公知公用，川审麦2003003)、兰天17(公知公用，甘审麦2005011)经白粉菌诱导0、24小时的rna反转录cdna为模板，利用p3(tgaagcgtgaggaggagtac，seqidno.5)和p4(agagatttccgcaacctgga，seqidno.6)为引物进行实时荧光定量pcr(q-pcr)分析。pcr程序为：pcr反应在实时荧光定量pcr仪(myiq，bio-rad公司，美国)上扩增并检测荧光。20ulpcr反应体系中含2×sybrgreenpcrmastermix10ul，0.5μm引物p3和p4，反转录cdna模板2ul。扩增参数为：95℃10分钟，然后95℃15秒、60℃30秒，72℃1分钟，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定。检测基因表达水平用myiq系统软件进行分析。结果表明，在石麦14、内麦8号、兰天17中，tahbp1受白粉菌诱导均下调表达(图1)，进一步说明tahbp1在抗病材料中受白粉菌诱导下调表达，推测tahbp1在白粉病抗病途径中起负向调控作用。

实施例3tahbp1干扰载体pwmb006:tahbprnai的构建

干扰tahbp1基因表达的rnai载体pwmb006:tahbp1rnai出发载体是pwmb006(tingtingchen,jinxiao,junxu,wentaowan,biqin,aizhongcao,weichen,lipingxing,chendu,xiquangao,shouzhongzhang,ruiqizhang,wenbiaoshen,haiyanwangandxiuewang.twomembersoftarlkfamilyconferpowderymildewresistanceincommonwheat.bmcplantbiology201616:27doi:10.1186/s12870-016-0713-8)。构建流程如下：1、以已经克隆的tahbp1的基因序列为模板，设计引物p5(ttggatcctgaagcgtgaggaggagtac，seqidno.7)和p6(ttggtaccagagatttccgcaacctgga，seqidno.8)，且p5带有bamhi的酶切位点，p6带有kpni的酶切位点。2、以含有tahbp1基因的质粒为模板，使用引物对p5和p6进行pcr扩增，回收扩增片段。3、用bamhi和kpni对扩增产物进行双酶切，将酶切产物插入到bamhi和kpni双酶切后的载体pwmb006中，将tahbp1正向置于35s启动子后面的多克隆位点处。由此将目标基因tahbp1克隆到强启动子35s的下游，获得表达载体pwmb006:tahbp1。4、以已经克隆的tahbp1的基因序列为模板，设计引物p7(ttgagctctgaagcgtgaggaggagtac，seqidno.9)和p8(ttactagtagagatttccgcaacctgga，seqidno.10)，且p7带有saci的酶切位点，p8带有spei的酶切位点。5、以含有tahbp1基因的质粒pwmb006:tahbp1为模板，使用引物对p7和p8进行pcr扩增，回收扩增片段。6、用saci和spei对扩增产物进行双酶切，将酶切产物插入到saci和spei双酶切后的载体pwmb006:tahbp1中，将tahbp1反向置于35s启动子后面的多克隆位点处。由此将目标基因tahbp1的发卡结构克隆到强启动子35s的下游，获得如图2所示的干扰表达载体pwmb006:tahbp1rnai。

实施例4pwmb006:tahbprnai转化普通小麦扬麦158及阳性植株的分子鉴定

利用基因枪转化方法将pwmb006:tahbp1rnai转入感白粉病受体扬麦158的转化方法如下：1、挑取预培养7天约2000块扬麦158幼胚愈伤组织，在高渗培养基(ms+aba0.5mg/l+水解酪蛋白500mg/l+2，4-d2mg/l+葡萄糖30g/l+0.4mol/l甘露醇，ph5.8)上预处理4–5小时；2、将携有目的基因tafbk1的过量表达载体pbi220:tafbk1通过基因枪轰击法转化到扬麦158愈伤组织，轰击后在高渗培养基上继续培养16小时。3、将愈伤组织转移至恢复培养基(1/2ms+水解酪蛋白500mg/l+2,4-d2mg/l+蔗糖30g/l，ph5.8)上暗培养2周；4、将愈伤组织转移至含有除草剂的筛选培养基上(1/2ms+aba0.5mg/l+水解酪蛋白500mg/l+2,4-d1mg/l+蔗糖30g/l+4mg/lbialaphos，ph5.8)筛选培养2周；5、将具有除草剂抗性的愈伤组织转移到分化培养基中(1/2ms+l-谷氨酞胺lmmol/l+水解酪蛋白200mg/l+kt1mg/l+iaa0.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂0.8％，ph5.8)进行分化，待分化芽长至2–4cm时将其转移至生根培养基(1/2ms+kt1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂0.8％，ph5.8)中。6、至再生苗长约8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1–2天，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵。获得再生植株共135棵。

提取所有再生植株基因组dna，对转化植株利用启动子内部引物p9(tccaggttgcggaaatctct，seqidno.11)和基因内部引物p10(actgccgtggaactgtcata，seqidno.12)进行pcr扩增，以鉴定阳性植株。pcr程序：10-50ng基因组dna模板，10μm的p9和p10各0.5μl；2.5μl10×buffer；2.5μl2.5mm的dntp；1.5μl25mm的mg²⁺；0.25μl(5u/μl)taqpolymerase(takara)，加水至25μl。pcr反应条件为：94℃预变性3分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃2分钟，33个循环；72℃延伸10分钟。pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测。其中4株可以扩增出目的条带，鉴定为阳性植株。图3所示为阳性植株的筛选，包括t0-4、t0-7、t0-15、t0-68，t0-266。

实施例5pwmb006:tahbpas转扬麦158阳性植株的白粉病抗性鉴定

tahbp1转基因t0代阳性植株分单株收获后，将阳性单株的t1代种子种于盆钵，以感病受体扬麦158为对照，进行离体叶片的白粉病抗性鉴定。结果表明：t1-4，t1-7，t1-15、t1-68和t1-266株系均出现抗感分离现象。感病对照植株扬麦158对白粉菌表现高感，无过敏性坏死斑，叶片上布满白粉菌孢子堆；转基因t1代阳性植株中的抗病单株与未转化扬麦158相比，白粉病抗性水平得到显著提高，叶片上只有少量孢子(图4)。以上鉴定结果表明：tahbp1在感病材料中的表达量降低后，可提高感病材料的白粉病抗性，该基因可用于利用基因工程手段培育抗白粉病小麦。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一个血红素结合蛋白基因tahbp1及其重组干扰载体和应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>885

<212>dna

<213>普通小麦扬麦158(triticumasetivuml.)

<400>1

atggcgttcccctgcttgcccgccgtgcggccaccgctgcgcgccgtccgagcccggggc60

gagcgtccccgcggccggcggcccgcgctgacggtcgtggccgccggaacccgcaccagc120

agcggcgccgaggcccgagggtcgctggtgctggcgctcgtctcgcaggccctcgccgcc180

tcgcagcgccgcgccgtcgacctcgtcaccgaggccgccaagtacgccctcccttccggc240

cgcttcgagccacggaccctcgaggaggccctcatgtccgttcccgacctcgagaccgtc300

ccattccgcatcctgaagcgtgaggacgagtacgagatcagacaagtggagtcatactat360

gtcgctgagacgacgatgcctggaagaactgggtttgatttcagcggatcgtctcaatcg420

ttcaacgtgctggcatcttacttattcggtaagaacacgaggtccgaacaaatggaaatg480

acaacccctgtttttacccggaaggaggaagttcgcggtgaaacgatggacatgaccacc540

ccagttataacaaagaagtcagctgatggaaacaagtggaagatgtcttttgtgatgcca600

tcaaaatatggtccagacttgcctcaggcaaaagacccgtctgtgactatcaaggaggtg660

cccagcaaaattgtagcagttgcggcctttccaggtttggttacaaatgatgacataagc720

cagagggaatccagattgcggaaagctcttcagaaagatacacagtatcgggtgaaagag780

gattcagtggtggaaattgcacagtataatccccctttcacacttccgttcgcaaggcgc840

aatgaagtagcactagaggttgagggggttgatagagcctcctga885

<210>2

<211>294

<212>prt

<213>普通小麦扬麦158(triticumasetivuml.)

<400>2

metalapheprocysleuproalavalargproproleuargalaval

151015

argalaargglygluargproargglyargargproalaleuthrval

202530

valalaalaglythrargthrserserglyalaglualaargglyser

354045

leuvalleualaleuvalserglnalaleualaalaserglnargarg

505560

alavalaspleuvalthrglualaalalystyralaleuprosergly

65707580

argphegluproargthrleugluglualaleumetservalproasp

859095

leugluthrvalpropheargileleulysarggluaspglutyrglu

100105110

ileargglnvalglusertyrtyrvalalagluthrthrmetprogly

115120125

argthrglypheasppheserglyserserglnserpheasnvalleu

130135140

alasertyrleupheglylysasnthrargsergluglnmetglumet

145150155160

thrthrprovalphethrarglysglugluvalargglygluthrmet

165170175

aspmetthrthrprovalilethrlyslysseralaaspglyasnlys

180185190

trplysmetserphevalmetproserlystyrglyproaspleupro

195200205

glnalalysaspproservalthrilelysgluvalproserlysile

210215220

valalavalalaalapheproglyleuvalthrasnaspaspileser

225230235240

glnarggluserargleuarglysalaleuglnlysaspthrglntyr

245250255

argvallysgluaspservalvalgluilealaglntyrasnpropro

260265270

phethrleuprophealaargargasngluvalalaleugluvalglu

275280285

glyvalaspargalaser

290

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<213>人工序列(artificialsequence)

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tccaggttgcggaaatctct20

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

actgccgtggaactgtcata20