本发明涉及生物发酵制药技术领域，具体地说涉及一种利用转相强制析晶的方法得到高纯度米尔贝霉素。
背景技术：
米尔贝霉素(milbemycin)是大环内酯类的抗体内外寄生虫药物，含有a3、a4两种有效组份，常用于犬科动物的驱虫药。米尔贝霉素对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果。通常用来预防恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病。米尔贝霉素是合成米尔贝肟的中间体，高纯度的中间体为合成米尔贝肟提供了高效的手段。
米尔贝霉素的纯度对后续的收率以及成本有很大的关联；目前米尔贝霉素通行的纯化方法是大孔树脂吸附解析和硅胶层析进行纯化，需要大量的有机溶媒并且产生很多的固体废弃物。随着环保意识的逐渐加强，响应建设环境友好型、资源节约型社会的要求，按照目前的安全环保要求，在米尔贝霉素提纯过程中，如何减少有机溶媒的使用量和减少固废是当务之急。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术在米尔贝霉素提取方面的技术不足，提供一种高纯度米尔贝霉素的制备方法。
本发明巧妙采用了相转移的思路，代替大孔树脂吸附和硅胶层析技术，包括以下步骤：
(1)将米尔贝霉素发酵液的滤渣经低沸点的醇萃取后，经热水减压浓缩，降温过滤去除固形物，取滤液；
(2)滤液加入强极性有机溶媒反萃，反萃后收集有机相，经盐洗、碱洗、水洗后加入吸附剂，压滤，收集滤液，滤液减压浓缩至干，收集固形物；
(3)固形物用强极性溶媒溶解后，升温，保持温度，搅拌下加入弱极性有机溶媒，降温、析晶、离心干燥得到高纯度的米尔贝霉素。
步骤(1)米尔贝霉素发酵液的滤渣中，米尔贝霉素色谱纯度为50％-55％。具体地，米尔贝霉素a3+a4的色谱纯度为50％-55％。
步骤(1)所述低沸点醇包括但不限于甲醇、乙醇，加入低沸点醇的量为滤渣的6-8倍体积；所述低沸点醇的体积百分比为75％-80％。
步骤(1)的热水为50～60℃的水，减压浓缩至酒精度18％-23％有灰白色固形物出现即停止浓缩。优选地，步骤(1)减压浓缩至酒精度20％有灰白色固形物出现即停止浓缩。
步骤(1)所述降温是在减压浓缩之后缓慢降温至8-10℃，保温10-14小时。优选地，保温12小时，板框过滤掉固形物，收集滤液，滤液中米尔贝霉素a3+a4的色谱纯度为65％-75％。
步骤(2)所述的强极性有机溶媒为二氯甲烷、乙酸乙酯和/或乙酸丁酯；所述盐洗为采用饱和食盐水冲洗，所述碱洗为采用饱和碳酸氢钠溶液冲洗；所述的吸附剂为活性炭、无水硫酸钠。
步骤(3)所述强极性有机溶媒为二氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯；弱极性有机溶媒包括：正庚烷、正己烷、甲基环己烷、石油醚。
步骤(3)是加入固形物1-1.5倍体积的强极性有机溶媒，升温至40-60℃，保持该温度，边搅拌边加入60-80倍体积的弱极性有机溶媒。
步骤(3)中，加入弱极性有机溶媒后，保持温度1.5-2小时按照降温幅度5-7℃/小时，降温至8-10℃，搅拌陈化10-12小时，析出晶体。
本发明提供了上述制备方法在提高米尔贝霉素纯度中的应用。
经过本发明的上述方法制得的高纯度米尔贝霉素，发酵菌渣中的色谱纯度为50％-55％，经过相转移结晶后色谱纯度可以达到95％-98％，绝对含量也可以达到93-96％左右。
本发明方法利用转相强制析晶获得了高纯度的米尔贝霉素，溶媒的使用量大大的降低，比现有技术的溶媒使用量降低了约70％，固废的量大大的降低，比现有技术的固废量降低了约90％，安全环保风险可控(利用本发明结晶的方法最多约需要的纯产品60倍体积的有机溶媒，如果采用常规的硅胶层析和大孔树脂吸附解吸最少需要纯产品600-800倍体积的有机溶媒；固体废弃物方面，由于本发明的工艺不产生废弃硅胶和树脂，仅仅产生纯产品量5％左右的活性炭和无水硫酸钠)。本发明方法代替了大孔树脂层析和硅胶层析技术，简单易操作，成本低，产品纯度高，质量收率好，同时降低了生产成本和投资成本的同时，减少了对环境的污染。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明实施例采用的米尔贝霉素发酵液的滤渣中，米尔贝霉素色谱纯度为50％-55％。
实施例1
本实施例制备高纯度米尔贝霉素的方法步骤如下：
(1)将米尔贝霉素发酵液滤渣使用75％乙醇萃取，提取出92％以上的米尔贝霉素，压滤后得到滤液，该滤液中米尔贝霉素a3+a4组份色谱纯度为57％；
(2)采用热水加热，水温50-60℃，把经步骤(1)得到的滤液减压浓缩至酒精度约20％左右有灰白色固形物出现即停止浓缩，降温至8-10℃，保温12小时，板框过滤掉固形物，收集滤液，得到米尔贝霉素a3+a4组份色谱纯度为67％；
(3)将步骤(2)得到的滤液利用乙酸乙酯反萃，萃取后排掉水相收集有机相，有机相依次通过盐洗(饱和食盐水)、碱洗(饱和碳酸氢钠溶液)、水洗，收集有机相；
(4)将步骤(3)得到的有机相加入占纯产品体积5％的针状活性炭和纯产品5％的无水硫酸钠，搅拌均匀后，板框压滤，收集澄清的滤液；
(5)将步骤(4)得到的澄清滤液减压浓缩至干，得到胶状的固形物；
(6)将步骤(5)得到的胶状固形物用其1倍体积的乙酸乙酯溶解，升温至40℃，保持如上温度缓慢加入固形物60倍体积的正己烷，边搅拌边加入，保持该温度2小时左右，后开启冷冻水缓慢降温，降温幅度5℃/小时，降温至10℃左右，搅拌陈化12小时，晶体析出，离心机分离、干燥。得到高纯度的米尔贝霉素a3+a4组份色谱纯度为96.7％。
实施例2
本实施例制备高纯度米尔贝霉素的方法步骤如下：
⑴将米尔贝霉素发酵液滤渣使用80％乙醇萃取，提取出93.5％以上的米尔贝霉素，压滤后得到滤液，滤液中米尔贝霉素a3+a4组份色谱纯度为57.6％；
⑵采用热水加热，水温不超过55℃，把经步骤⑴得到的滤液减压浓缩至酒精度约20％左右有灰白色固形物出现即停止浓缩，降温至8-10℃，保温12小时，板框过滤掉固形物，收集滤液，得到米尔贝霉素a3+a4组份色谱纯度为68％；
⑶将步骤⑵得到的滤液利用一定量的二氯甲烷反萃，萃取后排掉水相收集有机相，有机相依次通过盐洗(饱和食盐水)、碱洗(饱和碳酸氢钠溶液)、水洗，收集有机相；
⑷将步骤⑶得到的有机相加入占纯产品体积5％的针状活性炭和纯产品5％的无水硫酸钠，搅拌均匀后，板框压滤，收集澄清的滤液；⑸将步骤⑷得到的澄清滤液减压浓缩至干，得到胶状的固形物；
⑹将步骤⑸得到的胶状固形物用其1.5倍体积的乙酸丁酯溶解，升温至45℃，保持如上温度缓慢加入固形物60倍体积的石油醚，边搅拌边加入，保持该温度2小时左右，后开启冷冻水缓慢降温，降温幅度5℃/小时，降温至10℃左右，搅拌陈化12小时，晶体析出，离心机分离、干燥得到高纯度的米尔贝霉素a3+a4组份色谱纯度为96.1％。
实施例3
本实施例制备高纯度米尔贝霉素的方法步骤如下：
⑴将米尔贝霉素发酵液滤渣使用85％甲醇萃取，提取出96％以上的米尔贝霉素，压滤后得到滤液，滤液中米尔贝霉素a3+a4组份色谱纯度为64.8％；
⑵采用热水加热，水温58℃，把经步骤⑴得到的滤液减压浓缩至酒精度约20％左右有灰白色固形物出现即停止浓缩，降温至8-10℃，保温12小时，板框过滤掉固形物，收集滤液，得到米尔贝霉素a3+a4组份色谱纯度为71.6％；
⑶将步骤⑵得到的滤液利用二氯甲烷反萃，萃取后排掉水相收集有机相，有机相依次通过盐洗(饱和食盐水)、碱洗(饱和碳酸氢钠溶液)、水洗，收集有机相；
⑷将步骤⑶得到的有机相加入占纯产品体积5％的针状活性炭和纯产品5％的无水硫酸钠，搅拌均匀后，板框压滤，收集澄清的滤液；
⑸将步骤⑷得到的澄清滤液减压浓缩至干，得到胶状的固形物；
⑹将步骤⑸得到的胶状固形物用其1倍体积的乙酸乙酯溶解，升温至40℃，保持如上温度缓慢加入固形物60倍体积的正庚烷，边搅拌边加入，保持该温度2小时左右，后开启冷冻水缓慢降温，降温幅度5℃/小时，降温至10℃左右，搅拌陈化12小时，晶体析出，离心机分离、干燥得到高纯度的米尔贝霉素a3+a4组份色谱纯度为98.7％。
实施例4
本实施例制备高纯度米尔贝霉素的方法步骤如下：
⑴将米尔贝霉素发酵液滤渣使用75％甲醇萃取，提取出93％以上的米尔贝霉素，压滤后得到滤液，滤液中米尔贝霉素a3+a4组份色谱纯度为59％；
⑵采用热水加热，水温56℃，把经步骤⑴得到的滤液减压浓缩至酒精度约20％左右有灰白色固形物出现即停止浓缩，降温至8-10℃，保温12小时，板框过滤掉固形物，收集滤液，得到米尔贝霉素a3+a4组份色谱纯度为68％；
⑶将步骤⑵得到的滤液利用乙酸丁酯反萃，萃取后排掉水相收集有机相，有机相依次通过盐洗(饱和食盐水)、碱洗(饱和碳酸氢钠溶液)、水洗，收集有机相；
⑷将步骤⑶得到的有机相加入占纯产品体积5％的针状活性炭和纯产品5％的无水硫酸钠，搅拌均匀后，板框压滤，收集澄清的滤液；
⑸将步骤⑷得到的澄清滤液减压浓缩至干，得到胶状的固形物；
⑹将步骤⑸得到的胶状固形物用其1.2倍体积的乙酸乙酯溶解，升温至43℃，保持如上温度缓慢加入固形物60倍体积的正庚烷，边搅拌边加入，保持该温度2小时左右，后开启冷冻水缓慢降温，降温幅度5℃/小时，降温至10℃左右，搅拌陈化12小时，晶体析出，离心机分离、干燥得到高纯度的米尔贝霉素a3+a4组份色谱纯度为97.7％。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。