鱼类自然杀伤细胞杀伤细菌感染的单核/巨噬细胞能力的测定方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种鱼类自然杀伤细胞杀伤细菌感染的单核/巨噬细胞能力的测定方法。

背景技术：

鱼类的免疫系统是由非特异性免疫和特异性免疫组成。鱼类的免疫系统亦由免疫组织和器官、免疫细胞和体液免疫因子组成。而免疫细胞有两类：一是淋巴细胞，主要进行特异性免疫反应；另一类是吞噬细胞，是非特异性免疫的关键成分，在抵御微生物感染方面具有重要作用。非特异性免疫系统在鱼类抵御病原生物入侵时发挥着更为重要的作用。巨噬细胞是一种白血球，源自单核细胞，主要是以固定或游离细胞的形态对细胞残片和病原体进行吞噬和消化，再激活淋巴球等免疫细胞，使之对病原体做出反应，阻止其扩散和生长，所以巨噬细胞在鱼类免疫过程中占有极其重要的作用。但巨噬细胞被细菌感染后导致鱼类产生不良症状，影响鱼类的生存，鱼类自然杀伤细胞会发挥作用将其杀伤，但如何判断其杀伤能力则是亟待解决的问题。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种鱼类自然杀伤细胞杀伤细菌感染的单核/巨噬细胞能力的测定方法，该方法可简单有效地判断自然杀伤细胞杀伤细菌感染的单核/巨噬细胞的能力。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种鱼类自然杀伤细胞杀伤细菌感染的单核/巨噬细胞能力的测定方法，包括以下步骤：

(1)分离鱼头肾白细胞；

(2)采用细胞贴壁法制备鱼单核/巨噬细胞；

(3)迟钝爱德华菌感染单核/巨噬细胞；

(4)将鱼头肾白细胞用浓度为8-12ng/ml的il-2刺激48h，接着用无菌pbs缓冲液洗涤2-3次，制得鱼类自然杀伤细胞；

(5)将自然杀伤细胞与迟钝爱德华菌感染的单核/巨噬细胞共孵育3.5-4.5h后吸取上清，用无菌pbs缓冲液反复洗涤细胞5-6次，向剩余细胞中加入1％tritonx-100裂解细胞4-6min，然后反复吹打裂解后的液体，并将裂解后的液体与无菌pbs缓冲液混匀；

(6)步骤(5)所得混匀液体涂到无抗生素的lb平板上，培养过夜，统计平板上的菌落数目，根据菌落数目测定鱼类自然杀伤细胞对细菌感染的单核/巨噬细胞的杀伤能力，菌落数目少的说明杀伤能力强。

进一步地，步骤(1)中的具体过程为：

①在无菌条件下处死鱼，用无菌工具取出头肾，置于rpmi1640+10％fbs+1％a⁺/a⁺的培养基中，用培养基洗涤头肾2-3次，然后再在rpmi1640+10％fbs+1％a⁺/a⁺的培养基中轻轻挤压头肾组织，使头肾组织中的细胞渗出，收集细胞悬液至新的离心管中，重复该步骤3-4次；

②将细胞悬液过200目细胞筛，然后加入淋巴细胞分离液，于20℃，2800r/min条件下离心25-35min；

③离心结束后，吸取培养基和淋巴分离液之间的白色絮状细胞层，与无菌pbs缓冲液混匀，并于20℃，2800r/min条件下离心15-20min；

④步骤③离心结束后弃上清，并用rpmi1640+10％fbs+1％a⁺/a⁺培养基重悬细胞，制得。

进一步地，步骤(2)中的具体过程为：将鱼头肾白细胞离心，然后用dmem+5％fbs+1％a⁺/a⁺的培养基重悬，以5-10×10⁶个细胞/孔接种到培养板中，400ul/孔，静置2-3h后，去除培养基，加入无菌pbs缓冲液反复洗涤5-6次，去除悬浮细胞，留下的贴壁细胞即为单核/巨噬细胞。

进一步地，步骤(3)中的具体过程为：将单核/巨噬细胞接种到无抗生素的dmem+5％fbs培养基中，培养1h后加入单核/巨噬细胞10倍数量的迟钝爱德华菌，然后于20℃，1000g×g条件下离心10min，最后于26℃培养40min，再吸除培养基，用无菌pbs缓冲液反复洗涤8-10次，置于dmem+5％fbs+100ug/ml庆大霉素的培养基中培养1-2h。

进一步地，步骤(4)中il-2的浓度为10ng/ml。

本发明提供的鱼类自然杀伤细胞杀伤细菌感染的单核/巨噬细胞能力的测定方法，具有以下有益效果：

本发明通过il-2诱导产生的鱼自然杀伤细胞，对迟钝爱德华菌感染的单核/巨噬细胞具有杀伤作用，根据共孵育后菌落数目多少便可判断其杀伤能力大小，该方法简单有效，可准确判断自然杀伤细胞对感染后的单核/巨噬细胞的杀伤能力。

附图说明

图1为本发明的实验流程图；

图2为采用贴壁方法制得的鱼单核/巨噬细胞。

图3为迟钝爱德华菌感染后的单核/巨噬细胞。

图4为共孵育后对照组和实验组的平板菌落结果。

图5为共孵育后对照组和实验组的菌落柱形图。

具体实施方式

本发明以草鱼为研究对象进行实验，实验过程中用到的培养基组分rpmi1640、fbs和双抗a⁺/a⁺均是赛默飞世尔科技公司生产的产品，无菌pbs缓冲液的浓度为0.01mol/l，ph＝7.4。下面结合实施例对本发明做详细的说明。

实施例1

一种鱼类自然杀伤细胞杀伤细菌感染的单核/巨噬细胞能力的测定方法，包括以下步骤：

1、分离草鱼头肾白细胞

(1)在无菌条件下处死鱼，用无菌工具取出头肾，置于加有3.5mlrpmi1640+10％fbs+1％a⁺/a⁺培养基的培养皿中，用培养基洗涤头肾2次，然后加入5mlrpmi1640+10％fbs+1％a⁺/a⁺的培养基到培养皿中，轻轻挤压头肾组织，使其中的细胞渗出，收集细胞悬液至新的离心管中，重复该步骤3次，总共获得15ml细胞悬液，然后添加rpmi1640+10％fbs+1％a⁺/a⁺培养基至20ml；

(2)用无菌的200目细胞筛过滤细胞悬液过，然后沿管壁缓慢加入细胞悬液到含有淋巴细胞分离液的50ml离心管中，加入的细胞悬液为8ml，淋巴细胞分离液为8ml，于20℃，2800r/min条件下离心30min；

(3)离心结束后，用巴氏吸管吸取培养基和淋巴分离液之间的白色絮状细胞层，并转移至新的50ml离心管中，加入等体积的无菌pbs缓冲液，轻晃洗涤，并于20℃，2800r/min条件下离心16min；

(4)步骤(3)离心结束后弃上清，用5mlrpmi1640+10％fbs+1％a⁺/a⁺培养基重悬细胞，并用血球计数板计数。

2、制备草鱼自然杀伤细胞和单核/巨噬细胞

将分离得到的草鱼头肾白细胞分为两部分，一部分用于制备自然杀伤细胞，一部分用于制备单核/巨噬细胞。

制备自然杀伤细胞：将含有6×10⁶个细胞的培养基1.2ml加入到35mm的培养皿中，然后加入浓度为10ng/ml的il-2刺激48h，最后用无菌pbs缓冲液洗涤2-3次，制得。

对照组仅加入1.2ml培养基，不添加il-2。

制备鱼单核/巨噬细胞：将数量为8×10⁷个细胞在20℃，2800r/min条件下离心16min后，用2mldmem+5％fbs+1％a⁺/a⁺的培养基重悬，以6×10⁶个细胞/孔种入24孔培养板中(每组实验设置6个重复)，体积为400ul/孔，静置2h后，去除培养基，用500ul/孔的无菌pbs缓冲溶液反复洗涤5次，去除悬浮细胞，留下的贴壁细胞即为单核/巨噬细胞(如图2所示)。

3、迟钝爱德华菌感染单核/巨噬细胞

(1)将单核/巨噬细胞的培养基更换为无抗生素的dmem+5％fbs培养基，在24孔培养板中培养1h后加入单核/巨噬细胞10倍数量的迟钝爱德华菌；

(2)将24孔培养板用封口膜封好后，于20℃，1000g×g条件下离心10min，增加迟钝爱德华菌与单核/巨噬细胞的接触，最后于26℃培养40min。

取出24孔培养板，显微镜下观察，结果见图3，由图3可知，迟钝爱德华菌覆盖在单核/巨噬细胞表面。

(3)吸除培养基，用无菌pbs缓冲液反复洗涤感染后的单核/巨噬细胞8次，培养基更换为dmem+5％fbs+100ug/ml庆大霉素，200ul/孔，于26℃培养1h，杀死胞外的迟钝爱德华菌。

4、自然杀伤细胞与迟钝爱德华菌感染的单核/巨噬细胞共孵育

(1)将制得的自然杀伤细胞用dmem+5％fbs+100ug/ml庆大霉素的培养基重悬细胞，用血球计数板计数后，将自然杀伤细胞与感染后的单核/巨噬细胞以不同比例种入24孔培养板，200ul/孔，共孵育4h；

(2)4h后吸取上清，用无菌pbs缓冲液反复洗涤细胞5次，向剩余细胞中加入1％tritonx-100，200ul/孔，裂解细胞5min，显微镜下可明显看到细胞破裂，然后用100ul的移液器反复吹打培养皿底部，吸取100ul/孔裂解后的液体加入1ml无菌pbs缓冲液中，涡旋混匀；

(3)每个样品取100ul接种到无抗生素的lb平板上，37℃培养过夜，然后统计各平板的菌落数。

添加有il-2的为实验组，无il-2的为对照组，共孵育后受感染的单核/巨噬细胞的平板菌落结果见图4，柱形图结果见图5。

由图4和图5可知，添加了il-2后，受感染的单核/巨噬细胞的菌落数量明显低于对照组，说明il-2诱导产生的自然杀伤细胞，对迟钝爱德华菌感染的单核/巨噬细胞具有杀伤作用，根据共孵育后菌落数目多少便可判断其杀伤能力大小，该方法简单有效，可准确判断自然杀伤细胞对感染后的单核/巨噬细胞的杀伤能力。