本发明涉及基因检测技术领域,尤其涉及一种遗传性心律失常的基因检测文库的构建方法和试剂盒。
背景技术:
遗传性心律失常(inheritedarrhythmia,dcm)是一组有潜在恶性心律失常致晕厥或猝死风险的遗传性疾病,大部分由参与调控心脏动作电位的离子通道基因突变引起的。主要的疾病分类包括长qt综合征(longqtsyndrome,lqts),brugada综合征(brugadasyndrome,brs),儿茶酚胺敏感性室性心动过速(catecholaminergicpolymorphicventriculartachycardia,cpvt)、短qt综合征(shortqtsyndrome,sqts),特发性心室颤动(idiopathicventricularfibrillation,ivf)和进行性心脏传导系统疾病(progressivecardiacconductiondisease,pccd)。这些疾病患者的心脏结构大多正常,又具有猝死的高风险,极大的增加了其诊治难度。这种情况下,基因检测就显示出无可比拟的优势,可在患者症状表现完全之前就明确诊断,且可以提供一定程度上的临床指导。
遗传性心律失常中,较为常见的为lqts,其发病率约为1/2000。约80%-90的lqts患者可以找到明确的致病突变,主要集中在编码钾离子和钠离子通道的基因上。lqts的主要临床症状包括发生晕厥、室性心动过速造成心源性猝死、典型的尖端扭转等。不同基因突变导致的不同类型的lqts具有不同的发作特征性:由kcnq1突变引起的lqt1通常在身体或精神压力下发作,由kcnh2突变引起的lqt2通常在休息或突发噪音的情况下发作,由scn5a突变引起的lqt3通常在休息或睡眠时发作。另外,致病突变还可以指导不同类型lqts的药物治疗。比如目前对于致命性心律失常发作和猝死最有效的药物——β受体阻滞剂,对于lqt1,lqt2和lqt3患者的保护作用依次减弱;而钠离子通道拮抗剂对lqt3患者有明显作用,而补钾治疗对于lqt1和lqt2患者的作用最好。
kcnq1(potassiumvoltage-gatedchannelsubfamilyqmember1)该基因编码钾离子通道门一个基因。该蛋白可与另外两种钾通道蛋白kcne1和kcne3形成异聚体。该基因的突变与遗传性长qt综合征1、jervell和lange-nielsen综合征以及家族性房颤有关。
kcnh2(potassiumvoltage-gatedchannelsubfamilyhmember2)该基因编码一个eag家族的电压激活钾离子通道相关蛋白。该基因突变可导致长qt综合征2型(lqt2)。
scn5a(sodiumvoltage-gatedchannelalphasubunit5)基因负责编码钠通道蛋白的ɑ亚单位(nav1.5),nav1.5调控着心肌细胞的钠内流。nav1.5除影响到钠内流和细胞除极外,还和诸多的心肌细胞骨架蛋白、肌节蛋白相互联系,因而,scn5a基因突变导致的nav1.5结构的异常,不但会引起心脏节律的异常,还可导致心脏结构的异常。该基因的缺陷是长qt综合征3型(lqt3)的原因之一,这是一种常染色体显性心脏病。
ryr2(ryanodinereceptor2)该基因编码在心肌肌浆网中发现的ryanodine受体。编码蛋白是钙通道的组成部分之一,由ryanodine受体蛋白的四聚体和fk506结合蛋白1b蛋白的四聚体组成,它们向心肌提供钙。该基因的突变与应力诱导的多态性室性心动过速和心律失常性右心室发育不良有关。
casq2(calsequestrin2)该基因编码的蛋白是钙黄酮家族的心肌家族成员。钙黄素定位于心脏和缓慢骨骼肌细胞的肌浆网。这种蛋白质是一种钙结合蛋白,储存钙用于肌肉功能。该基因的突变导致应力诱导的多态性室性心动过速,也称为儿茶酚胺多态性室性心动过速2(cpvt2),是一种以双向室性心动过速为特征的疾病,可能导致心脏骤停。
trdn(triadin)该基因编码包含单个跨膜结构域的完整膜蛋白。由于类似的蛋白在兔的骨骼肌兴奋-收缩耦合中发挥作用,作为钙释放复合物的一部分,与ryanodine受体有关。另外,该基因还发现了编码多种亚型的剪接转录本变体,该基因中的单核苷酸多态性可能是iga肾炎的标志物。
calm1(calmodulin1)该基因编码ef-hand钙结合蛋白家族的成员。它是编码相同的钙结合蛋白的三个基因之一,钙结合蛋白是磷酸化酶激酶的四个亚基之一。在7号染色体和x染色体上发现了两个伪基因,并发现了编码不同亚型的多个转录本变体。calm1基因编码钙调蛋白激酶,有研究发现一种突变与儿茶酚胺介导的心律失常发生共分离。
传统的sanger测序技术检测kcnh2、kcnq1、scn5a、ryr2、casq2、trdn、calm1基因的编码氨基酸的外显子区域及附近内含子区域的基因突变存在很大局限性,表现在:检测通量受到限制,该方法仅适用于少数明确突变热点的检测,而对于候选基因数量多且为候选基因的全部编码区段时难以实现的。需要消耗大量时间,且对于待检测样本的基因组dna消耗巨大,在实践中同一样本难以获得满足检测需求的足量dna。因而在日常实践中难以采用sanger方法进行多基因全部编码区段的检测需求。
采用高通量基因测序技术检测kcnh2、kcnq1、scn5a、ryr2、casq2、trdn、calm1的基因突变,需要进行测序前样本文库的制备。如在样本文库制备过程中采用多重pcr方法进行目标区域扩增,会存在扩增偏向性,导致目标区域扩增不均,而对后续测序数据产生偏向性影响。
因此,有必要寻找一种新的检测遗传性心律失常的基因突变的方法,提高诊断准确率,降低成本和劳动强度。
技术实现要素:
为了解决上述技术问题,本发明的目的在于提供一种遗传性心律失常的基因检测文库的构建方法,该方法建库步骤简便快速,变异类型全面、待测目标区域覆盖完全、测序数据无偏向性、可同时对多个样本进行检测通量高。
本发明的另一目的是提供该方法获得的遗传性心律失常的基因检测文库。
本发明的另一目的是提供所述文库制备的遗传性心律失常的基因检测试剂盒。
为实现上述目的,本发明提供了一种遗传性心律失常的基因检测文库,涉及kcnh2、kcnq1、scn5a、ryr2、casq2、trdn、calm1的基因突变。为保证目标区域全部覆盖,制备文库后采用杂交探针捕获的方法获得目标区域文库,而后采用lmpcr方法扩增文库,再进行文库纯化得到测序基因检测文库。
本发明的一种遗传性心律失常的基因检测文库的构建方法,包括如下步骤:
(1)dna质量标准:提供受试者样本的基因组dna,经过核酸提取、质检后,要求dna符合一定质控标准;
(2)文库制备:将上述符合标准基因组dna,超声随机打断至180bp-220bp短片段,然后进行末端补平加a,连接接头,并通过pcr扩增达到一定总量的dna文库,该文库满足illumina测序平台专用测序要求;
(3)杂交捕获:将步骤2得到的dna文库,与疾病相关定制探针进行特异性杂交,捕获含目的区域的文库,再通过磁珠抓取、富集留下含目的区域的dna文库,即得目标区域文库;
(4)lmpcr扩增:将步骤3得到的目标区域文库,作为lmpcr模板,加入与测序接头匹配的引物及相应试剂,进行扩增;扩增后加入磁珠纯化,即得纯化文库;
(5)文库质控:将步骤4得到的纯化文库进行质控,选择qubit3.0进行定量检测,agilent2100或agilent4200进行定性检测,查看文库片段分布是否符合要求。
本发明上述的遗传性心律失常的基因检测文库构建方法,所述目标区域包含以下基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp):kcnh2、kcnq1、scn5a、ryr2、casq2、trdn、calm1。
上述步骤(1)中所述的核酸提取的样本类型包括但不限于外周血、组织器官样本等,优选核酸样本为新鲜外周血。
上述步骤(1)中所述的dna质控标准为,dna完整性较好,无蛋白rna污染,dna浓度≥20ng/μl;dna纯度:od260/2801.8-2.0,od260/230>2.0;dna总起始量:0.1ug-1ug。
上述步骤(1)中所述的核酸提取方法、dna质控方法均按照现有技术的操作规程进行。
上述步骤(2)中将符合标准的基因组dna进行超声随机打断,超声打断的反应体系及反应条件见表1。
表1超声打断的反应体系及反应条件
上述步骤(2)中所述的末端补平加a的反应是指dna随机片段化至180-220bp,通过5'→3'聚合酶及3'→5'外切酶作用,进行末端补平,同时5'端进行磷酸化,其次3'加a,以便和测序接头进行连接。反应体系及反应条件见表2。
表2末端补平加a的反应体系及反应条件
上述步骤(2)中所述连接接头反应包括连接接头反应、消化反应、及纯化反应。进一步说明,所述的接头是指在dna片段两端连接通用接头,结构为发夹环状接头,以此来提高接头连接效率。
所述的消化反应是指连接接头反应后加入消化酶反应。
所述纯化反应是指消化后的dna文库中加入ampurexp纯化磁珠进行片段选择,先加入部分磁珠吸附后留取上清,磁珠吸附大片段丢弃,再加入部分磁珠正常纯化洗脱,即可。
所述步骤(2)的连接接头的反应体系及反应条件件表3
表3连接接头的反应体系及反应条件
测序接头序列:5′-/5phos/gatcggaagagcacacgtctgaactccagtc/index/acactctttccctacacgacgctcttccgatc*t-3′
上述步骤(2)中所述的pcr扩增反应包括pcr扩增反应及磁珠纯化,修饰后的dna片段经过纯化后,通过特定序列引物进行扩增,并引入样本标签。样本标签为6bp碱基组成,可作为样本的唯一标识。最后得到的dna文库含有和illumina测序平台芯片结合的特定序列p5、p7以及测序引物序列,其中p7端含有样本标签,长度6bp,其测序模板具体结构如下:
p5+read1测序引物+插入dna+read2测序引物+index(6bp)+p7
具体序列一端为:aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct
另一端序列为:atcggaagagcacacgtctgaactccagtcac*nnnnnn*atctcgtatgccgtcttctgcttg,其中nnnnnn代表6bp碱基样本标签。具体反应体系及反应条件见表4
表4pcr扩增的反应体系及反应条件
通用引物序列:5′-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatc*t-3′
含样本标签引物:5‘-caagcagaagacggcatacgagattgxxxxxxgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-s-t-3′
(xxxxxx表示样本标签,有6个碱基随机组合,具体如下表;-s-表示硫代磷酸修饰)见表5
表5样本标签引物序列
本发明上述步骤(3)所用探针为本发明关键之处,探针是根据与疾病相关的目标区域特异定制的,可以完整覆盖目标区域(外显子区域及外显子上下游各20碱基区域),从而提高捕获目标片段的效率,达到检测相关疾病突变位点的目的。通过一系列封闭方法,例如利用cotdna将基因组中重复序列封闭,利用特定引物序列封闭接头序列等,配制最优的杂交反应条件,反应16h-20h,进一步提高捕获目标区域的特异性,提高捕获效率。定制探针有生物素修饰,待杂交后,通过链霉亲和素标记的磁珠富集文库。
所述目标区域包含以下基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp):kcnh2、kcnq1、scn5a、ryr2、casq2、trdn、calm1。
进一步优选,本发明步骤(3)将步骤2得到的dna文库进行文库混样(样品≤6),总量至少1-1.5μg(优选1.25μg)。将不同样本标签的文库等量混合,加入样本标签对应的封闭引物试剂封闭dna,浓缩烘干至干粉,再加入杂交缓冲液(tris、edta、nacl),混匀孵育,然后加入定制探针反应,反应结束后,加入预先处理的特定磁珠纯化,富集捕获到的目的区域dna片段,反应体系及反应条件见表5。该步骤将不同样本标签样本进行混样杂交捕获,在一定程度上节省成本。
本发明上述所述的杂交反应结束后(探针与目标区域片段特异性结合),选用有链霉亲和素标记的特定磁珠,可特异性抓取有生物素标记的探针,进行纯化清洗,从而富集目标区域片段。
表5杂交反应体系组分及反应条件
所述封闭引物试剂为aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct
标签封闭引物试剂:caagcagaagacggcatacgagatnnnnnngtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct,nnnnnn于样本标签index碱基反向互补配对。
表6探针序列
本发明步骤(4)中利用lmpcr将捕获的目的区域片段进行pcr扩增以使文库总量能够满足上机测序要求,其反应体系及条件见表6:反应结束后进行磁珠纯化得到最终的上机文库。
所述的磁珠纯化方法:将dna文库加入纯化磁珠,置于磁力架上,直到溶液澄清后弃掉上清,使用乙醇清洗磁珠,离心,吸尽残余液体,干燥,加入tris-edta缓冲液,吹吸混匀,室温放置,澄清后即得纯化文库;
表7lmpcr扩增反应体系
所述p5引物序列:5'-aatgatacggcgaccaccga
所述p7引物序列:5'-caagcagaagacggcatacga
上述步骤(5)所述文库质控,要先进行定量检测,可选择qubit3.0仪器,得到文库浓度总量≥0.5ug,其次进行定性质控,可选择agilent2100/4200仪器,要求片段范围在150-500bp之间;上机测序前可进行实时荧光定量pcr进行文库定量,用与p5、p7引物特异扩增满足测序要求的文库,绘制标准曲线,确定合适的文库上机浓度。具体反应体系及反应条件按照下表8(配套仪器abi7500/7300standard)。
表8p5、p7引物扩增体系及条件
上游引物序列5'-aatgatacggcgaccaccga
下游引物序列5'-caagcagaagacggcatacga
本发明的构建方法还包括上机测序过程及数据分析过程。
本发明的一种实施方式,一种遗传性心律失常的基因检测文库的构建方法,其特包括如下步骤:
(1)核酸提取及质检:外周血样本经过核酸提取、质检后,要求其符合一定质控标准:dna完整性较好,无蛋白rna污染,dna浓度≥20ng/μl;dna纯度:od260/2801.8-2.0,od260/230>2.0;dna总起始量:0.1μg-1μg;
(2)文库制备:利用上述dna,取样后用tris-edta补至52.5μl,于covaris仪器上根据相应参数,进行超声打断,将基因组dna随机打断至180-220bp短片段;然后进行末端补平加a,反应体系为:tris-edta稀释的dna50μl,末端补平加a反应缓冲液7μl,末端补平加a酶混合液3μl,合计60μl,反应条件为:20℃保持30min,65℃保持30min,最后保持4℃;再进行接头连接,反应体系为末端补平的dna60μl,连接反应缓冲液及连接酶30μl,测序接头2.5μl,高浓度mg2+缓冲液1μl,合计93.5μl,反应条件:20℃保持15min,并保持20℃;反应结束后,加入3μluser消化酶,37℃保持15min;反应结束后,加入ampurexp纯化磁珠进行片段选择,先加入45μl磁珠吸附后留取上清,磁珠吸附大片段丢弃,再加入15μl磁珠正常纯化洗脱;最后以纯化的dna为模板进行pcr扩增,反应体系为:dna模板20μl,2xpcr扩增反应酶及缓冲液25μl,通用引物2.5μl,含样本标签引物2.5μl,合计50μl,反应条件为:98℃保持30s,然后进行4个循环,每个循环为98℃保持10s,65℃保持75s,然后65℃保持5min,最后保持在10℃;结束后加入90μl磁珠进行纯化;
(3)杂交捕获:进行文库混样,将带有不同样本标签的文库,等量进行混合(不超过6个样本),总量需要达到1.25ug;混匀后取样1ug,加入样本标签对应的封闭引物试剂2μl,封闭dna5ug,真空浓缩仪60℃浓缩烘干至干粉;再加入2x杂交缓冲液7.5μl,杂交试剂a3μl,混匀95℃孵育10min,然后加入定制探针4.5μl,混匀后热盖57℃,反应47℃孵育16h-20h;反应结束后,加入100μl预先处理的特定磁珠,富集捕获到的目的区域dna片段;
(4)lmpcr扩增:将步骤(3)获得的杂交捕获富集的dna作为模板,配制反应体系:模板20μl,2xpcr反应酶及缓冲液25μl,p5p7引物5μl,反应条件:98℃保持45s,然后进行14个循环,每个循环为98℃保持15s,60℃保持30s,72℃保持30s,然后72℃保持1min,最后保持在4℃;反应结束后加入90μl磁珠纯化得到最终上机测序文库;
(5)将步骤(4)中获得的最终文库按照以下方法进行质控:取样1μl,使用qubithsdsdna试剂盒定量,得到文库浓度;根据定量浓度进行合理稀释,在agilent2100或者4200仪器,选择合适的试剂进行检测,核查文库片段分布范围;上机前,使用荧光定量pcr方法进行有效模板定量,梯度稀释标准品分别是20pm,2pm,0.2pm,0.002pm,0.0002pm,0.00002pm;将样本文库稀释至2-10pm,按照下述配制试剂:2×sybrgreenmastermix25μl、p5p7引物2μl、无核酸酶水4μl,样本标准品4μl;反应条件(abi7500):95℃保持5min,然后35个循环,每个循环95℃保持30sec,60℃保持45s,熔解曲线95℃保持15s,60℃保持60s,95℃15s;
(6)上机测序:根据定量浓度,确定上机最终浓度,于nextseq550ar测序仪上上机,按照仪器操作规程进行测序,使用nextseq500/550midoutputkitv2(300cycles);然后将数据上传服务器,由遗传咨询师对得到的数据进行分析及解读。
本发明的另一技术方案是该方法获得的遗传性心律失常的基因检测文库。
本发明的另一技术方案是所述文库制备的遗传性心律失常的基因检测试剂盒,其包括文库构建试剂、杂交探针序列、引物序列。
本发明所述的构架试剂包括:tris-edta稀释液、末端补平加a反应缓冲液、末端补平加a酶混合液、连接反应缓冲液及连接酶、高浓度mg2+缓冲液、pcr扩增反应酶及缓冲液、封闭引物试剂、杂交缓冲液、杂交试剂a。
所述的杂交探针序列包括seqidno1至seqidno255。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1、本发明的文库采用高通量测序探针杂交捕获的方法检测kcnh2、kcnq1、scn5a、ryr2、casq2、trdn、calm1的基因突变,探针针对目标区域进行定制,充分考虑目标区域的覆盖比例,保证突变的有效捕获,使之变异类型全面,准确率高,灵敏度高。同时可以选择一捕多个样本,节省了成本。
2、该文库涵盖了心律失常的相关基因,结合illumina高通量测序仪,可快速准确得到相关基因变异,对遗传性心律失常有重要意义。
3、所用探针为本发明关键之处,探针是根据与疾病相关的目标区域特异定制的,可以完整覆盖目标区域(外显子区域及外显子上下游各20碱基区域),从而提高捕获目标片段的效率,达到检测相关疾病突变位点的目的。通过一系列封闭方法,例如利用cotdna将基因组中重复序列封闭,利用特定引物序列封闭接头序列等,配制最优的杂交反应条件,反应16h-20h,进一步提高捕获目标区域的特异性,提高捕获效率。定制探针有生物素修饰,待杂交后,通过链霉亲和素标记的磁珠富集文库。
4、本发明的文库避免了多重pcr法扩增目标区域,避免pcr引入的碱基错配,同时通用于不同的复杂dna样本。
5、本发明的文库依托于illumina高通量测序平台,检测通量大大提高。
附图说明
图1是根据本发明的方法构建的外周血dna文库2100生物分析仪检测结果。
图2是根据本发明的文库构建及测定流程图。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示,否则在整个说明书和权利要求书中,术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分,而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1
采用4个外周血样本样本进行文库构建,采用包含kcnh2、kcnq1、scn5a、ryr2、casq2、trdn、calm1基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)作为目标区域的引物池进行多重反应pcr,并结合高通量测序平台miseq进行dna测序,然后检测点突变(snp)、小片段插入缺失(indel)。具体操作流程如下:
(1)核酸提取及质检:外周血样本经过核酸提取、质检后,要求其符合一定质控标准:dna完整性较好,无蛋白rna污染,dna浓度≥20ng/μl;dna纯度:od260/2801.8-2.0,od260/230>2.0;dna总起始量:0.1μg-1μg。
(2)文库制备:利用上述dna,取样后用tris-edta补至52.5μl,于covaris仪器上根据相应参数,进行超声打断,将基因组dna随机打断至180-220bp短片段。然后进行末端补平加a,反应体系为:tris-edta稀释的dna50μl,末端补平加a反应缓冲液7μl,末端补平加a酶混合液3μl,合计60μl,反应条件为:20℃保持30min,65℃保持30min,最后保持4℃;再进行接头连接,反应体系为末端补平的dna60μl,连接反应缓冲液及连接酶30μl,测序接头2.5μl,高浓度mg2+缓冲液1μl,合计93.5μl,反应条件:20℃保持15min,并保持20℃;反应结束后,加入3μluser消化酶,37℃保持15min;反应结束后,加入ampurexp纯化磁珠进行片段选择,先加入45μl磁珠吸附后留取上清(磁珠吸附大片段丢弃),再加入15μl磁珠正常纯化洗脱。最后以纯化的dna为模板进行pcr扩增,反应体系为:dna模板20μl,2xpcr扩增反应酶及缓冲液25μl,通用引物2.5μl,含样本标签引物2.5μl,合计50μl。反应条件为:98℃保持30s;然后进行4个循环,每个循环为98℃保持10s,65℃保持75s;然后65℃保持5min;最后保持在10℃。结束后加入90μl磁珠进行纯化。
(3)杂交捕获:进行文库混样,将带有不同样本标签的文库,等量进行混合(不超过6个样本),总量需要达到1.25ug。混匀后取样1ug,加入样本标签对应的封闭引物试剂2μl,封闭dna5ug,真空浓缩仪60℃浓缩烘干至干粉。再加入2x杂交缓冲液7.5μl,杂交试剂a3μl,混匀95℃孵育10min,然后加入定制探针4.5μl,混匀后热盖57℃,反应47℃孵育16h-20h。反应结束后,加入100μl预先处理的特定磁珠,富集捕获到的目的区域dna片段。
(4)lmpcr扩增:将步骤(3)获得的杂交捕获富集的dna作为模板,配制反应体系:模板20μl,2xpcr反应酶及缓冲液25μl,p5p7引物5μl。反应条件:98℃保持45s;然后进行14个循环,每个循环为98℃保持15s,60℃保持30s,72℃保持30s;然后72℃保持1min;最后保持在4℃。反应结束后加入90μl磁珠纯化得到最终上机测序文库。
(5)将步骤(4)中获得的最终文库按照以下方法进行质控:取样1μl,使用qubithsdsdna试剂盒定量,得到文库浓度。根据定量浓度进行合理稀释,在agilent2100或者4200仪器,选择合适的试剂进行检测,核查文库片段分布范围。上机前,使用荧光定量pcr方法进行有效模板定量,梯度稀释标准品分别是20pm,2pm,0.2pm,0.002pm,0.0002pm,0.00002pm。将样本文库稀释至2-10pm,按照下述配制试剂:2×sybrgreenmastermix25μl、p5p7引物2μl、无核酸酶水4μl,样本(标准品)4μl。反应条件(abi7500):
95℃保持5min;然后35个循环,每个循环95℃保持30sec,60℃保持45s;熔解曲线95℃保持15s,60℃保持60s,95℃15s。
(6)上机测序:根据定量浓度,确定上机最终浓度,于miseq测序仪上上机,按照仪器操作规程进行测序,使用miseqreagentmicrokit(300cycles)。然后将数据上传服务器,由遗传咨询师对得到的数据进行分析及解读。数据见下表9。
表94个样本的测序结果与已知结果100%一致
实施例2
采用16个口腔拭子样本进行文库构建,采用包含kcnh2、kcnq1、scn5a、ryr2、casq2、trdn、calm1基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)作为目标区域的引物池进行多重反应pcr,并结合高通量测序平台nextseq550ar进行dna测序,然后检测点突变(snp)、小片段插入缺失(indel)。具体操作流程如下:
(1)核酸提取及质检:外周血样本经过核酸提取、质检后,要求其符合一定质控标准:dna完整性较好,无蛋白rna污染,dna浓度≥20ng/μl;dna纯度:od260/2801.8-2.0,od260/230>2.0;dna总起始量:0.1μg-1μg。
(2)文库制备:利用上述dna,取样后用tris-edta补至52.5μl,于covaris仪器上根据相应参数,进行超声打断,将基因组dna随机打断至180-220bp短片段。然后进行末端补平加a,反应体系为:tris-edta稀释的dna50μl,末端补平加a反应缓冲液7μl,末端补平加a酶混合液3μl,合计60μl,反应条件为:20℃保持30min,65℃保持30min,最后保持4℃;再进行接头连接,反应体系为末端补平的dna60μl,连接反应缓冲液及连接酶30μl,测序接头2.5μl,高浓度mg2+缓冲液1μl,合计93.5μl,反应条件:20℃保持15min,并保持20℃;反应结束后,加入3μluser消化酶,37℃保持15min;反应结束后,加入ampurexp纯化磁珠进行片段选择,先加入45μl磁珠吸附后留取上清(磁珠吸附大片段丢弃),再加入15μl磁珠正常纯化洗脱。最后以纯化的dna为模板进行pcr扩增,反应体系为:dna模板20μl,2xpcr扩增反应酶及缓冲液25μl,通用引物2.5μl,含样本标签引物2.5μl,合计50μl。反应条件为:98℃保持30s;然后进行4个循环,每个循环为98℃保持10s,65℃保持75s;然后65℃保持5min;最后保持在10℃。结束后加入90μl磁珠进行纯化。
(3)杂交捕获:进行文库混样,将带有不同样本标签的文库,等量进行混合(不超过6个样本),总量需要达到1.25ug。混匀后取样1ug,加入样本标签对应的封闭引物试剂2μl,封闭dna5ug,真空浓缩仪60℃浓缩烘干至干粉。再加入2x杂交缓冲液7.5μl,杂交试剂a3μl,混匀95℃孵育10min,然后加入定制探针4.5μl,混匀后热盖57℃,反应47℃孵育16h-20h。反应结束后,加入100μl预先处理的特定磁珠,富集捕获到的目的区域dna片段。
(4)lmpcr扩增:将步骤(3)获得的杂交捕获富集的dna作为模板,配制反应体系:模板20μl,2xpcr反应酶及缓冲液25μl,p5p7引物5μl。反应条件:98℃保持45s;然后进行14个循环,每个循环为98℃保持15s,60℃保持30s,72℃保持30s;然后72℃保持1min;最后保持在4℃。反应结束后加入90μl磁珠纯化得到最终上机测序文库。
(5)将步骤(4)中获得的最终文库按照以下方法进行质控:取样1μl,使用qubithsdsdna试剂盒定量,得到文库浓度。根据定量浓度进行合理稀释,在agilent2100或者4200仪器,选择合适的试剂进行检测,核查文库片段分布范围。上机前,使用荧光定量pcr方法进行有效模板定量,梯度稀释标准品分别是20pm,2pm,0.2pm,0.002pm,0.0002pm,0.00002pm。将样本文库稀释至2-10pm,按照下述配制试剂:2×sybrgreenmastermix25μl、p5p7引物2μl、无核酸酶水4μl,样本(标准品)4μl。反应条件(abi7500):
95℃保持5min;然后35个循环,每个循环95℃保持30sec,60℃保持45s;熔解曲线95℃保持15s,60℃保持60s,95℃15s。
(6)上机测序:根据定量浓度,确定上机最终浓度,于nextseq550ar测序仪上上机,按照仪器操作规程进行测序,使用nextseq500/550midoutputkitv2(300cycles)。然后将数据上传服务器,由遗传咨询师对得到的数据进行分析及解读。数据见下表10。
表1016个样本的测序结果与已知结果100%一致
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式,并且很显然,根据上述教导,可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用,从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110>北京安智因生物技术有限公司
<120>一种遗传性心律失常的基因检测文库的构建方法及其试剂盒
<160>255
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t61
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ac62
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tctgca66
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tcagaagatgatattaaaggcc82
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cttc64
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catc64
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cgttct66