一种用于生产高粘度黄原胶的工程菌及其构建方法与应用与流程

本发明涉及黄原胶生产领域，通过对生产菌野油菜黄单胞菌xanthomonascampestris进行遗传改造，提高黄原胶产品性能。
背景技术：
：黄原胶(xanthangum)是由野油菜黄单胞杆菌(xanthomonascampestris)产生的胞外酸性杂多糖的统称，又名汉生胶、苫顿胶等，为一种高分子量的天然碳水化合物，是目前产量最大的微生物多糖。黄原胶分子的骨架具有五糖的单元结构，由二分子d-葡萄糖、二分子d-甘露糖和一分子d-葡萄糖醛酸组成。黄原胶具增稠性、假塑流变性、水溶性、悬浮性、乳化稳定性、耐酸耐碱、抗盐、抗温、优良的兼容性等特性，广泛应用于化工、食品、采油、印染、造纸、纺织、陶瓷、涂料、医药等行业。目前，黄原胶作为增稠剂、悬浮剂广泛应用于食品、石油等行业。提高黄原胶粘度，可在减少黄原胶使用量的情况下保持相同粘度或更高粘度，降低使用成本。已有研究表明：黄原胶发酵液热处理可导致黄原胶天然构象发生改变，产生高粘度黄原胶，但热处理会导致黄原胶降解。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是如何提高黄原胶粘度。为了解决上述技术问题，本发明首先提供一种产黄原胶的工程菌的构建方法。本发明提供的产黄原胶的工程菌的构建方法包括如下步骤：提高野油菜黄单胞菌xanthomonascampestris中gume蛋白质的表达量和/或活性。上述产黄原胶的工程菌的构建方法中，所述提高野油菜黄单胞菌xanthomonascampestris中gume蛋白质的表达量和/或活性的方法为在野油菜黄单胞菌xanthomonascampestris中过表达gume蛋白质。进一步的，所述过表达的方法为将编码gume蛋白质的核酸分子导入野油菜黄单胞菌xanthomonascampestris中。更进一步的，所述编码gume蛋白质的核酸分子通过pbbad-e质粒导入野油菜黄单胞菌xanthomonascampestris中。所述pbbad-e质粒为将seqidno.4所示的gume基因片段替换pbbad载体的kpni和psti酶切位点之间的片段(包括kpni和psti酶切位点序列)，且保持pbbad载体的其他序列不变后得到的质粒。上述产黄原胶的工程菌的构建方法中，所述gume蛋白质为如下c1)或c2)：c1)由seqidno.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c2)将seqidno.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有gume蛋白质活性的由c1)衍生的蛋白质。上述产黄原胶的工程菌的构建方法中，所述编码gume蛋白质的核酸分子为如下c1)或c2)或c3)：c1)seqidno.4所示的cdna分子或基因组dna分子；c2)在严格条件下与c1)限定的dna分子杂交且编码所述gume蛋白质的cdna分子或基因组dna分子；c3)与c1)或c2)限定的dna分子具有90％以上的同一性且编码所述gume蛋白质的cdna分子或基因组dna分子。上述产黄原胶的工程菌的构建方法中，所述野油菜黄单胞菌xanthomonascampestris可为现有技术中常见的用于生产黄原胶的野油菜黄单胞菌xanthomonascampestris，如xanthomonascampestrisnrrlb-1459(atcc编号为13951)、xanthomonascampestrispv.campestrisb100等。在本发明的具体实施例中，所述野油菜黄单胞菌xanthomonascampestris为atcc编号为33913的野油菜黄单胞菌xanthomonascampestrispv.campestris。为了解决上述技术问题，本发明又提供了如下(1)-(3)任一所述的生物材料：(1)采用上述产黄原胶的工程菌的构建方法构建得到的产黄原胶的工程菌；(2)上述编码gume蛋白质的核酸分子；(3)含有(2)所述的编码gume蛋白质的核酸分子的表达盒、重组载体和重组菌。为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述生物材料的新用途。本发明提供了上述生物材料在生产黄原胶中的应用。本发明还提供了上述生物材料在生产高粘度黄原胶中的应用。本发明还提供了上述生物材料在提高黄原胶粘度中的应用。为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种生产黄原胶的方法。本发明提供的生产黄原胶的方法包括如下步骤：将采用上述产黄原胶的工程菌的构建方法构建得到的工程菌进行发酵培养，得到发酵产物，从所述发酵产物中制得黄原胶。上述生产黄原胶的方法中，所述工程菌在发酵培养前还包括如下步骤：挑取工程菌至斜面培养基上划线，28℃培养2d。然后将所述工程菌接种至种子培养基中，28℃，200rpm培养至od600＝1.2-1.5，得到培养物。再将所述培养物转接至新鲜种子培养基中，28℃，200rpm培养至od600＝0.8-1.0，得到种子液。所述斜面培养基的溶剂为水，溶质组成及其终浓度如下：蔗糖10g/l、蛋白胨5g/l、牛肉膏3g/l、酵母膏0.5g/l、nacl2g/l、琼脂20g/l，调整ph至7.0。所述种子培养基的溶剂为水，溶质组成及其终浓度如下：葡萄糖10g/l、蛋白胨5g/l、牛肉膏3g/l、酵母膏0.5g/l、nacl1g/l，调整ph至7.0。所述种子培养基还含有庆大霉素，所述庆大霉素在所述种子培养基中的浓度为15μg/ml。上述生产黄原胶的方法中，所述发酵培养的方法包括如下步骤：将所述种子液、阿拉伯糖、庆大霉素添加至发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵产物。进一步的，所述阿拉伯糖在发酵培养体系中的质量分数可为(0.01-0.2)％，具体可为0.05％。所述庆大霉素在发酵培养体系中的浓度可为(5-30)μg/ml，具体可为15μg/ml。所述种子液与所述发酵培养基的体积比可为1:(5-20)，具体可为1:9。更进一步的，所述发酵培养基的溶剂为水，溶质组成及其终浓度如下：淀粉40g/l、豆粉0.6g/l、caco32g/l，调整ph至7.0。上述生产黄原胶的方法中，所述发酵培养的条件如下：(25-30)℃条件下发酵培养(80-130)h，具体可为ph＝7、通气5l/min、溶氧30％、28℃条件下发酵培养130h。上述生产黄原胶的方法中，从所述发酵产物中制得黄原胶包括如下步骤：用蒸馏水稀释发酵产物，离心，收集上清液；向所述上清液中加入无水乙醇，搅拌至出现絮状沉淀；过滤收集所述絮状沉淀，并将所述絮状沉淀依次进行干燥和粉碎，得到所述黄原胶。进一步的，用蒸馏水稀释所述发酵产物4-8倍，离心，收集上清液；向所述上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，搅拌至出现絮状沉淀。更进一步的，所述离心的条件可为12000rpm离心30min。所述干燥的条件可为60℃干燥2-3h。所述粉碎后过80目筛子得到所述黄原胶。本发明提供了用于生产黄原胶的工程菌的构建方法，其包括如下步骤：提高野油菜黄单胞菌xanthomonascampestris中gume蛋白质的表达量和/或活性。本发明通过对生产菌野油菜黄单胞菌进行遗传改造，提高了与黄原胶聚合相关的蛋白质的表达量，使生产得到的黄原胶粘度提高，成功实现通过基因工程的手段来获得高粘度黄原胶产品。附图说明图1为pbbad-e质粒图谱。图2为不同黄原胶样品粘度测定结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的菌株和质粒如表1中所示。野油菜黄单胞菌xanthomonascampestrispv.campestrisatcc33913(xanthomonascampestrispv.campestrisatcc33913，简称atcc33913)购自于美国模式培养物集存库(americantypeculturecollection，简称atcc)，atcc编号为33913。质粒pbbad是基因过表达所用质粒，为广泛宿主载体，含有pbbr1mcs-5复制子，在野油菜黄单胞菌中表达庆大霉素抗性基因，其具有来源于e.coli的阿拉伯糖诱导启动子，其核苷酸序列如seqidno.1所示。质粒pbbad-e是过表达gume基因所用质粒，其核苷酸序列如seqidno.2所示。表1、细菌菌株与质粒菌株或质粒相关特征菌株atcc33913野生型atcc33913eatcc33913/pbbad-ee.colidh5α常用克隆宿主菌株质粒pbbadgmr，阿拉伯糖诱导启动子pbbad-e衍生自pbbad，gume阿拉伯糖诱导过表达载体下述实施例中的培养基配方如下：nygb液体培养基的溶剂为水，溶质组成及其终浓度如下：蛋白胨5g/l、酵母提取物3g/l、甘油20g/l。nygb固体培养基是将琼脂与nygb液体培养基混匀得到的，琼脂在nygb固体培养基中的终浓度为20g/l。斜面培养基的溶剂为水，溶质组成及其终浓度如下：蔗糖10g/l、蛋白胨5g/l、牛肉膏3g/l、酵母膏0.5g/l、nacl2g/l、琼脂20g/l，调整ph至7.0。种子培养基的溶剂为水，溶质组成及其终浓度如下：葡萄糖10g/l、蛋白胨5g/l、牛肉膏3g/l、酵母膏0.5g/l、nacl1g/l，调整ph至7.0。发酵培养基的溶剂为水，溶质组成及其终浓度如下：淀粉40g/l、豆粉0.6g/l、caco32g/l，调整ph至7.0。下述实施例中所使用的引物如表2所示。表2、本发明所用引物引物序列编码描述e1gaggaattaaccatgctgattcaaatgagcgagcaggcggume引物e2gccgcgcggcaccagtcaccgcggcgctcctgcgume引物实施例1、用于生产高粘度黄原胶的工程菌的构建一、过表达质粒pbbad-e的构建以atcc33913基因组dna为模板，采用表2中的引物e1和e2进行pcr扩增，得到gume基因片段。然后用南京诺唯赞公司的快速克隆试剂盒clonexpressmultisonestepcloningkit将gume基因片段与经kpni和psti酶切的pbbad载体连接，构建得到gume基因过表达质粒pbbad-e。gume基因过表达质粒pbbad-e表达gume蛋白质。gume蛋白质的氨基酸序列如seqidno.3所示。对pbbad-e质粒进行测序验证。测序结果表明：pbbad-e质粒为将seqidno.4所示的gume基因序列替换pbbad载体的kpni和psti酶切位点之间的序列(包括kpni和psti酶切位点序列)，且保持pbbad载体的其他序列不变后得到的质粒。二、用于生产高粘度黄原胶的工程菌的构建1、atcc33913电转感受态细胞的制备按照如下步骤制备atcc33913电转感受态细胞：1)将atcc33913在nygb固体培养基上划线，28℃倒置培养2天；2)挑取单菌落，接种于4mlnygb液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜；3)培养液转接到50mlnygb液体培养基中，接种量为1％，28℃，200rpm振荡培养至对数生长中期(od600＝0.8～0.9)；4)冰浴冷却10min，4℃离心收集菌体；5)菌体用冰预冷的无菌的10％的甘油洗三次，弃上清；6)最后一次弃去上清后，用1ml体积分数为10％的甘油重悬细菌；7)按每管100μl/管分装，保存于-80℃备用。2、过表达质粒pbbad-e电击转化atcc33913将步骤1制备的atcc33913电转感受态细胞置于冰上融化，加入适量的(100-300ng)步骤一构建的质粒dna(pbbad-e质粒)混匀，15kv/cm电击转化，加入900μlnygb培养基，28℃低转速复苏2h，取适量菌液涂布含有庆大霉素(15μg/ml)的nygb平板培养筛选得到阳性重组菌，将含有pbbad-e质粒的重组菌记作atcc33913e。实施例2、用于生产高粘度黄原胶的工程菌在生产黄原胶中的应用一、重组菌发酵培养制备黄原胶1、种子液的制备分别挑取atcc33913和实施例1获得的重组菌株atcc33913e至不同斜面培养基上划线，28℃培养2d；然后接种至种子培养基中(50ml培养基/500ml摇瓶)，28℃，200rpm培养至od600＝1.2-1.5，取20-25ml培养物转接至新鲜种子培养基中(500ml培养基/2000ml摇瓶)，28℃，200rpm培养至od600＝0.8-1.0，分别得到种子液。重组菌株培养基中添加庆大霉素(终浓度为15μg/ml)。2、种子液的发酵培养将500ml种子液、庆大霉素和阿拉伯糖添加至4.5l发酵培养基中(bioflo310发酵罐)，得到发酵培养体系，庆大霉素在发酵培养体系中的终浓度为15μg/ml，阿拉伯糖在发酵培养体系中的质量分数0.05％。2％naoh和2％h2so4调控ph＝7，通气5l/min，溶氧30％，将发酵培养体系在28℃下发酵培养130h，得到发酵液。野生型菌株发酵不添加庆大霉素和阿拉伯糖，发酵时间为80h。3、黄原胶样品的制备发酵液用蒸馏水稀释4-8倍，12000rpm离心30min，去除菌体，向上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，缓慢搅拌至出现絮状沉淀，过滤收集絮状沉淀，60℃干燥2-3h，粉碎并过80目筛子得到黄原胶样品。将重组菌atcc33913e发酵培养获得的黄原胶样品记作atcc33913e-gum黄原胶样品；将atcc33913发酵培养获得的黄原胶样品记作atcc33913-gum黄原胶样品。二、黄原胶粘度测定1、黄原胶溶液的配制分别取3g步骤一中制备得到的黄原胶样品和3g氯化钾，混合均匀，缓慢加入300ml去离子水中，室温，800r/min搅拌2h，分别得到质量分数为1％的黄原胶溶液。2、黄原胶粘度的测定采用brookfielddv3t粘度计分别在室温(25℃)和高温(80℃)条件下测定黄原胶水溶液粘度。检测条件如下：取适量质量分数为1％的黄原胶水溶液置于100ml高型烧杯中，分别在25℃和80℃下，选用63号转子，设定转速为6rpm，待读数稳定后记录样品粘度。atcc33913e-gum黄原胶样品的粘度测定结果如图2所示，25℃时atcc33913e-gum黄原胶样品粘度(8560mpa.s)较atcc33913-gum黄原胶样品(7580mpa.s)提高12.9％，说明增加gume表达量，可以提高黄原胶粘度。80℃时atcc33913e-gum黄原胶样品粘度(4760mpa.s)较atcc33913-gum黄原胶样品(4140mpa.s)提高15.0％，说明增加gume表达量，可以提高黄原胶耐温性。序列表<110>中国科学院天津工业生物技术研究所<120>一种用于生产高粘度黄原胶的工程菌及其构建方法与应用<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>6017<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctcgggccgtctcttgggcttgatcggccttcttgcgcatctcacgcgctcctgcggcgg60cctgtagggcaggctcatacccctgccgaaccgcttttgtcagccggtcggccacggctt120ccggcgtctcaacgcgctttgagattcccagcttttcggccaatccctgcggtgcatagg180cgcgtggctcgaccgcttgcgggctgatggtgacgtggcccactggtggccgctccaggg240cctcgtagaacgcctgaatgcgcgtgtgacgtgccttgctgccctcgatgccccgttgca300gccctagatcggccacagcggccgcaaacgtggtctggtcgcgggtcatctgcgctttgt360tgccgatgaactccttggccgacagcctgccgtcctgcgtcagcggcaccacgaacgcgg420tcatgtgcgggctggtttcgtcacggtggatgctggccgtcacgatgcgatccgccccgt480acttgtccgccagccacttgtgcgccttctcgaagaacgccgcctgctgttcttggctgg540ccgacttccaccattccgggctggccgtcatgacgtactcgaccgccaacacagcgtcct600tgcgccgcttctctggcagcaactcgcgcagtcggcccatcgcttcatcggtgctgctgg660ccgcccagtgctcgttctctggcgtcctgctggcgtcagcgttgggcgtctcgcgctcgc720ggtaggcgtgcttgagactggccgccacgttgcccattttcgccagcttcttgcatcgca780tgatcgcgtatgccgccatgcctgcccctcccttttggtgtccaaccggctcgacggggg840cagcgcaaggcggtgcctccggcgggccactcaatgcttgagtatactcactagactttg900cttcgcaaagtcgtgaccgcctacggcggctgcggcgccctacgggcttgctctccgggc960ttcgccctgcgcggtcgctgcgctcccttgccagcccgtggatatgtggacgatggccgc1020gagcggccaccggctggctcgcttcgctcggcccgtggacaaccctgctggacaagctga1080tggacaggctgcgcctgcccacgagcttgaccacagggattgcccaccggctacccagcc1140ttcgaccacatacccaccggctccaactgcgcggcctgcggccttgccccatcaattttt1200ttaattttctctggggaaaagcctccggcctgcggcctgcgcgcttcgcttgccggttgg1260acaccaagtggaaggcgggtcaaggctcgcgcagcgaccgcgcagcggcttggccttgac1320gcgcctggaacgacccaagcctatgcgagtgggggcagtcgaaggcgaagcccgcccgcc1380tgccccccgagcctcacggcggcgagtgcgggggttccaagggggcagcgccaccttggg1440caaggccgaaggccgcgcagtcgatcaacaagccccggaggggccactttttgccggagg1500gggagccgcgccgaaggcgtgggggaaccccgcaggggtgcccttctttgggcaccaaag1560aactagatatagggcgaaatgcgaaagacttaaaaatcaacaacttaaaaaaggggggta1620cgcaacagctcattgcggcaccccccgcaatagctcattgcgtaggttaaagaaaatctg1680taattgactgccacttttacgcaacgcataattgttgtcgcgctgccgaaaagttgcagc1740tgattgcgcatggtgccgcaaccgtgcggcaccctaccgcatggagataagcatggccac1800gcagtccagagaaatcggcattcaagccaagaacaagcccggtcactgggtgcaaacgga1860acgcaaagcgcatgaggcgtgggccgggcttattgcgaggaaacccacggcggcaatgct1920gctgcatcacctcgtggcgcagatgggccaccagaacgccgtggtggtcagccagaagac1980actttccaagctcatcggacgttctttgcggacggtccaatacgcagtcaaggacttggt2040ggccgagcgctggatctccgtcgtgaagctcaacggccccggcaccgtgtcggcctacgt2100ggtcaatgaccgcgtggcgtggggccagccccgcgaccagttgcgcctgtcggtgttcag2160tgccgccgtggtggttgatcacgacgaccaggacgaatcgctgttggggcatggcgacct2220gcgccgcatcccgaccctgtatccgggcgagcagcaactaccgaccggccccggcgagga2280gccgcccagccagcccggcattccgggcatggaaccagacctgccagccttgaccgaaac2340ggaggaatgggaacggcgcgggcagcagcgcctgccgatgcccgatgagccgtgttttct2400ggacgatggcgagccgttggagccgccgacacgggtcacgctgccgcgccggtagcactt2460gggttgcgcagcaacccgtaagtgcgctgttccagactatcggctgtagccgcctcgccg2520ccctataccttgtctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcga2580cctgaatggaagccggcggcacctcgctaacggattcaccgtttttatcaggctctggga2640ggcagaataaatgatcatatcgtcaattattacctccacggggagagcctgagcaaactg2700gcctcaggcatttgagaagcacacggtcacactgcttccggtagtcaataaaccggtaaa2760ccagcaatagacataagcggctatttaacgaccctgccctgaaccgacgaccgggtcgaa2820tttgctttcgaatttctgccattcatccgcttattatcacttattcaggcgtagcaccag2880gcgtttaagggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgccctgccactcatcgc2940agtcggcctgccctgccactcatcgcagtcggcctacatattctgctgacgcaccggtgc3000agccttttttctcctgccacatgaagcacttcactgacaccctcatcagtgccaacatag3060taagccagtatacactccgctagcgcgtcgacgaaaggcccagtctttcgactgagcctt3120tcgttttatttgatgcctggcagttccctactctcgcatggggagaccccacactaccat3180cggcgctacggcgtttcacttctgagttcggcatggggtcaggtgggaccaccgcgctac3240tgccgccaggcaaattctgttttatcagaccgcttctgcgttctgatttaatctgtatta3300gtggtggtggtggtggtggctgccgcgcggcaccagctgcagaccgagctcaccgaattc3360accactagtaccagatctaccctcgaggctgccgcgcggcaccaggccgctgctgtgatg3420atgatgatgatgagaggtacccatggttaattcctcctgttagcccaaaaaacgggtatg3480gagaaacagtagagagttgcgataaaaagcgtcaggtaggatccgctaatcttatggata3540aaaatgctatggcatagcaaagtgtgacgccgtgcaaataatcaatgtggacttttctgc3600cgtgattatagacacttttgttacgcgtttt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