本发明属于家畜分子生物学技术与遗传育种领域，涉及到一种包含如seqidno:4所示猪prox1基因全长cdna序列克隆，以及包含seqidno:5所示猪prox1基因近端启动子序列克隆与启动子活性分析；另外，本发明还涉及到猪prox1基因表达模式分析及影响猪肉质性状的分子标记的研发与应用。
背景技术：
：：猪肉是人们生活中动物性蛋白的主要来源，随着消费水平的提高，人们对猪肉品质的要求也相应提高，因此如何更好的改善肉质受到越来越多的关注。肉品质量(简称肉质)可用许多的技术指标评定，如肉色、ph值、系水力、肌内脂肪含量、嫩度等。肉质性状大多属于数量性状，遗传力中等偏低，由微效多基因控制。肉色是是一个重要的肉质指标，他不仅影响消费者的感官判断，而且对猪肉的内在品质和市场价格有着至关重要的影响，也是衡量猪肉质量的一个重要的经济指标。肉色的好坏直接影响到消费者的购买欲望，因此肉色对生产者与消费者来讲都是非常重要的肉质指标。过去的几十年来里，常规育种技术体系在中高遗传力性状的遗传改良上取得了长足的进展，如生长速度、饲料转化效率、胴体瘦肉率等，但对于低遗传力的肉质、繁殖等性状，利用常规育种技术体系进行遗传选育时，不仅成本高，所取得的遗传进展也非常缓慢。随着基因组学、分子生物学等领域的快速发展，分子育种技术体系，例如基因编辑技术、转基因技术、分子标记技术等可为猪低遗传力性状的遗传改良提供新的有效途径。值得注意的是，分子育种技术的应用首先需要明确哪些基因是影响经济性状的功能基因，影响目标性状的关键靶基因明确后才可能进一步开展相关分子育种工作。因此，鉴定影响猪肌肉品质的关键功能基因对利用分子育种技术进行猪肉质性状的遗传改良具有十分重要的意义。prospero-relatedhomeoboxprotein1(prox1)是一个发育相关的重要核转录因子。研究表明，prox1在骨骼肌的发育、再生以及肌纤维类型的转换中发挥着重要的调控作用。而本发明人前期在猪肉色性状全基因组转录组测序研究中发现，prox1是一个在不同肌纤维类型的骨骼肌组织中存在极显著差异的基因，而肌纤维类型的差异是影响猪肉品质的重要因素。因此，prox1是一个潜在的影响猪其他肉质性状的关键候选基因。技术实现要素：本发明首次克隆了猪prox1基因全长cdna与近端启动子序列，并通过体外启动子活性分析，确定了该基因启动子活性区，为利用prox1基因进行相关分子育种工作奠定基础；另外，本发明明确了prox1在猪不同组织及不同肌纤维类型的骨骼肌组织中的表达模式，并建立了相应的基因表达定量检测方法；除此之外，本发明通过目标区域靶向测序技术对prox1近端启动子区进行了遗传变异位点检测，并建立了prox1启动子三个关键snp的pcr-rflp基因分型方法，通过群体性状关联分析，明确了这三个遗传变异位点多态性与猪肉质性状存在显著相关。其中任何一个标记均可独立或联合其他两个标记用于猪分子标记辅助育种。本发明通过以下技术方案实现：一种与猪生产性状相关的基因prox1，该基因的cdna序列全长如seqidno：4所示。一种用于调控prox1基因表达的启动子序列，其核苷酸序列如序列表seqidno：5所示。上述的与猪生产性状相关的基因prox1在猪生产性状遗传改良中的应用。上述的启动子序列在猪生产性状遗传改良中的应用。一种与猪生产性状相关的snp标记，该snp标记为(1)～(3)中的至少一种：(1)位于序列表seqidno：5所示序列的-1421bp处的1个c/a突变，导致taqi-rflp多态性；(2)位于序列表seqidno：5所示序列的-930bp处的1个a/g突变，导致bseni-rflp多态性；(3)位于序列表seqidno：5所示序列的-1573bp处的1个c/g突变，导致hpaii-rflp多态性。上述与猪生产性状相关的snp标记在猪生产性状遗传改良中的应用。本发明首先根据ncbi数据库中下载predicted:susscrofaprox1,mrna序列(nm_001128490.1)作为种子序列seqidno：1。根据所下载的核苷酸序列分别设计扩增猪prox1基因5’末端与3’末端引物5’-race和3’-race扩增引物，利用race5’/3’kit克隆出猪的prox1cdna全长。根据5’-race的试验结果确定该基因的转录起始位点，设计扩增猪prox1不同片段长度的启动子区域，并构建相应的启动子活性分析pgl3载体，利用双荧光素酶报告系统确定启动子活性区。利用qrt-pcr技术确定猪prox1基因在不同组织、不同肌纤维类型的骨骼肌组织中的表达模式。利用目靶区域靶向测序方法对猪prox1近端启动子区进行了遗传变异位点检测。建立了prox1启动子三个关键snps的pcr-rflp基因分型方法，通过群体性状关联分析，证明三个snps可作为猪生产性状辅助选育的重要分子标记。序列表seqidno：1是ncbi数据库中所预测的猪prox1基因部分mrna序列。序列表seqidno：2是本发明所克隆的猪prox1基因5’utr核苷酸序列信息。序列表seqidno：3是本发明所克隆的猪prox1基因3’utr核苷酸序列信息。序列表seqidno：4是本发明所克隆的猪prox1基因全长cdna核苷酸序列信息。序列表seqidno：5是本发明所克隆的猪prox1基因转录起始位点前1957bp近端启动子序列信息。本发明的有益效果：本发明首次克隆了猪prox1基因全长cdna与近端启动子序列，并通过体外启动子活性分析，确定了该基因启动子活性区，为利用prox1基因进行相关分子育种工作奠定基础；本发明通过目标区域靶向测序技术对prox1近端启动子区进行了遗传变异位点检测，并建立了prox1启动子三个关键snp的pcr-rflp基因分型方法，通过群体性状关联分析，明确了这三个遗传变异位点多态性与猪肉质性状存在显著相关。其中任何一个标记均可独立或联合其他两个标记用于猪分子标记辅助育种。附图说明图1：是本发明中猪prox1基因5’race扩增片段琼脂糖电泳图。图中：m：dna分子量标准(dl5000ladder)。图2：是本发明中猪prox1基因3’race扩增片段琼脂糖电泳图。图中：m：dna分子量标准(dl5000ladder)。图3：是本发明中猪prox1基因不同长度的启动子片段双荧光素酶活性检测结果。图4：是本发明中猪prox1基因在不同组织中的表达模式。图5：是本发明中猪肉色差异表型标记基因myoglobin、myhc-i、myhc-iib、myhc-iix，以及prox1基因的表达模式。图6：是本发明猪prox1基因seqidno：5近端启动子序列-930bp处c/a变异pcr-taqi-rflp三种基因型电泳图谱。图中：m：dna分子量标准(dl2000:2000，1000，750，500，200和100bp)；1泳道：aa基因型；2泳道：ca基因型；3泳道：cc基因型。图7：是本发明猪prox1基因seqidno：5近端启动子序列-1421bp处a/g变异pcr-bseni-rflp三种基因型电泳图谱。图中：m：dna分子量标准(dl2000:2000，1000，750，500，200和100bp)；1泳道：aa基因型；2泳道：gg基因型；3泳道：ag基因型。图8：是本发明猪prox1基因seqidno：5近端启动子序列-1573bp处g/c变异pcr-hpaii-rflp三种基因型电泳图谱。图中：m：dna分子量标准(dl2000:2000，1000，750，500，200和100bp)；1泳道：cc基因型；2泳道：gc基因型；3泳道：gg基因型。具体实施方式实施例1：克隆猪prox1基因全长cdna核苷酸序列1.1、引物设计以ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中所预测的猪prox1基因mrna序列(nm_001128490.1)作为种子序列seqidno：1作为模板设计扩增引物，其中5’-race特异性引物(gsps)应该满足长度为23–28nt，gc含量在50–70％之间，与universalprimermix(race5’/3’kit试剂盒设计的通用引物，有longprimer、shortprimer两条)的3’端不互补等条件，设计满足以上条件的引物两条，分别为gsp1、ngsp1，并在其5’端增加gattacgccaagctt以方便后续试验中载体连接和测序工作。prox1基因3’-race特异性引物的设计与5’-race特异性引物类似，所设计的引物分别命名为gsp2、ngsp2，引物5’端加gattacgccaagctt。具体引物序列如(表1)所示。表1用于扩增猪prox1基因引物信息注：小写字母序列为race后续片段载体连接以及测序加的接头序列。1.2、生成race-readycdna严格根据race5’/3’kit试剂盒的步骤和要求分别配置5’-race和3’-race的cdna反应液，室温下按顺序混合后，在热盖thermalcycler中42℃孵育90min，70℃10min。反应完成后，添加90μl稀释液tricine-edtabuffer稀释第一链cdna合成反应物5’/3’-race-readycdna。1.3、5’-race和3’-race扩增5’-race扩增：使用稀释过的5’race-readycdna作为模板，以longprimer和gsp1为上下游引物，按照5’-race-readycdna2.5μl，longprimer5μl，gsp11μl，mastermix(预先混合好，包括15.5μlddh2o、25.0μl2×seqampbuffer、1.0μlseqampdnapolymerase)的pcr反应体系，进行第一轮扩增，pcr反应程序(touchdownpcr)：94℃30s，72℃3min，共5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃30min，共计5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，共计20个循环；最后4℃保存。电泳发现目标片段不明显，将第一轮扩增产物稀释50倍，以其为模板，进行巢式pcr，pcr反应体系：dna模板2μl，shortprimer0.5μl，ngsp10.5μl，ddh2o7μl，i-5tm2×high-fidelitymastermix(擎科生物)10μl。pcr反应程序：98℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸30s共30个循环；72℃后延伸7min，4℃保存。扩增产物电泳后，条带明显(图1)，对目的片段进行切胶回收，纯化后的pcr产物与pclone007vectorkit(擎科生物)载体连接，转化后对阳性克隆进行测序，获得484bp的目标序列seqidno:2。3’-race扩增：使用稀释过的第一链cdna作为模板，以longprimer和gsp2为上下游引物，按照3’-race-readycdna2.5μl，longprimer5μl，gsp21μl，mastermix(预先混合好，包括15.5μlddh2o、25.0μl2×seqampbuffer、1.0μlseqampdnapolymerase)的pcr反应体系，进行第一轮扩增，pcr反应程序(touchdownpcr)：94℃30s，72℃3min，共5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃30min，共计5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃3min，共计20个循环；最后4℃保存。电泳发现目标片段不明显，将第一轮扩增产物稀释50倍，以其为模板，进行巢式扩增，pcr反应体系：dna模板2μl，shortprimer0.5μl，ngsp20.5μl，ddh2o7μl，i-5tm2×high-fidelitymastermix(擎科生物)10μl。pcr反应程序：98℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸30s共30个循环；72℃后延伸7min，4℃保存。扩增产物电泳后，条带明显(图2)，对目的片段进行切胶回收，纯化后的pcr产物与pclone007vectorkit(擎科生物)载体连接，转化后对阳性克隆进行测序，获得948bp的目标序列seqidno：3。1.4、扩增猪prox1基因cds并获得猪cdna序列根据扩增得到的5’-utr、3’-utr序列以及ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中所预测的猪prox1基因mrna序列，设计3对引物对猪prox1基因编码序列(codingsequence,cds)进行扩增，引物应满足引物3’端尽量避免出现发夹结构，引物tm值一般控制在55℃-65℃之间，引物gc含量控制在40％-60％之间，正向引物和反向引物tm值以及gc含量尽可能一致等条件，具体引物序列见表1。将1.2步稀释过的第一链cdna作为模版，按照mastermix(南京诺唯赞)25μl，上下游引物各2μl，稀释cdna模版2μl，ddh2o19μl的pcr反应体系。pcr反应程序：98℃预变性5min，98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s共35个循环；72℃后延伸7min，4℃保存。对目的片段进行切胶回收，纯化后的pcr产物与pmdtm19-tvector(takara公司产品)载体连接，转化后对阳性克隆进行测序，分别获得1073bp、1076bp和822bp三个目标序列。最后将扩增得到的三段cds序列与5’utr、3’utr序列进行比对拼接，最后完成本发明的猪prox1基因克隆的内容。具体序列如seqidno:4所示。实施例2：猪prox1基因近端启动子区克隆与活性鉴定2.1、克隆猪prox1基因的近端启动子区域和缺失表达载体构建(1)从ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)sscrofa10.2版本检索包含猪prox1基因(ncbireferencesequence:nc_010451.3)的基因组序列，结合5’race得到的prox15’utr序列，将转录起始位点t前1957bpdna片段作为prox1基因潜在的启动子区。(2)以数据库下载的序列为模板设计了5对扩增不同长度启动子引物，5个5’缺失片段共用同一个下游引物，命名为pr。将上游引物分别命名为p1f、p2f、p3f、p4f与p5f，所设计的5对引物如表2所示，pcr反应体系：dna为模板约200ng，上下游引物分别为0.5μl，ddh2o7μl，i-5tm2×high-fidelitymastermixdna聚合酶10μl。pcr反应程序：98℃预变性2min，98℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸30s共30个循环；72℃后延伸7min，4℃保存。分别扩增出片段2275bp、1500bp、1000bp、510bp、215bp，并进行测序确认。表2用于扩增猪prox1基因启动子不同片段的引物信息注：小字母序列为接头保护序列，下划线部分表示为saci和hindiii酶切位点。(3)限制性内切酶saci和hindiii(thermoscientific公司)线性化pgl3-basic质粒，按照saci和hindiii各1μl，10×fastdigestbuffer2μl，pgl3-basic质粒5μl，ddh2o11μl。37℃酶切1h。(4)将前已扩增的dna片段和线性化质粒pgl3-basic进行琼脂糖凝胶电泳，并纯化后利用nanodrop2000spectrophotometer(美国nanodrop公司)检测其质量和浓度。所测的样品的od260/od280值在1.8-2.0才可用于后续的试验。(5)采用trelieftmsosoocloningkit(擎科生物)进行连接，反应体系如下：线性化质粒pgl3-basic2μl，目的dna片段10μl，2×sosoomix5μl，ddh2o3μl，50℃反应15min。完成连接反应。(6)取100μl冰浴融化的感受态细胞，加入连接产物，轻轻混匀，冰上静止25min。42℃水浴热激30-45s，迅速转移至冰浴中，静止2min，向离心管中加入500μl不含抗生素的无菌lb培养基，37℃恒温摇床200rpm复苏1h。均匀涂布在含有氨苄抗生素的固体lb培养板中，过夜后，挑去单个菌落与2ml离心管中37℃恒温摇床200rpm维持4h后，转移到50ml离心管中继续扩增12h。待培养基浑浊后，提取无内毒质粒。(7)采用omega公司的e.z.n.a.tmendofeeplasmidminikitii按一下步骤进行质粒抽提：50ml离心管菌液进行5000×g离心10min，并倒掉培养基，在沉淀的菌落中加入500μlsolutioni/rnasea混合液，涡旋振荡是细胞完全悬浮，转移到2ml离心管内，加入500μlsolutionii轻轻颠倒混匀7-10次，加入250μl冰浴buffern3，并温和的颠倒混匀至形成白色絮状沉淀，室温下≥12000×g离心10min。(8)转移上清只新的1.5ml离心管，加入0.1倍体积的etr溶液，混匀后冰浴10min，42℃水浴5min，室温下≥12000×g离心3min后，转移上清至新的1.5ml离心管内加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀静止1-2min。将混合液转移到套有收集管的hibind柱内，10000×g离心1min后弃滤液，过滤完所有的混合液。(9)将柱子重新放回收集管。加500μlhbbuffer，室温10000×g离心1min。(10)弃滤液加入，将柱子重新放回收集管加700μldnawashbuffer，室温10000×g离心1min后弃滤液。重复一次。10000×g离心空柱2min以甩干柱子基质。(11)将柱子装在干净的1.5ml离心管上加入80μlendotoxin-freeelutionbuffer到柱子基质中，室温下静置2min，接着室温≥10000×g离心2min洗脱出dna，做好标记-20℃保存。至此构建含有prox1基因不同长度的启动子区的真核表达载体共计5个，转录起始位点标为+1，所构建的启动子活性分析载体分别命名为pgl3-2275(-1957/+318)、pgl3-1500(-1182/+318)、pgl3-1000(-682/+318)、pgl3-510(-192/+318)、pgl3-215(+122/+318)。2.2、猪prox1基因启动子活性鉴定(1)细胞培养与接种细胞培养采用10％的胎牛血清(gibco)培养液进行常规的细胞培养，转染前将细胞消化后用生长培养基将细胞密度稀释成1-4×105个/ml，并取500μl细胞悬液接种到24孔培养板中，每个样品进行至少3个重复实验。申请人在293t细胞系中对启动子活性进行了分析。(2)细胞转染a.转染质粒的准备，将不同片段大小目的质粒以及pgl3-basic与pgl3-control质粒均稀释成0.2μg/μl，将内参质粒(tk)稀释成0.02μg/μl，然后取1μg目的质粒与0.05μg内参质粒混合(20：1的比例)，轻轻吹打均匀。同时分别取1μgpgl3-basic和pgl3-control与0.05μg内参质粒混合，分别用于阴性与阳性对照。b.将(a)中混后的质粒用50μl的opti-mem无血清培养基(gibco)稀释，轻轻混匀，室温放置5min。c.取适量的lipofectaminetm3000脂质体转染试剂(invitrogen公司)，用50μl的opti-mem无血清培养基稀释，轻轻混匀，室温放置5min。转染试剂量按所取质粒的量而定，本发明中转染试剂：质粒的比例为2.5：1。d.将(b)中所稀释混合质粒与(c)中所稀释的脂质体转染试剂混合，并轻轻混匀，室温放置20min。e.在静置转染复合物的时候，将前天晚上接种到24孔板中的细胞培养基去掉，换上新鲜的opti-mem无血清培养基。f.取100μl(d)中准备的转染复合物轻轻加入24孔板中，轻轻晃动培养板使转染复合物均匀分布在细胞培养液中。g.将细胞培养板置于5％co2培养箱中37℃培养中培养，4-6h后换上含血清的新鲜的培养基继续培养，24h后时行细胞的收集。(3)启动子活性测定及统计分析细胞裂解及样品前处理采用dual-luciferasereporterassaysystem(promega公司)进行，具体操作参考试剂盒说明书。样品双荧光素酶活性测定在glomax20/20luminometer平台(promega公司)上进行，相对启动子活性表示为：荧火虫荧光素酶活性(firelyluciferaseactivity)/海肾荧光素酶活性(renillaluciferaseactivity)。显著性检验利用graphpadprism6.01软件中自带的one-wayanova单因素方差分析程序进行，p<0.05认为启动子活性差异达到显著水平，p<0.01认为是启动子活性差异达到了极显著。启动子活性检测结果显示，各启动子缺失片段都具有独立启动基因表达的能力，启动子活性最低的片段为pgl3-1500(-1182/+318bp)，在-1182/-1957bp区域存在影响启动子活性的正调控元件；而在-1182/-682bp区域、-682/-192bp区域，以及-192到+122bp区域均存在影响启动子活性的负调控元件(图3)。制备实例3：猪prox1基因表达模式分析为了确定prox1表达模式与骨骼肌纤维类型的潜在关系，我们随机选择了3头杜洛克×梅山猪二元杂交猪，并采集了心、肝、脾、肾、脂肪，以及两种不同肌纤维类型的骨骼肌组织股二头肌(白肌)与比目鱼肌(红肌)。利用trizol试剂进行总rna的提取(invitrogen公司产品)，利用primescripttm试剂进行cdna第一链的合成(takara公司产品)，然后利用real-timepcr对prxo1基因的表达水平进行了检测。以所克隆的猪prox1基因全长cdna核苷酸序列seqidno:4为参考设计real-timepcr引物，定量上下游引物序列分别为prox1-f：ccgtttcagagtccgttaggt；prox1-r：tggtgggatgacatcttggtc，所有pcr反应执行3个重复，基因相对表达水平采用△△ct方法进行计算，以hprt基因作为内参基因进行基因相对表达水平校正。利用graphpadprism6.01进行图表绘制，并进行显著性检验，*p<0.05表示基因表达差异显著，**p<0.01表示基因表达差异极显著。基因表达模式检测结果表明，猪prox1主要在心、肝与骨骼肌中高丰度表达，并且在红肌比目鱼肌中的表达水平极显著高于白肌股二头肌(p<0.01)(图4)，暗示着猪prox1基因可能与骨骼肌的纤维类型存在密切的联系。另外，我们采集了279头皮×杜×长×大四元商品猪的背最长肌组织，并随机挑取了30个体，同样利用real-timepcr技术对骨骼肌类型差异标记基因myoglobin、myhc-i、myhc-iib、myhc-iix，以及prox1基因的表达水平进行了检测。根据myhc-iib与myhc-i基因表达比值，以比值2.0为临界值，将所检测的个体分成2组，结果显示，猪prox1与myoglobin和myhc-i两个基因具有一致的表达模式，而与myhc-iib的表达模式相反(图5)。表达模式结果暗示猪prox1是一个重要的影响猪肌纤维类型或猪肉色或其他相关肉质性状的候选基因。实施例4：猪prox1基因遗传变异位点检测与分子标记研发1、试验猪与表型测定本发明涉及的试验猪包括以来源于7个不同猪种，包括大白、长白、杜洛克、二花脸、梅山、米猪与苏淮猪，共计133头个体。另外，包括279头皮×杜×长×大四元商品猪群用于分子标记效应分析。所测定的表型数据包括胴体重、背膘厚、ph45min、ph24h、l*45min、a*45min、b*45min、l*24h、a*24h、b*24h、滴水损失24h、滴水损失48h、糖原含量、葡萄糖含量、葡萄糖-6磷酸含量、乳酸含量、糖酵解潜能。最后肋骨背膘厚采用电子游标卡尺进行测定，ph值利用便携式ph仪进行测定(型号：hi9125portableph，澳大利亚)、肉色l*、a*、b*利用便携式色差仪进行测定(型号：cr-10,日本)、滴水损失采用吊挂法进行测定、肌内脂肪含量采用索氏抽提法进行测定、乳酸含量、糖原含量与葡萄糖含量利用南京建成试剂盒进行测定(建成，南京)、葡萄糖-6磷酸含量利用sigma试剂盒进行测定(货号：mak014)、试验猪群表型测定数据及变异系数见表3。表3试验猪群表型测定数据注：cw:胴体重；bf:背膘厚；imf:肌内脂肪；l*：亮度；a*：红度；b*：黄度；dl24h：屠宰后24h滴水损失；dl48h：屠宰后48h滴水损失；cl：煮损失；sf:剪切力；mg：肌糖原；g：肌葡萄糖；g6p：葡萄糖-6-磷酸；la：乳酸；gp：糖酵解潜能。2、猪prox1基因遗传变异位点鉴定本发明采用上海天昊fasttarget目标区域测序技术对前面所克隆出来的prox1近端-2kb启动子序列(转录起始位点标为+1)进行目靶区域靶向测序，测序平台为illuminamiseq测序仪，采用2×150bp测序模式对目的片段实现双向测序。利用该方法对7个不同猪种，共计133头纯种猪个体，以及66头皮×杜×长×大商品猪prox1基因近端-2kb启动子序列进行了测序。测序结果显示，在猪prox1近端-2kb启动子序列中共存在18个遗传变异位点，18个遗传变异位点在猪prox1基因近端启动子中的位置，以及sscrofa10.2参考基因组版本上的位置等详细信息可见表4。而18个遗传变异位点在不同猪种中的基因型及等位基因频率详细结果见表5。表4猪prox1基因近端启动子区上遗传变异位点类型及其位置注：1sscrofa10.2参考基因组表5猪prox1基因近端启动子序列遗传变异位点基因型频率及等位基因频率分析3、目靶区域靶向测序分型结果验证在此基础上，为了进一步对测序结果的可靠性进行验证，本发明从18个遗传变异位点中选取了3个变异较大的位点snv11(g.-930bp)、snv14(g.-1421bp)、snv18(g.-1573bp)，采用pcr-rflp的策略对279头皮×杜×长×大四元商品猪群进行基因分型验证。首先根据3个遗传变异位点在prox1近端启动子中的位置设计相应的扩增引物，f1与r1扩增snv11遗传变异位点，f2与r2扩增snv14遗传变异位点，f3与r3扩增snv18遗传变异位点，扩增引物信息见表6。snv11遗传变异位点扩增的pcr产物经taqi酶切产生三种基因型，当该位点为a时，不能被taqi酶切，酶切后只有一个片段，长度为576bp(a等位基因)；当该位点为c时，taqi酶可将pcr产物酶切成两个片段，长度分别为418bp和162bp(c等位基因)。猪prox1基因的taqi-rflp酶切分型结果如图6所示。aa基因型只有一条576bp带；cc基因型有418bp和162bp二条带，ca基因型有576bp、418bp和162bp三条带。用2％的琼脂糖凝胶电泳检测能明显的判别基因型(图6)。snv14遗传变异位点扩增的pcr产物经bseni酶切产生三种基因型，当该位点为a时，不能被bseni酶切，酶切后只有一个片段，长度为485bp(a等位基因)；当该位点为g时，bseni酶可将pcr产物酶切成两个片段，长度分别为362bp和125bp(g等位基因)。猪prox1基因的bseni-rflp酶切分型结果如图7所示。aa基因型只有一条485bp带；gg基因型有362bp和125bp二条带，ca基因型有485bp、362bp和125bp三条带。用2％的琼脂糖凝胶电泳检测能明显的判别基因型(图7)。snv18遗传变异位点扩增的pcr产物经hpaii酶切产生三种基因型，当该位点为g时，不能被hpaii酶切，酶切后只有一个片段，长度为373bp(g等位基因)；当该位点为c时，hpaii酶可将pcr产物酶切成两个片段，长度分别为315bp和60bp(c等位基因)。猪prox1基因的hpaii-rflp酶切分型结果如图8所示。gg基因型只有一条373bp带；cc基因型有315bp和60bp二条带，gc基因型有373bp、315bp和60bp三条带。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测能明显的判别基因型(图8)。并对3个遗传变异位点的pcr-rflp基因分型结果与目靶区域靶向测序分型结果进行比对，结果表明目靶区域靶向测序所鉴定的遗传变异位点完全一致。表6猪prox1基因启动子三个变异位点多态性扩增引物4、性状关联分析在利用pcr-rflp完成279头皮×杜×长×大四元商品猪基因分型基础上，申请人采用sas统计软件(sasinstituteinc,version8.0)mlm程序对遗传变异位点多态与性状进行关联分析。统计模型如下：yijk＝μ+genotypei+sexj+batchk+bijkzijk+eijkyijk为性状表型值；μ为群体均值；genotypei为基因型效应，sexj、batchk分别为性别、屠宰批次效应；bijklm为胴体重对肉质性状的回归系数，xijk为胴体重，eijk为残差效应。关联分析结果如表7所示，分析结果表明，猪prox1近端启动子中g.-930bp处(snv11)的c/a变异位点多态性与ph24h呈显著相关，ca型个体ph值显著低于cc型(p＝0.0244)，而与24h滴水损失相关性接近显著水平(p＝0.0650)，ca型个体24h滴水损失高于cc型个体，暗示着该位点可作为辅助标记用于猪肉质性状的遗传改良。猪屠宰后，骨骼肌ph值会逐渐下降，ph值下降过快或下降过低均会影响猪肉品质。随着ph值的下降，肌肉的结构也会因ph值的下降发生各种类型的改变，肌肉结构变化的差异会直接影响猪肉水分损失的差异，即滴水损失差异。本研究结果显示，ca型个体屠宰后肌肉ph值显著低于cc型个体，相反的是，24h滴水损高于cc型个体，暗示cc型个体更有利于猪肉水分的保持。实际上，ca型个体48h的滴水损失也高于cc型个体，尽管在统计上没有达到显著水平。值得关注的是，本申请中所检测的snv14(g.-1421)与snv18(g.-1573)两个标记位点与snv11(g.-930)完全连锁，因此这三个标记均与ph24h与滴水损失存在相关性，其中任何一个标记均可独立或联合其他两个标记用于分子标记辅助育种。表7猪prox1基因启动子三个变异位点多态性与性状关联分析结果注：数值上标的字母相同表示差异不显著，字母不同时，小写字母表示差异显著(p<0.05)。本发明公开了猪肉质性状相关基因prox1的分子克隆及应用，利用race技术克隆出猪prox1基因全长cdna序列，其序列全长3683bp，序列特征如seqidno:4所示。利用双荧光酶活性分析技术确定了猪prox1基因启动子区活性区，在-1182/-1957bp区域存在影响启动子活性的正调控元件；而在-1182/-682bp区域、-682/-192bp区域，以及-192到+122bp区域均存在影响启动子活性的负调控元件。表达模式结果表明，猪prox1基因在心、肝、骨骼肌中高丰度表达，并且在红肌比目鱼肌中的表达水平极显著高于白肌股二头肌。另外，群体样本表达模式表明，猪prox1基因是一个与肉色显著相关的基因，可作为肉色分级的标记基因。另外，本发明在猪prox1基因启动子序列中鉴定了18个遗传变异位点，并证明其中三个完全连锁的遗传变异位点与猪肉ph性状存在显著相关，可作为猪生产性状辅助选育的重要分子标记。虽然本发明已作了详细描述，但本领域技术人员应该能理解，在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。例如，可对本申请的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物或方法步骤。所有这些改变均包括在本申请发明的权利要求的范围内。并且利用上述揭示的技术内容做出些许变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。序列表<110>南京农业大学<120>猪肉质性状相关基因prox1的分子克隆及应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2214<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atgcctgaccatgacagcacagccctcttaagccggcaaaccaagaggagaagagttgac60attggagtgaaaaggacggtagggacagcatctgcattttttgctaaggcaagagcaacg120ttttttagtgccatgaatccccaaggttccgagcaggatgttgagtattcagtggtgcag180catgcagatggggaaaagtcaaatgtactccgcaagctgctgaagagggcgaactcgtat240gaagatgccatgatgccttttccaggagcaaccataatttcccagctgttgaaaaataac300atgaacaaaaatggtggcacggagcccagtttccaagccagcggtctctctagtacaggc360tccgaagtacatcaggaggatatatgcagcaactcttcaagagacagcccccctgagtgt420ctttccccttttggcaggcctactatgagccagtttgatatggatcgcttgtgtgacgag480cacctgagagcaaagcgcgcccgggttgagaatataatccgaggtatgagccattccccc540agcgtggcattaaggggcaatgaaaatgaaagagagatggccccgcagtctgtgagtccc600cgagaaagttaccgagaaaacaaacgcaagcagaagctgccccagcagcagcaacagagt660ttccagcagctggtttcagcccgcaaagaacagaagcgagaggagcgccgacagctgaaa720cagcagctggaggacatgcagaaacagctgcgccagctgcaggaaaagttctaccaaatc780tatgacagcactgattctgaaaatgatgaagatggtaacctgtctgaagacagcatgcgc840ccggagatgctggatgccagggcccaggactccgtggggaggtcagataatgagatgtgc900gagctggacccagggcagttcatcgaccgcgcccgggccctgatcagggagcaggagatg960gcagaaaacaagccgaagcgggaaggcagcaacaaagaaagagaccacgggccaaactcc1020ttacaacccgaaggcaaacatttggccgagaccttgaaacaggaactgaacactgccatg1080tcgcaagttgtggacactgtggtcaaagtcttctcggccaagccctcccgccaggttcct1140caggtcttccccccgctccagatcccccaggccagattcgcagtcaacggggacaaccac1200aatttccacaccgccaaccagcgcctgcagtgctttggcgacgtcatcattccgaacccc1260ctggacaccttcggcaacgtgcagatgcccagctccaccgaccagacggaagcgctgccc1320ctggtggtccgcaaaaactcctctgaccagtcggcctccggcccccccgccggcggccac1380caccagcccctgcaccagtcgcctctgtcggccaccgcgggcttcaccacgtccaccttc1440cgccaccccttccccctccccctgatggcctacccgtttcagagtccgttaggtgctccc1500tccggctccttctcgggaaaagacagagcctctcctgaatccctagacttaaccagggag1560accacgagtctgaggaccaagatgtcatcccaccacctgagccaccacccttgttcacca1620gcacatccacccagcgccgcagaagggctctccttgtcgctcatcaaatccgagtgtgga1680gagcttcaagacatgtccgaaatctcaccttactcgggaagtgcaatgcaggaaggattg1740tcacccaatcacttgaaaaaagcaaagctcatgttcttttatacccgttatcccagctcc1800aatatgctgaagacctacttctctgatgtgaagttcaacagatgcattacctctcagctc1860atcaagtggtttagcaatttccgtgagttttactacattcagatggagaaatacgcgcgt1920caagccatcaacgatggagtcaccagtactgaagagctgtctataaccagagactgtgag1980ctgtacagggctctgaacatgcactacaataaagcaaatgactttgaggttccagagaga2040ttcctggaagttgcgcagatcacattacgggagtttttcaatgccattatcgcaggcaaa2100gatgttgatccttcctggaagaaggccatatacaaggtcatctgcaagctggatagtgaa2160gtccctgagattttcaaatccccaaactgcctacaagagctgcttcatgagtag2214<210>2<211>484<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tggagcggagccctcagctgagggagcgctcggaaataatacaccattgcagccggggag60agcagagcgacgcaaaagagctctcgccgggtccgcccgctccctctccgcttcgctcct120ctcctctcctcctcctccctctcctcctctctccgatcctcggcggtcctcctctcgcct180cttctcttcccctctcctcgctgccctcctcgccccctctcctctccctggccatcctgc240tctggctgtcccatctccctctccccctcggcccgctcgcgcgctcccgcacggacccac300cgtccctggtccaattatcatattcatcacccgcaagatctcaccgtgtgtgtgcgcgcg360tgtgttttcctctctccgcctgcaaaaaaggctcggtcccactgctctctgcaccgcggt420cccgggattcttgagctgtgcccagctgacgagcttttgaagatggcacaataactgtcc480agtg484<210>3<211>948<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aaatttcaacaactctttcggaatgtacgagtagtcgcagtcccctttggatgtccaagt60tacacgtgtctagattttgagttcatgtatatgtgtatgggaggcatggatatgttctga120aatcggctggtaattcctcctcatcatcttcctctcactttcttccgttttccattgcaa180ggggatggttcttttccttccgcctttagtttacttttgcccaaggcccttaacatgtgg240agacgtaaaatagggttaagtttcagggaaaaaaaggatgttggcgtgtgtaacgtcggt300gttcgcaagggagggcatttgttaaagatgcttttgcttgattgatggtttattgcaact360ggcggttggttggcggagggagacccgtgacacagcaagcagctctgtcttcagtgatgt420gtcttttattttcacggctaaggagataggaaaatgcaatgaaaccacgtgataaactga480aatgtttggtttgaactcagtaagtagctttttatcgtatgtttaaaaataatgccagtg540gcagatgaatagttcacttttcaaaagtagcccaaaaggccagatttgaaaaagaaacat600catcactaactgtcaaaaagcctttcctaagagaaatggccaacaccccaaactaggatt660ggtatcttatggaggcaaagcaattcggtacaaaactgactctttcaagatgagactaga720acctcgcgtgatttctagtcgcctctcgaaattctgcaacaggctcttcttgctaataag780tgagtggatatcattcttcatagagaaaaacccctataacgtgttattttctatttatct840tgcttcagatatgaaaaggcacataagtttcaaatttattctttgctccactctgtttat900atgctttaaaagagcaattatttgttgaatatttaacacttttttttt948<210>4<211>3683<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tggagcggagccctcagctgagggagcgctcggaaataatacaccattgcagccggggag60agcagagcgacgcaaaagagctctcgccgggtccgcccgctccctctccgcttcgctcct120ctcctctcctcctcctccctctcctcctctctccgatcctcggcggtcctcctctcgcct180cttctcttcccctctcctcgctgccctcctcgccccctctcctctccctggccatcctgc240tctggctgtcccatctccctctccccctcggcccgctcgcgcgctcccgcacggacccac300cgtccctggtccaattatcatattcatcacccgcaagatctcaccgtgtgtgtgcgcgcg360tgtgttttcctctctccgcctgcaaaaaaggctcggtcccactgctctctgcaccgcggt420cccgggattcttgagctgtgcccagctgacgagcttttgaagatggcacaataactgtcc480agtgatgcctgaccatgacagcacagccctcttaagccggcaaaccaagaggagaagagt540tgacattggagtgaaaaggacggtagggacagcatctgcattttttgctaaggcaagagc600aacgttttttagtgccatgaatccccaaggttccgagcaggatgttgagtattcagtggt660gcagcatgcagatggggaaaagtcaaatgtactccgcaagctgctgaagagggcgaactc720gtatgaagatgccatgatgccttttccaggagcaaccataatttcccagctgttgaaaaa780taacatgaacaaaaatggtggcacggagcccagtttccaagccagcggtctctctagtac840aggctccgaagtacatcaggaggatatatgcagcaactcttcaagagacagcccccctga900gtgtctttccccttttggcaggcctactatgagccagtttgatatggatcgcttgtgtga960cgagcacctgagagcaaagcgcgcccgggttgagaatataatccgaggtatgagccattc1020ccccagcgtggcattaaggggcaatgaaaatgaaagagagatggccccgcagtctgtgag1080tccccgagaaagttaccgagaaaacaaacgcaagcagaagctgccccagcagcagcaaca1140gagtttccagcagctggtttcagcccgcaaagaacagaagcgagaggagcgccgacagct1200gaaacagcagctggaggacatgcagaaacagctgcgccagctgcaggaaaagttctacca1260aatctatgacagcactgattctgaaaatgatgaagatggtaacctgtctgaagacagcat1320gcgcccggagatgctggatgccagggcccaggactccgtggggaggtcagataatgagat1380gtgcgagctggacccagggcagttcatcgaccgcgcccgggccctgatcagggagcagga1440gatggcagaaaacaagccgaagcgggaaggcagcaacaaagaaagagaccacgggccaaa1500ctccttacaacccgaaggcaaacatttggccgagaccttgaaacaggaactgaacactgc1560catgtcgcaagttgtggacactgtggtcaaagtcttctcggccaagccctcccgccaggt1620tcctcaggtcttccccccgctccagatcccccaggccagattcgcagtcaacggggacaa1680ccacaatttccacaccgccaaccagcgcctgcagtgctttggcgacgtcatcattccgaa1740ccccctggacaccttcggcaacgtgcagatgcccagctccaccgaccagacggaagcgct1800gcccctggtggtccgcaaaaactcctctgaccagtcggcctccggcccccccgccggcgg1860ccaccaccagcccctgcaccagtcgcctctgtcggccaccgcgggcttcaccacgtccac1920cttccgccaccccttccccctccccctgatggcctacccgtttcagagtccgttaggtgc1980tccctccggctccttctcgggaaaagacagagcctctcctgaatccctagacttaaccag2040ggagaccacgagtctgaggaccaagatgtcatcccaccacctgagccaccacccttgttc2100accagcacatccacccagcgccgcagaagggctctccttgtcgctcatcaaatccgagtg2160tggagagcttcaagacatgtccgaaatctcaccttactcgggaagtgcaatgcaggaagg2220attgtcacccaatcacttgaaaaaagcaaagctcatgttcttttatacccgttatcccag2280ctccaatatgctgaagacctacttctctgatgtgaagttcaacagatgcattacctctca2340gctcatcaagtggtttagcaatttccgtgagttttactacattcagatggagaaatacgc2400gcgtcaagccatcaacgatggagtcaccagtactgaagagctgtctataaccagagactg2460tgagctgtacagggctctgaacatgcactac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