一种基于eDNA的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置与流程

本发明涉及鱼类多样性研究领域，尤其涉及一种基于edna的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置。

背景技术：

鱼类作为水生生态系统中最高营养级，能反映水生生态系统的生产力和生物多样性水平。传统的鱼类调查的调查手段包括走访统计，随机捕捞以及电鱼等方法。但是，这些调查方法对较大的流域进行调查，往往要花费研究人员数月甚至几年的时间进行捕获，鱼类鉴定分类，不具时效性。此外，捕捞法通常会采用电鱼的方式，但是电流的大小很难控制，部分捕获过程中为了增加实验的可靠性，导致许多鱼类被电死，对生态系统造成重大伤害。近年来，水声法渐渐被用于鱼类调查和渔业管理，水声法可以做到环境友好的，高效的探测鱼类的种群数量、密度等。但是水声法在不同环境中的准确性变化较大，在精确的科学研究中可信度较低，且难以探测出鱼类的种类的技术瓶颈长时间以来未得到解决。

随着第二代基因检测技术的发展，edna技术在鱼类多样性调查研究中的优势愈发明显，edna技术被称为“一杯水的对话”。随着对ngsmetaboarding技术研究的深入，研究人员同时利用垂钓、拖网、刺网等9种不同的采样方式进行鱼类多样性调查，发现在10种调查方法中，edna技术能够检出的物种最多，且edna比传统调查方法更为敏感，具有时效性高。

但是在目前的技术水平下，edna仍存在样品在非实验阶段会有交叉污染、降解等风险会影响edna分析结果的准确性，并且实验成本高。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决edna仍存在样品在实验阶段会有交叉污染、降解等风险，影响edna分析结果的准确性和实验成本高的问题，而提出的一种基于edna的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种基于edna的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置，包括以下步骤：

s1、使用已灭菌的采样瓶，选取水生生物保护湖流的水库及其上下游进行多次采样采集1l样品，每隔一公里设置一个采样点，每个采样点设置3个平行样，每次采样时间间隔6个月；

s2、使用已灭菌的一种基于edna的鱼类多样性的定量采样过滤装置对采集到的样品进行过滤，过滤结束取下微孔滤膜，将微孔滤膜放置于-20℃的冰箱中进行冷冻保存；

s3、取出微孔滤膜并放置在液氮研钵中碾碎，将碎屑倒入2ml的离心管中保存备用；

s4、取出样品滤膜的碎屑，采用dna提取试剂对滤膜碎屑样品进行dna提取实验；

s5、将提取到的dna样品放入超微量分光光度计中进行检测，分析样品dna的浓度；

s6、选择覆盖物种最多且鉴别精度最高的通用引物，使用引物进行多样性pcr扩增，扩增产物采用dna试剂纯化回收，dna纯化过程中进行多次洗脱，将纯化后的dna放置于4℃冰箱中进行冷藏保存；

s7、构建克隆测序文库，对pcr扩增后的dna片段进行基因检测，将检测出的基因序列结果与ncbi数据库的基因序列进行比对，分析水体中鱼类的多样性；

s8、根据基因序列对比分析结果，进行扩增后，再使用realtimepcr的方法对样品进行扩增，进行鱼类定量研究实验。

进一步优化的，所述s1中采样瓶为500ml的可循环霉菌的nalgene采样瓶。

进一步优化的，所述s2中的微孔滤膜的滤膜孔径为0.45μm。

进一步优化的，所述s2中滤膜冷冻保存的时间不超过24h。

进一步优化的，所述s4中dna提取试剂包括dna提取试剂包括人体组织和血液提取物、齐安普奈莫拉提物、活生水提取物和速克达那平-柱状物。

进一步优化的，所述s5中od(光密度)260代表核算的吸收峰，od280代表蛋白质的吸收峰，当提取物为纯dna时，od260/280≈1.80，dna浓度较高时，od260/280在1.60-1.90（包括1.60）之间。

进一步优化的，所述s7中采用琼脂糖凝胶电泳法检测pcr产物。

一种基于edna的鱼类多样性的定量采样过滤装置，应用于一种基于edna的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置，包括过滤装置本体、放液口和轴承，所述过滤装置本体下端右侧设置有放液口，所述放液口右侧固定安装有放液阀，所述过滤装置本体内部下端设置有储液槽，所述储液槽上端中部与二级抽滤箱底部固定连接，所述二级抽滤箱顶端与一级抽滤箱底端固定连接，所述二级抽滤箱上侧与一级抽滤箱下侧之间设置有轴承。

优选地，所述一级抽滤箱内部上端设置有膨松棉，所述一级抽滤箱内部中间设置有活性炭，所述一级抽滤箱内部下端设置有滤纸，所述储液槽右侧上端设置有真空抽滤泵，所述真空抽滤泵左侧与真空抽滤管道右侧固定连接，所述真空抽滤管道左侧贯穿二级抽滤箱中部并与储液槽左侧上端固定连接，所述二级抽滤箱内部底端设置有微孔滤膜，所述真空抽滤管道内部中间设置有风扇，所述风扇中部与转轴一端固定连接，所述转轴另一端与蜗轮中部固定连接，所述蜗轮右侧与蜗杆左侧啮合连接，所述蜗杆上端与轴承下端轴心位置活动连接，所述蜗杆下端贯穿真空抽滤管道中部并延伸至二级抽滤箱内部下端，所述蜗杆下端左右两侧固定安装有搅拌棒。

与现有技术相比，本发明提供了一种基于edna的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置，具备以下有益效果：

（1）本发明采用过滤法进行样品dna的提取，在进行样品dna提取实验之前，使用已灭菌一种基于edna的鱼类多样性的定量采样过滤装置，对采集的样品进行过滤，可有效避免样品在实验阶段被交叉污染，样品的过滤装置的滤膜孔径小，所提取的dna浓度较高，考虑到dna样品的保存难度高，将过滤后将滤膜至于-20℃的冰箱中进行冷冻保存，滤膜放置在液氮研钵中碾碎并且在24小时之内进行提取实验，可有效减少dna的降解，采样量1l并配合使用人体组织和血液提取物试剂进行提取，获得的dna提取物放在超微量分光光度计下进行dna浓度分析，分析结果更精确且结果好，提取的样品dna的浓度和纯度较高，能满足克隆以及高通量测序要求；

（2）本发明采用绝对定量pcr的方法进行鱼类定量研究，绝对定量可以通过标准曲线和溶解曲线来确定样本中基因的拷贝数或浓度，特异性高、准确度好，根据对比结果的基因序列，在ncbi数据库中下载目标产物的全基因序列，采集模板，用目的基因引物进行pcr扩增，回收的pcr产物进行ta克隆，挑取目标菌落进行质粒提取，提取的质粒作为绝对定量的标准品，取出样品进行realtimepcr扩增，利用荧光信号的变化可以实时检测pcr扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，并且可以有效避免传统pcr以终产物监测定量产生的偏差，提高实验的重复性；

（3）本发明采用一种基于edna的鱼类多样性的定量采样过滤装置对样品进行过滤，传统的鱼类多样性调查时，需要对采集样品进行搅拌和多次过滤处理，而鱼类多样性调查时需要保证样品的安全性，而传统的鱼类多样性定量对样品的搅拌和过滤都是分开处理的，这样不仅加长了实验周期，且样品的无菌安全型得不到保障，因此分发明方法设计了一种基于edna的鱼类多样性的定量采样过滤装置，在使用本装置的过程中，可先打开真空抽滤泵，将样品液体倒进一级过滤箱，样品经过一级过滤箱进入到二级过滤箱中，同时真空抽滤的过程中，真空抽滤管道内的气流会带动风扇开始转动，从而带动蜗轮开始转动，从而带动蜗杆开始转动，蜗杆带动搅拌棒转动，在抽滤的同时进行搅拌，大大缩短了实验的周期，同时也可有效避免样品在实验阶段被交叉污染。

附图说明

图1为本发明提出的一种基于edna的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置的流程示意图；

图2为本发明提出的一种基于edna的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置的实施例3的结果图；

图3为本发明提出的一种基于edna的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置的实施例3的结果图；

图4为本发明提出的一种基于edna的鱼类多样性的定量采样过滤装置的正视结构示意图；

图5为本发明提出的一种基于edna的鱼类多样性的定量采样过滤装置的剖视结构示意图。

图中标号说明：

1过滤装置本体、2储液槽、3放液口、4放液阀、5二级抽滤箱、6活性炭、7膨松棉、8滤纸、9微孔滤膜、10一级过滤箱、11转轴、12风扇、13蜗轮、14蜗杆、15搅拌棒、16真空抽滤泵、17真空抽滤管道、18轴承。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例1：一种基于edna的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置，包括以下步骤：

s1、使用已灭菌的采样瓶，选取水生生物保护湖流的水库及其上下游进行多次采样采集1l样品，每隔一公里设置一个采样点，每个采样点设置3个平行样，每次采样时间间隔6个月；

s2、使用已灭菌的一种基于edna的鱼类多样性的定量采样过滤装置对采集到的样品进行过滤，过滤结束取下微孔滤膜，将微孔滤膜放置于-20℃的冰箱中进行冷冻保存；

s3、取出微孔滤膜并放置在液氮研钵中碾碎，将碎屑倒入2ml的离心管中保存备用；

s4、取出样品滤膜的碎屑，采用dna提取试剂对滤膜碎屑样品进行dna提取实验；

s5、将提取到的dna样品放入超微量分光光度计中进行检测，分析样品dna的浓度；

s6、选择覆盖物种最多且鉴别精度最高的通用引物，使用引物进行多样性pcr扩增，扩增产物采用dna试剂纯化回收，dna纯化过程中进行多次洗脱，将纯化后的dna放置于4℃冰箱中进行冷藏保存；

s7、构建克隆测序文库，对pcr扩增后的dna片段进行基因检测，将检测出的基因序列结果与ncbi数据库的基因序列进行比对，分析水体中鱼类的多样性；

s8、根据基因序列对比分析结果，进行扩增后，再使用realtimepcr的方法对样品进行扩增，进行鱼类定量研究实验。

s1中采样瓶为500ml的可循环霉菌的nalgene采样瓶。

s2中微孔滤膜的滤膜孔径为0.45μm。

s2中滤膜冷冻保存的时间不超过24h。

s4中dna提取试剂包括人体组织和血液提取物、齐安普奈莫拉提物、活生水提取物和速克达那平-柱状物。

s5中od(光密度)260代表核算的吸收峰，od280代表蛋白质的吸收峰，当提取物为纯dna时，od260/280≈1.80，dna浓度较高时，od260/280在1.60-1.90（包括1.60）之间。

s7中采用琼脂糖凝胶电泳法检测pcr产物。

本发明采用过滤法进行样品dna的提取，在进行样品dna提取实验之前，使用一种基于edna的鱼类多样性的定量采样过滤装置，对采集的样品进行过滤，可有效避免样品在实验阶段被交叉污染，样品的过滤装置的滤膜孔径小，所提取的dna浓度较高，考虑到dna样品的保存难度高，将过滤后将滤膜至于-20℃的冰箱中进行冷冻保存，滤膜放置在液氮研钵中碾碎并且在24小时之内进行提取实验，可有效减少dna的降解，采样量1l并配合使用人体组织和血液提取物试剂进行提取，获得的dna提取物放在超微量分光光度计下进行dna浓度分析，分析结果更精确且结果好，提取的样品dna的浓度和纯度较高，能满足克隆以及高通量测序要求。

实施例2：基于实施例1但有所不同的是，在怀柔水库上下游的7个采样点进行较为密集的采样，采样量为1l，采集的样品使用已灭菌的一种基于edna的鱼类多样性的定量采样过滤装置，滤膜放置在液氮研钵中碾碎，24h之内进行dna提取实验，提取的dna样品放入超微量分光光度计中进行浓度检测，选择覆盖物种最多且鉴别精度最高的通用引物，使用引物进行多样性pcr扩增，取2ul纯化的pcr产物与载体连接，转化感受态细胞，37℃下恒温培养过夜，克隆结束后，挑取50个单菌落，使用引物进行菌落pcr验证，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳检测，确认为目的条带，将样品分别挑取30个单菌落过夜扩大培养，培养结束进行质粒抽提，使用测序仪对样品进行测序检测，扩增产物采用dna试剂纯化回收，构建克隆测序文库，对pcr扩增后的dna片段进行基因检测，将检测出的基因序列结果与ncbi数据库的基因序列进行比对，分析水体中鱼类的多样性。克隆测序建库数量为40个克隆子每个样品,本次测序结果比对出共40种脊椎水生生物，其中鱼类32种，浮游生物5种，蛙类1种，按照检出物种的分类学标准对克隆检测结果的物种出现频率进行记录，在blast对比结果时，可以看出edna法检测出的基因序列和数据库中记载的基因序列匹配度很高，证明本研究所采用的edna方法可将河流水体中可能存在的物种鉴定到种水平。

实施例3：基于实施例1和2但有所不同的是，选取有宽鳍鳈基因序列的4个采样点进行采样，将采集的样品进行dna提取实验，根据blast对比结果的基因序列，在ncbi数据库中下载宽鳍鳈(zaccoplatypus)的全基因序列，在primer5.5软件中进行引物筛选，获得上目标基因的上下游引物片段，并进行引物合成，以采集的样品为模板，用目的基因引物进行pcr扩增，回收的pcr产物进行ta克隆，挑取目标菌落进行质粒提取，提取的质粒作为绝对定量的标准品，根据dna样品配置realtimepcr反应体系，进行realtimepcr扩增实验，每个样本进行3次重复检测。合成设计宽鳍鳈的引物片段基因，并构建标准品扩增标准曲线，进行realtimepcr检测，得到引物基因标准品扩增标准曲线和实时扩增曲线，得到标准品的标准曲线方程为：y=-3.463x+53.338(r²=0.99)，其中相关性指数r²大于0.98，扩增曲线斜率介于-3到-3.5，e值为0.9443，接近于1，证明该曲线具有可行性，点之间具有线性关系。

实施例4：基于实施例1、2和3但有所不同的是，选取有河川沙塘鳢基因序列的4个采样点进行采样，将采集的样品进行dna提取实验，根据blast对比结果的基因序列，在ncbi数据库中下载河川沙塘鳢(odontobutispotamophila)的全基因序列，在primer5.5软件中进行引物筛选，获得上目标基因的上下游引物片段，并进行引物合成，以采集的样品为模板，用目的基因引物进行pcr扩增，回收的pcr产物进行ta克隆，挑取目标菌落进行质粒提取，提取的质粒作为绝对定量的标准品，根据dna样品配置realtimepcr反应体系，进行realtimepcr扩增实验，每个样本进行3次重复检测合成设计河川沙塘鳢的引物片段基因，并构建标准品扩增标准曲线，进行realtimepcr检测，得到引物基因标准品扩增标准曲线和实时扩增曲线，得到标准品的标准曲线方程为：y=-1.7x+33.906(r²=0.99)，其中相关性指数r²大于0.98，扩增曲线斜率小于大于-3，e值为2.8746大于1，但dna凝胶电泳显示根据kf305680.1筛选基因引物能很好的扩增出所需的单一条带，故结果具有参考性。

实施例5：一种基于edna的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置，一种基于edna的鱼类多样性的定量采样过滤装置，包括过滤装置本体1、放液口3和轴承18，过滤装置本体1下端右侧设置有放液口3，放液口3右侧固定安装有放液阀4，过滤装置本体1内部下端设置有储液槽2，储液槽2上端中部与二级抽滤箱5底部固定连接，二级抽滤箱5顶端与一级抽滤箱10底端固定连接，二级抽滤箱5上侧与一级抽滤箱10下侧之间设置有轴承18。

一级抽滤箱10内部上端设置有膨松棉7，一级抽滤箱10内部中间设置有活性炭6，一级抽滤箱10内部下端设置有滤纸8，储液槽2右侧上端设置有真空抽滤泵16，真空抽滤泵16左侧与真空抽滤管道17右侧固定连接，真空抽滤管道17左侧贯穿二级抽滤箱5中部并与储液槽2左侧上端固定连接，二级抽滤箱5内部底端设置有微孔滤膜9，真空抽滤管道17内部中间设置有风扇12，风扇12中部与转轴11一端固定连接，转轴11另一端与蜗轮13中部固定连接，蜗轮13右侧与蜗杆14左侧啮合连接，蜗杆14上端与轴承18下端轴心位置活动连接，蜗杆14下端贯穿真空抽滤管道17中部并延伸至二级抽滤箱5内部下端，蜗杆14下端左右两侧固定安装有搅拌棒15。

本发明采用一种基于edna的鱼类多样性的定量采样过滤装置对样品进行过滤，传统的鱼类多样性调查时，需要对采集样品进行搅拌和多次过滤处理，而鱼类多样性调查时需要保证样品的安全性，而传统的鱼类多样性定量对样品的搅拌和过滤都是分开处理的，这样不仅加长了实验周期，且样品的无菌安全型得不到保障，因此分发明方法设计了一种基于edna的鱼类多样性的定量采样过滤装置，在使用本装置的过程中，可先打开真空抽滤泵16，将样品液体倒进一级过滤箱10，样品经过一级过滤箱10进入到二级过滤箱5中，同时真空抽滤的过程中，真空抽滤管道17内的气流会带动风扇12开始转动，从而带动蜗轮13开始转动，从而带动蜗杆14开始转动，蜗杆14带动搅拌棒15转动，在抽滤的同时进行搅拌，大大缩短了实验的周期，同时也可有效避免样品在实验阶段被交叉污染。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。