一种鉴别检测牛巴贝斯虫的试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及一种反刍动物巴贝斯虫的试剂盒及其非疾病检测方法，确切讲本发明涉及一种牛巴贝斯虫病检测试剂盒及非疾病诊断方法。

背景技术：

牛巴贝斯虫病是由巴贝斯虫属的原虫专一性寄生于牛的红细胞内而引起的一种蜱传性的血液原虫病，其临床特征为高热、贫血、黄疸、血红蛋白尿。该病在世界各地均有流行，给畜牧业造成了巨大的经济损失。

在我国，已报道的感染牛的巴贝斯虫病原有五种，包括牛巴贝斯虫(babeisabovis)、双芽巴贝斯虫(babeisabigemina)、卵形巴贝斯虫(babeisaovata)、大巴贝斯虫(babeisamajor)和东方巴贝斯虫(babeisaorientalis)。其中由牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫引起的巴贝斯虫病分布于甘肃、河南、陕西、河北、安徽、湖北、湖南、福建、贵州、云南等地；大巴贝斯虫主要分布于新疆，东方巴贝斯虫主要报道于我国长江以南的水牛分布区(刘钟灵等，1987；吕文祥等，1995；吕文顺等，1979；白启等，1990；白启等，1992；殷宏等，2000)。

利用建立的血清学和分子生物学方法对牛巴贝斯虫病的流行病学调查结果显示，牛巴贝斯虫的阳性率分别为6.3％-68.5％和1％-60％(吕伟等，2009；刘启生等，2013；袁利芹等，2014；李安岩等，2014；niuetal，2015)；双芽巴贝斯虫阳性率为9.3％-30.5％和1％-62.2％。分子生物学技术对卵形巴贝斯虫调查结果显示，其平均阳性率1.5％。上述研究结果表明，牛巴贝斯虫病在我国感染率较高。

对巴贝斯虫进行鉴别检测也是寄生虫学研究的重要内容，有益于针对性地预防和控制牛巴贝斯虫病。血涂片染色后的显微镜检测是牛巴贝斯虫病检测的经典方法，但是在染虫率很低的情况下，很难检测到病原；以形态学为基础的虫种鉴别检测，需要操作者有丰富的经验，也容易出现漏检的情况。为了解决上述检测方法的缺陷，国内外的研究者建立了多重pcr、实时荧光定量pcr(real-timepcr)、反向线状印迹(rlb)、酶联免疫吸附试验等方法对牛巴贝斯虫进行鉴别检测。这些方法敏感性和特异性较高，但每次只能鉴定出一种或两种病原体，无法同时实现多种病原的鉴别检测。因此，亟待建立一种特异性强、敏感性高，并且能同时实现多种病原鉴别检测的方法。

技术实现要素：

本发明提供一种可同时进行五种牛巴贝斯虫病原鉴别检测的方法与试剂盒，以及利用这种试剂盒进行非疾病检测的目的。

本发明的检测牛巴贝斯虫试剂盒中至少包括seqidno.1和seqidno.2两条扩增引物。

本发明的检测牛巴贝斯虫试剂盒中还有含evagreen荧光染料qpcrmastermix的预混溶液。为方便检测，本发明的试剂盒中还可以有标准阳性质粒模板、阴性标准品。

本发明的非疾病检测目的的牛巴贝斯虫检测方法是：提取将待检测样品的dna，再将所得到的待检dna进行扩增，再将扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，将所得到的待检测样品的熔解曲线与标准熔解曲线进行对比，得到待检样品是否感染及感染何种牛巴贝斯虫。

本发明是在现有技术的基础上，根据18srrna序列分析结果，在高度保守区设计扩增引物。靶序列具有如下特征：(1)在同一虫种不同地方分离株间高度保守(核苷酸序列相似性为100％)；(2)不同虫种间至少有一个碱基的变异；利用高分辨率熔解曲线方法(hrm)对扩增产物进行熔解曲线分析，由于扩增的不同虫种的基因片段存在一个或数个碱基的差异，导致不同的虫种来源的基因片段熔解温度有细微的差别，形成不同的熔解曲线，进行研制出可同时鉴别检测五种巴贝斯虫病原的试剂盒，为牛巴贝斯虫病的快速鉴别检测、流行病学调查和防控等奠定基础。该方法具有重复性好、灵敏度高、速度快和全封闭反应等优点。目前，还没有关于利用高分辨率熔解曲线进行牛巴贝斯虫种鉴别检测方法的报道，本发明通过对反应条件的优化，检测方法具有特异性高、敏感性好和可重复性的特点，使其能更好地用于牛体巴贝斯虫的鉴别检测。

附图说明

图1实时荧光定量pcr扩增敏感性曲线。其中1为pcr扩增质粒浓度为1×10¹拷贝/μl，2为pcr扩增质粒浓度为1×10²拷贝/μl，3为pcr扩增质粒浓度为1×10³拷贝/μl，4为pcr扩增质粒浓度为1×10⁴拷贝/μl，5为pcr扩增质粒浓度为1×10⁵拷贝/μl，6为pcr扩增质粒浓度为1×10⁶拷贝/μl，7为pcr扩增质粒浓度为1×10⁷拷贝/μl，8为pcr扩增质粒浓度为1×10⁸拷贝/μl。

图2熔解曲线敏感性和重复性。牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫18srna重组质粒浓度分别为1.0×10⁸拷贝/μl、1.0×10⁴拷贝/μl和1.0×10¹拷贝/μl扩增产物进行熔解曲线分析。

图3应用本发明的方法对已知背景的样本进行鉴别检测的熔解曲线。

图430例已知背景样本基本信息。

具体实施方式

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物序列合成及测序工作均由南京金斯瑞股份有限公司完成。

本发明所用引物、标准质粒和试剂如下：

(1)pcr扩增引物

上游引物：bovisb7-f5'-cctgacacagggaggtagtgacaag-3'seqidno.1；

下游引物：bovisb7-r5'-ggctgctggcaccagacttgccctcc-3'seqidno.2；

扩增产物长度为120bp。

(2)标准牛巴贝斯虫18srna重组质粒(10⁵拷贝/μl)，重组质粒序列为：seqidno.3；

(3)标准双芽巴贝斯虫18srna重组质粒(10⁵拷贝/μl)，重组质粒序列为seqidno.4；

(4)标准卵形巴贝斯虫18srna重组质粒(10⁵拷贝/μl)，重组质粒序列为seqidno.5；

(5)标准大巴贝斯虫18srna重组质粒(10⁵拷贝/μl)，重组质粒序列为seqidno.6；

(6)标准东方巴贝斯虫18srna重组质粒(10⁵拷贝/μl)，重组质粒序列为seqidno.7；

(7)标准梨形虫阴性的牛基因组dna(50ng/μl)；

(8)预混qpcrmastermix。

具体操作方法如下：

首先制备所需的五种质粒标准品。本发明包括牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫，共5个虫种的18srna基因重组质粒。

在具体应用时还需要有：预混qpcrmastermix(含evagreen荧光染料)、标准阳性质粒模板、阴性标准品、扩增引物。反应体系包括荧光定量pcr反应液qpcrmastermix10μl，正向引物和反向引物(10pmol)各0.5μl，荧光校正液roxreferencedye(50×)0.4μl，标准品质粒模版1.0μl，灭菌蒸馏水7.6μl。

1、标准品的制备

牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫18srna重组标准质粒的制备。

(1)根据牛巴贝斯虫核糖体18srrna基因序列设计引物，经pcr扩增预期获得1200bp的目的片段。引物对序列为：

piro-f180：5'-ccatggataaccgtgctaattg-3'seqidno.8

piro-r1380：5'-catctaagggcatcacagacc-3'seqidno.9。

(2)以实验室保存的牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫基因组dna为模板进行扩增，pcr反应体系为：

反应条件为94℃预变性5min，然后94℃30s、55℃30s、72℃90s，35个循环，72℃延伸7min。取5μl扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的pcr产物用琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒(zymo)进行纯化回收，将回收的dna片段与pclone007-t载体进行连接，反应体系如下：

配制完成后置于25℃进行1h。

(3)pclone007-t连接产物的转化以及pcr鉴定

(a)-80℃的超低温冰箱中取出dh5α感受态细胞，置于冰上融化。

(b)取连接产物10μl加入100μl的dh5α感受态细胞中，冰浴30min。

(c)42℃热激90s，置冰上2min。

(d)加入不含抗生素的lb液体培养基1ml，37℃150转，培养90min。

(e)取100μl涂布于氨苄抗性的lb平皿上，37℃倒置培养过夜。

(f)从平板上挑取单克隆菌落于500μl氨苄抗性的lb液体培养基的1.5mlep管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时。

(g)取1μl作为模板进行菌液pcr鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到5ml的lb液体培养基中进行扩摇。

(4)提取阳性克隆质粒，使用nanodrop2000(thermoscientific，america)超微量分光光度计测定质粒浓度，并将其换算成拷贝/μl，以此作为质粒标准品。将构建好的质粒标准品，稀释为1.0×10⁷-1.0×10¹拷贝/μl，以便进行敏感性测试。

2、高分辨率熔解曲线方法的反应性和灵敏度测试

(1)hrm-pcr扩增时所用反应体系和反应条件

pcr反应体系为20μl：

pcr的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火/延伸30s；40个循环。hrm分析：95℃60s；40℃60sec；70-85℃收集数据，温度上升速率为0.2℃/s。

扩增所用引物序列如下：

上游引物：bovisb7-f5'-cctgacacagggaggtagtgacaag-3'

下游引物：bovisb7-r5'-ggctgctggcaccagacttgccctcc-3'

(2)灵敏度实验

利用上述所建立的反应条件方法，以牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫18srna重组质粒为模板，并将质粒制备成浓度为1.0×10⁸-1.0×10¹拷贝/μl的质粒标准品进行灵敏度试验。

pcr扩增时的反应体系为：

pcr扩增时的反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性5s；60℃退火/延伸30s；40个循环。

结果参照图1，扩增曲线显示质粒浓度为1.0×10⁸拷贝/μl至1.0×10¹拷贝/μl，均能够很好地扩增，表明该hrm方法具有很好的扩增反应性。

分别对牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫18srna重组质粒浓度为1.0×10⁸拷贝/μl、1.0×10⁴拷贝/μl和1.0×10¹拷贝/μl扩增产物进行熔解曲线分析，标准质粒熔解曲线(图2)结果显示，不同浓度的质粒扩增产物的熔解曲线具有良好的拟合性，该方法能同时进行五种巴贝斯虫虫种的鉴别和检测。

(3)hrm重复性

牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和东方巴贝斯虫18srna质粒浓度为1.0×10⁸、1.0×10⁴和1.0×10¹拷贝/μl的标准品进行pcr扩增和熔解曲线分析。对同一批次稀释的标准品，每个浓度重复三次。然后再进行3个不同时间的稀释的标准品进行熔解曲线分析，重复该实验三次，同一虫种不同浓度质粒的熔解曲线均能够很好地重合，说明其检测结果稳定，具有良好的重复性。

(4)hrm方法对已知背景样本的鉴别检测

利用建立的hrm方法对经过测序鉴定为梨形虫阳性的牛基因组dna样本进行hrm分析，与重组阳性质粒的熔解曲线对照比较，确定样本中的虫种类型。数据显示30例(图4)样本中牛巴贝斯虫4例、双芽巴贝斯虫3例、卵形巴贝斯虫2例、大巴贝斯虫4例、东方巴贝斯虫2例、环形泰勒虫6例、东方泰勒虫5例、中华泰勒虫4例测序结果与本发明方法检测的结果完全一致(图3)。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种鉴别检测牛巴贝斯虫的试剂盒及检测方法日

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(扩增上游引物bovisb7-f)

<400>1

cctgacacagggaggtagtgacaag25

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(扩增上游引物bovisb7-r)

<400>2

ggctgctggcaccagacttgccctcc26

<210>3

<211>1218

<212>dna

<213>牛巴贝斯虫18srna重组质粒(babeisabovis)

<400>3

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<211>1300

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<213>双芽巴贝斯虫18srna重组质粒(babeisabigemina)

<400>4

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<210>5

<211>1315

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<213>卵形巴贝斯虫18srna重组质粒(babeisaovata)

<400>5

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<210>6

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<213>大巴贝斯虫18srna重组质粒(babeisamajor)

<400>6

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<210>7

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<213>东方巴贝斯虫18srna重组质粒(babeisaorientalis)

<400>7

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<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(扩增上游引物piro-f180)

<400>8

ccatggataaccgtgctaattg22

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(扩增下游引物piro-r1380)

<400>9

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