本发明涉及内生真菌次生代谢产物制备方法，具体涉及多蕊蛇菰内生真菌抗细菌和/或抗氧化次生代谢产物的制备方法及用途。
背景技术：
多蕊蛇菰(balanophorapolyandragriff.)为蛇菰科蛇菰属多年生肉质全寄生草本植物，称为木菌子或土苁蓉，雌雄同株或异株，常寄生于杜鹃、椎栗和竹子的根上，主要分布于我国的云南、四川、广东和海南等地，也分布于尼泊尔、印度、缅甸等地(中国植物志，1988)。多蕊蛇菰具有清热解毒、止血、补血的功效，药效肯定，无明显毒副作用，也常常被当地人视为一种治疗淋病、梅毒、外伤、消化道出血等症状的民间药。
近年来，国内外对多蕊蛇菰的研究主要集中在植物化学成分和生物活性方面的研究上。已有的研究结果表明，多蕊蛇菰的有效成分具有抗氧化、增强免疫性、清除多余自由基活性、降血糖、抗肿瘤、抗细菌等多种药理作用。由于该植物根寄生的特性，使其难以人工移植培养，且植株矮小，传播范围不广，导致该物种野生资源稀少，寻找新的可获取多蕊蛇菰有效成分的途径具有极其重要的意义。
如今，药用植物内生真菌作为一种新型的天然活性物质资源宝库，可合成与药用植物相同或相似的次生代谢产物，具有十分广泛的生物活性，如抗细菌、抗真菌、抗癌、抗病毒、抗氧化、杀虫、抗糖尿病、免疫抑制等活性。而且内生真菌易于发酵培养，便于组织工业化生产，因此利用药用植物内生真菌开发药用资源的前景十分广阔，然而对于多蕊蛇菰内生真菌的研究尚未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供多蕊蛇菰内生真菌抗细菌和/或抗氧化次生代谢产物的制备方法及用途，该方法解决了现在尚未有对多蕊蛇菰内生真菌研究的问题，能够提取多蕊蛇菰内生真菌的次生代谢产物，获得具有抗细菌和/或抗氧化活性的次生代谢产物。
为了达到上述目的，本发明提供了多蕊蛇菰内生真菌抗细菌和/或抗氧化活性次生代谢产物的制备方法，该方法包含：
(1)采用组织块分离法从多蕊蛇菰中分离内生真菌；
(2)将分离到的内生真菌在马铃薯葡萄糖液体培养基中振荡培养；
(3)将步骤(2)得到的液体种子接入灭菌的大米培养基中培养，将大米培养基的发酵产物在乙酸乙酯中冷浸提取，减压浓缩后得到多蕊蛇菰内生真菌次生代谢产物；
(4)采用tlc-mtt-生物自显影法和dpph法筛选具有抗细菌和/或抗氧化活性的内生真菌。
其中，具有抗细菌活性次生代谢产物的内生真菌包含：botryosphaeriasp.、clonostachysrogersoniana、fusariumsolani；其中，具有抗氧化活性次生代谢产物的内生真菌包含：botryosphaeriasp.、diaporthefoeniculina。
优选地，在步骤(1)中，对多蕊蛇菰用75％的乙醇、0.2％氯化汞和无菌水清洗消毒，然后接入至含有硫酸链霉素的培养基上，28℃下倒置培养。
优选地，所述硫酸链霉素的浓度为500μg/ml。
优选地，根据菌落形态、颜色的差异和时间的长短判断菌种纯度，若不纯则从菌落边缘挑取菌丝接种到培养基上再进行纯化，连续纯化多次直至菌落形态一致。
优选地，在步骤(1)中，所述鉴定采用its序列测定方法，将测得的内生真菌的rdna-its序列与现有内生真菌对比，以确定内生真菌的种类。
优选地，在步骤(2)中，所述振荡培养的条件为28℃，150rmp。
优选地，在步骤(3)中，在大米培养基中培养温度为28℃，培养时间为60天。
一种所述的制备方法获得的次生代谢产物的用途，该次生代谢产物具有抗细菌和/或抗氧化活性，用于抗细菌和/或清除自由基；其中，具有抗细菌活性次生代谢产物的内生真菌包含：botryosphaeriasp.、clonostachysrogersoniana、fusariumsolani；其中，具有抗氧化活性次生代谢产物的内生真菌包含：botryosphaeriasp.、diaporthefoeniculina。
优选地，所述次生代谢产物对大肠杆菌、黄瓜角斑病菌、番茄疮痂病菌、枯草芽孢杆菌和桉树青枯病菌具有抑菌作用。
优选地，所述botryosphaeriasp.能够作为抗桉树青枯病的生防菌。
本发明的多蕊蛇菰内生真菌抗细菌和/或抗氧化次生代谢产物的制备方法及用途，解决了现在尚未有对多蕊蛇菰内生真菌研究的问题，具有以下优点：
本发明的对多蕊蛇菰内生真菌提取，获得具有抑菌和抗氧化活性的次生代谢产物提取物，并筛选出高活性的菌株，为多蕊蛇菰内生真菌资源的综合开发提供更多的理论依据，也为进一步筛选具备抗菌和抗氧化活性化合物提供了微生物资源。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1多蕊蛇菰内生真菌的分离、纯化和保存
(1)将多蕊蛇菰用流动的自来水冲洗以除去泥沙污物；
(2)于超净工作台上，用无菌水冲洗3次，置于灭菌的滤纸片上晾干，待水分干燥后，用无菌解剖刀将多蕊蛇菰切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块；
(3)用75％的乙醇漂洗20s，无菌水冲洗3次；
(4)然后用0.2％氯化汞表面消毒20min，最后用无菌水清洗3次；
(5)每一小块分别接入含有500μg/ml的硫酸链霉素的培养基上，3块/皿，置于28℃的真菌培养箱中倒置培养，待菌丝长出后将菌丝接种到新的pda平板上，连续纯化多次直至菌落形态一致，4℃保存，备用；
实验例2多蕊蛇菰内生真菌的鉴定
(1)根据植物内生真菌菌落形态特征，包括菌落大小、颜色、生长速率、表面特征和着生方式等，对形态差异较为明显的菌株进行肉眼观察并分类。从多蕊蛇菰中共分离得到22株形态各异的内生真菌，分别编号为bpf-1～bpf-22。
(2)采用分子生物学方法进进一步对分离到的22株内生真菌进行鉴定
将多蕊蛇菰内生真菌接入液体培养基中，摇培5～7天，过滤后收集其菌丝。
用液氮将菌丝充分研磨至粉末状，采用试剂盒法(上海生工dna抽提取试剂盒)提取其dna。
扩增its序列的引物为：
its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′；
its5：5′-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3′。
反应体系为：pcr反应液总体积为50μl，其中2×taqpcrmastermix(含染料)25μl，上下游引物各1μl，dna模版3μl，双蒸水补足到50μl，混匀。
pcr扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存。
所得序列使用dnaman软件进行互补，将正向与反向互补序列两端加上引物序列拼接成完整序列，所得的rdna-its序列提交到genbank数据库(nationalcenterforbiotechnologyinformationwebsite[http://www.ncbi.nlm.nih.gov])，获得其登录号。
bpf-1为：clonostachysrogersoniana(genbank登录号：mh378888)；bpf-2为：gliocladiopsisforsbergii(genbank登录号：mh378889)；bpf-3为：calonectriaeucalypti(genbank登录号：mh397479)；bpf-4为：gliocephalotrichumsp.(genbank登录号：mh397480)；bpf-5为：calonectriacurvispora(genbank登录号：mh397481)；bpf-6为：pestalotiopsissp.(genbank登录号：mh397482)；bpf-7为：botryosphaeriadothidea(genbank登录号：mh397483)；bpf-8为：trichodermahamatum(genbank登录号：mh397484)；bpf-9为：calonectriahongkongensis(genbank登录号：mh397485)；bpf-10为：diaporthefoeniculina(genbank登录号：mh397486)；bpf-11为：botryosphaeriasp.(genbank登录号：mh397487)；bpf-12为：myrotheciumsp.(genbank登录号：mh397488)；bpf-13为：cylindrocladiellalageniformis(genbank登录号：mh397489)；bpf-14为：fusariumsolani(genbank登录号：mh397490)；bpf-15为：clonostachysrosea(genbank登录号：mh397491)；bpf-16为：fusariumsp.(genbank登录号：mh397492)；bpf-17为：colletotrichumacutatum(genbank登录号：mh397493)；bpf-18为：calonectriapseudoreteaudii(genbank登录号：mh397494)；bpf-19为：mucorirregularis(genbank登录号：mh397495)；bpf-20为：lasiodiplodiapseudotheobromae(genbank登录号：mh397496)；bpf-21为：colletotrichumgloeosporioides(genbank登录号：mh397497)；bpf-22为：neofusicoccumsp.(genbank登录号：mh397498)。bpf-1～bpf-22均为已知菌种。
实验例3多蕊蛇菰内生真菌次生代谢产物的制备
(1)将冻存管中的菌株在pda平板上活化4～7天，然后将活化好的菌株接入每瓶装有20ml马铃薯液体培养基的三角瓶中，每菌培养2瓶；
(2)于28℃，150rmp的条件下振荡培养5～7天，然后将液体种子接入已提前灭菌的大米培养基中，培养温度为28℃，培养时间为60天；
(3)发酵完成后将发酵产物在乙酸乙酯中冷浸提取三次，每次7天，然后将浸提液真空抽滤，减压浓缩后得到乙酸乙酯粗提取物。
实验例4多蕊蛇菰内生真菌次生代谢产物抗菌活性检测
采用tlc-mtt-生物自显影法测定内生真菌提取物对不同供试细菌的抑制活性：
(1)用点样毛细管(直径:0.5mm)吸取溶解的乙酸乙酯层粗提物，均匀点在薄层板上，点样量为5μl；
(2)采用比例为4:1的石油醚和丙酮的混合液作为展开剂进行薄层层析，薄层层析后在薄层板的一侧原点处点上500μg/ml硫酸链霉素作为阳性对照；
(3)向lb半固体培养基(琼脂浓度为0.5％)中加入一定量准备好的菌液(45mllb+5ml供试细菌液)，将其浓度调至约108cfu/ml，振荡、均匀；
(4)用移液枪吸取菌液混合液均匀铺到tlc板上，28℃下保湿培养，12h后取出薄层板，均匀喷洒噻唑蓝(mtt)，等待1min之后可观察到薄层板上颜色的变化和抑菌圈的大小。
其中，供试细菌为：大肠杆菌(escherichiacoli)、黄瓜角斑病菌(pseudomonaslachrymans)、番茄疮痂病菌(xanthomonasvesicatoria)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和桉树青枯病菌(ralstoniasolanacearum)。
供试细菌生长抑制区域不显色，其余显蓝紫色。通过抗菌斑点的迁移率(即rf值)来初步评价样品中抗菌化合物的数量和极性，根据抗菌斑点的大小来初步评价化合物的活性和含量。
rf值计算公式如下：
表2多蕊蛇菰内生真菌次生代谢产物抗细菌活性表
注：“－”表示无抗菌活性；“+”表示抗菌斑最大直径d＜5mm，“++”表示5mm≤d＜10mm，“+++”表示d≥10mm；阳性对照硫酸链霉素仅在原位点样。
从表2可看出，菌株bpf-1、bpf-4、bpf-10、bpf-11和bpf-14表现出了相对较好的抑菌活性，其中菌株bpf-11对5种供试细菌的抑菌作用最强，其次是菌株bpf-1、bpf-14，对所有供试细菌的抑菌斑直径均大于10mm，强于阳性对照硫酸链霉素。除菌株bpf-5和bpf-13对枯草芽孢杆菌不表现出抗菌活性，菌株bpf-6和bpf-13、bpf-18对黄瓜角斑病菌不表现出抗菌活性，其余内生真菌粗提物均对所有病原菌表现出一定的抑制作用。
针对不同类型的供试细菌而言，大多数多蕊蛇菰内生真菌对桉树青枯病菌和番茄疮痂病菌表现出普遍较强的抑菌作用；对枯草芽孢杆菌和黄瓜角斑病菌的抑菌活性中等，对大肠杆菌的抑菌活性相对较弱，表明了多蕊蛇菰内生真菌的提取物对革兰氏阴性菌的活性略强于革兰氏阳性菌。
实验例5多蕊蛇菰内生真菌次生代谢产物抗氧化活性检测
采用dpph自由基清除法测定多蕊蛇菰内生真菌提取物的抗氧化活性，其原理是dpph在有机溶剂中是一种稳定的合成自由基，溶液呈现紫红色，在517nm处有一强吸收峰，当自由基清除剂与dpph孤对电子配对时，颜色将逐渐变淡，吸光值也随之变小。
抗氧化活性检测检测步骤如下：
(1)精密称取20mgdpph，无水乙醇溶解，并定容至100ml，即得到0.2mg/mldpph溶液；
(2)精密称取20mg阳性对照bht(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)溶于1ml无水乙醇中，即得到20mg/mlbht溶液，并用无水乙醇依次稀释成初始浓度为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125mg/ml阳性对照溶液；
(3)把配置好的dpph溶液和bht溶液4℃避光保存，备用；
(4)精密称取100mg各次生代谢产物溶于1ml无水乙醇中，即得到100mg/ml各次生代谢产物溶液，然后用无水乙醇依次稀释成初始浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625mg/ml样品溶液，保存备用；
(5)三种溶液配制好之后，首先向96微孔板中加入80μl浓度为0.2mg/ml的dpph溶液，再加入20μl系列浓度的样品溶液或阳性对照溶液，振荡摇匀10min，37℃下水浴30min后，在517nm波长处测定吸光度，每个样品均做3个重复，每个重复测定3次；其中，bht作为阳性对照，以20μldmso作为空白对照。
dpph清除率的计算公式如下：
表3多蕊蛇菰内生真菌次生代谢产物和bht对dpph清除活性的线性关系表
从表3可看出，22株多蕊蛇菰内生真菌粗提物和bht对dpph清除活性都存在着一定的线性关系，再根据各线性方程可计算所有菌株的ic50值。ic50值越小，清除dpph自由基的能力越高，抗氧化活性越强。通过比较所有样品和阳性对照bht的ic50值，可看出所有提取物均表现出一定的抗氧化活性，但对dpph自由基的清除能力差异较大。菌株bpf-10、bpf-11、bpf-12、bpf-13和bpf-14均表现出较好的抗氧化活性，其中菌株bpf-11的抗氧化活性最强，其ic50值为0.445mg/ml；其次是菌株bpf-10，ic50值为0.457mg/ml；菌株bpf-12、bpf-13、bpf-14列居其后，ic50值分别为0.747mg/ml、0.728mg/ml、0.709mg/ml。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。