本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种用于免疫治疗的腺病毒载体。
背景技术：
腺病毒是无包膜的线性双链dna病毒，在自然界分布广泛，至少存在100种以上的血清型。其基因组长约36kb，两端各有一个反向末端重复区(itr)，itr内侧为病毒包装信号。基因组上分布着4个早期转录元(e1、e2、e3、e4)承担调节功能，以及一个晚期转录元负责结构蛋白的编码。早期基因e2产物是晚期基因表达的反式因子和复制必须因子，早期基因e1a、e1b产物还为e2等早期基因表达所必须。因此，e1区的缺失可造成病毒在复制阶段的流产。e3为复制非必须区，其缺失则可以大大地扩大插入容量。腺病毒载体大多以5型(ad5)、2型(ad2)为基础，新增了55型(ad55)，很多研究机构在研究当中，55型将比5型流行以及应用更具广泛性。
腺病毒载体具有较高的感染效率，一直在基因治疗中扮演重要角色，是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广的病毒载体之，然而腺病毒载体介导基因转导仍面临很多问题，由于腺病毒的宿主范围较广，在感染靶组织的同时也感染其他正常组织，体内应用时存在明显的组织细胞非特异性分布，特别是易在肝脏内聚集，产生毒副作用，从而导致腺病毒载体不能将目的基因有针对性的有效的导入目的细胞(例如肿瘤细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、外周血细胞、造血干细胞以及树突状细胞等)，所以迫切需要改变腺病毒载体的天然嗜性，构建针对特定组织和细胞的靶向性腺病毒载体。
技术实现要素：
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于免疫治疗的腺病毒载体，解决了目前由于腺病毒的宿主范围较广，从而导致腺病毒载体不能将目的基因有针对性的有效的导入目的细胞的问题。
(二)技术方案
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种用于免疫治疗的腺病毒载体，是将干扰片段序列通过基因工程技术，包装到ad5复制缺陷型腺病毒中，构建重组腺病毒干扰载体ad-sidhcr24，所述ad5复制的缺陷型腺病毒是ad293细胞，通过腺病毒外壳纤维的改造，将经过改造的病毒骨架质粒和携带不同外源基因的穿梭质粒共转染ad293细胞，即可包装出携带不同外源基因的靶向性腺病毒。
所述腺病毒载体包括编码hpv分化体benv蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体、编码hpv分化体cenv蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体，其中benv蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体独立地是血清型26、血清型28和或血清型35，由此在哺乳动物中产生hpv蛋白并且诱导针对hpv的免疫应答，将benv蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体中的阳性克隆菌分别在含amp和cm的抗性培养基中生长，且在含amp和cm抗性培养基中不能生长的克隆菌即为目的阳性克隆菌e。
所述阳性克隆菌e中e1、e3基因被敲除之后，所述阳性克隆菌e基因组中的e4基因开放阅读框6，由e4基因开放的阅读框6为ad293细胞包装出靶向性腺病毒做向导标记，所述ad293细胞中含有插入pad-efa-gfp腺病毒载体多克隆位点的ep153r基因，所述腺病毒干扰载体ad-sidhcr24中还含有与启动子有效连接的ctla4ig重组基因。
优选的，所述dhcr24干扰片段序列中的其中一个片段为：正义链：agcacaggcatcgagtcatctttt，反义链：agatgactcgatgcctgtgctttt。
优选的，所述benv蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体包括一种或多种核酸序列，所述核酸序列编码与由所述腺病毒载体组合物中的腺病毒载体所编码的hpv蛋白相同的至少一种hpv蛋白。
优选的，所述阳性克隆菌e基因组中的e4基因区域整合外源基因表达框，所述e4基因为在重组腺病毒干扰载体ad-sidhcr24中的fiber头部hi-loop区插入单一限制性内切酶swa1提供识别位点。
优选的，所述pad-efa-gfp腺病毒载体多克隆位点为asisi和mlui的酶切位点。
优选的，所述ctla4ig重组基因中连接有一段来源于核糖体的非编码序列。
(三)有益效果
本发明提供了一种用于免疫治疗的腺病毒载体，与现有技术相比，本发明的有益效果是：该用于免疫治疗的腺病毒载体，通过构建重组腺病毒干扰载体ad-sidhcr24，通过腺病毒外壳纤维的改造，并且编码hpv分化体cenv蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体，在哺乳动物中产生hpv蛋白并且诱导针对hpv的免疫应答，通过在腺病毒载体中添加外源重组基因、向导标记以及酶切识别位点，从而改变了腺病毒载体的天然嗜性，使得腺病毒载体的导向更具针对性，避免腺病毒载体感染其他正常组织，使得腺病毒载体所展现的整体的毒副作用更小，从而使得腺病毒载体在免疫治疗中有着更好的效果。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种用于免疫治疗的腺病毒载体，是将干扰片段序列通过基因工程技术，包装到ad5复制缺陷型腺病毒中，构建重组腺病毒干扰载体ad-sidhcr24，dhcr24干扰片段序列中的其中一个片段为：正义链：agcacaggcatcgagtcatctttt，反义链：agatgactcgatgcctgtgctttt，ad5复制的缺陷型腺病毒是ad293细胞，通过腺病毒外壳纤维的改造，将经过改造的病毒骨架质粒和携带不同外源基因的穿梭质粒共转染ad293细胞，即可包装出携带不同外源基因的靶向性腺病毒。
腺病毒载体包括编码hpv分化体benv蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体、编码hpv分化体cenv蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体，其中benv蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体独立地是血清型26、血清型28和或血清型35，benv蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体包括一种或多种核酸序列，核酸序列编码与由腺病毒载体组合物中的腺病毒载体所编码的hpv蛋白相同的至少一种hpv蛋白，腺病毒载体被迅速地从血流中清除，因此降低了载体在运送生物相应量的基因产物中的功效，并且，某些病毒载体的免疫原性防止有效的重复给药，其可以有利“增强”针对病原体的免疫系统，并且导致只有少部分剂量的病毒载体将其有效负荷运送到宿主细胞，腺病毒载体结构是多样性的，最广泛的可能范围内的保护性体液和细胞免疫应答的关键决定簇，由此在哺乳动物中产生hpv蛋白并且诱导针对hpv的免疫应答，将benv蛋白的核酸的复制缺陷型腺病毒载体中的阳性克隆菌分别在含amp和cm的抗性培养基中生长，且在含amp和cm抗性培养基中不能生长的克隆菌即为目的阳性克隆菌e，阳性克隆菌e基因组中的e4基因区域整合外源基因表达框，乙醇沉淀法回收后共转化bj5183感受态细胞，涂至氨苄抗性平板，手工提取质粒后，继续转化xl-blue感受态细胞，手工提取质粒并进行酶切鉴定，得到去除kana抗性基因并在e1区引入唯一酶切位点pmei的基因组质粒pad55△e10e3，e4基因为在重组腺病毒干扰载体ad-sidhcr24中的fiber头部hi-loop区插入单一限制性内切酶swa1提供识别位点，阳性克隆菌的阳性率从原来的1％提高到了约50％，阳性克隆的正确率接近100％，大大降低了假阳性克隆的产生，这也解决了我们一直以来饱受第二步重组阳性率极低的困扰，提高了工作效率，在实际工作中，我们将比较受欢迎的启动子、目的基因及示踪基因等分别构建到相应的pdonr载体中形成对应的入门克隆，然后根据客户的不同需要进行灵活自由搭配，只要进行一步lr反应，即可将多个片段同时快速灵活高效地克隆到腺病毒载体中，大大缩短了服务周期和节约了时间耗材成本。
阳性克隆菌e中e1、e3基因被敲除之后，阳性克隆菌e基因组中的e4基因开放阅读框6，由e4基因开放的阅读框6为ad293细胞包装出靶向性腺病毒做向导标记，ad293细胞中含有插入pad-efa-gfp腺病毒载体多克隆位点的ep153r基因，pad-efa-gfp腺病毒载体多克隆位点为asisi和mlui的酶切位点，通过设置asisi和mlui的酶切位点，将片段连接至t载体，便于扩增与酶切，用限制性内切酶asisi和mlui分别对基因合成序列ep153r和腺病毒穿梭质粒载体pk0-fh进行双酶切，分别得到线性化ep153r基因片段和pk0载体片段，腺病毒干扰载体ad-sidhcr24中还含有与启动子有效连接的ctla4ig重组基因，ctla4ig重组基因中连接有一段来源于核糖体的非编码序列，从而成功构建含有cd40ig-ctla4ig双基因的ad5f35嵌合型腺病毒载体，同时阻断cd40/cd40l和b7/cd28通道，既抑制细胞免疫排斥反应又抑制了体液免疫排斥反应。
以上的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。