一种RNA荧光原位杂交液及其应用的制作方法

本发明涉及分子杂交检测
技术领域：
，具体涉及一种rna荧光原位杂交液及其在rna探针筛选和rna流式荧光原位杂交检测方面的应用。
背景技术：
：rna探针是原位杂交技术中检测组织细胞内rna表达的一种工具。通常有crna、cdna探针和人工合成的寡核苷酸探针。由于crna、cdna探针制备比较比较困难，人工合成的寡核苷酸探针序列较短、不需要纯化、组织穿透性好等优点被选用为常用的探针。纳米微球是一种粒径在微米级的小球，可作为药物载体、酶载体、磁珠等广泛应用于生物制药、医疗检测等领域。链霉亲和素标记的微球是其中的一类，可高效结合生物素标记的抗体、核酸、蛋白等配体。这种链霉亲和素-生物素信号放大/检测系统广泛应用于elisa、免疫组织化学、southernrblot等分析，以及生物素标记分子的纯化等。fish-flow是将荧光原位杂交技术与流式细胞仪相结合，可同时检测细胞内基因和蛋白的表达。以其高通量、高灵敏性、高精确度、高稳定性、实时性等优点，广泛应用于科研领域和医学领域。其先将细胞进行固定与通透，然后探针在杂交缓冲液中与靶基因结合，再经流式细胞进行检测与分析。但是rna探针是fish-flow技术中的关键工具，其与靶基因结合的稳定性、特异性直接影响结果的判读。所以在fish-flow之前，特别是在检测多重靶基因时，有必要对探针进行筛选。目前尚未见运用链霉亲和素标记的微球联合fish-flow技术对rna探针进行筛选的相关报道。fish-flow技术中关键步骤在于探针与靶基因的杂交，但在现有技术中，检测的灵敏性还有待进一步提高。技术实现要素：针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种荧光原位杂交缓冲液，同时提供了该杂交缓冲液在rna探针筛选和rna流式荧光原位杂交检测方面的应用。利用本发明的杂交液建立的rna探针筛选方法快速简捷，能快速精确的筛选出与靶基因结合能力强的探针，定量分析探针之间的优劣。利用本发明的杂交液和rna探针筛选方法建立的rna流式荧光原位杂交体系，能大大提高灵敏性。本发明的第一个目的提供了一种荧光原位杂交缓冲液，所述荧光原位杂交缓冲液由硫酸葡聚糖、tris、tween-20、bsa、mgcl2、nacl和甲酰胺组成；其中，所述硫酸葡聚糖的质量体积百分比浓度为20％；所述tris的摩尔浓度为40mm；所述tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述bsa的质量体积百分比浓度为0.2％；所述mgcl2的摩尔浓度为4mm；所述nacl的摩尔浓度为0.3m；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述荧光原位杂交缓冲液的ph值为8.5-9.2。本发明的第二个目的是提供了一种rna探针筛选方法，所述筛选方法应用了权利要求1所述的荧光原位杂交缓冲液；所述筛选方法包括如下步骤：(1)制备含生物素标记的rna：体外转录含生物素标记的rna，纯化后测定所述生物素标记的rna的浓度；(2)预杂交：取链霉亲和素标记的微球到无rna酶的ep管中，用预杂交液洗涤，去除上清后，加入5μl浓度为0.5μm的探针和100ng步骤(1)中得到的rna，用预杂交液补足至10μl，得到预杂交混合液；(3)杂交：在步骤(2)中得到的所述预杂交混合液中加入10μl的所述荧光原位杂交缓冲液；涡旋混匀后置于恒温混匀仪上65-70℃，1000rpm孵育30min，然后自然降温至室温；(4)检测：用洗涤液洗涤后，用流式细胞仪检测并分析；(5)筛选的标准：选择平均荧光强度p/n>5的探针。因为平均荧光强度p/n>5的探针是具有较强的结合力。优选的，所述步骤(2)中的预杂交液由tris、tween-20、bsa、mgcl2、nacl和甲酰胺组成；其中，所述tris的摩尔浓度为40mm；所述tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述bsa的质量体积百分比浓度为0.2％；所述mgcl2的摩尔浓度为4mm；所述nacl的摩尔浓度为0.3m；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述预杂交液的ph值为8.5-9.2。优选的，所述步骤(4)中的洗涤液由tris、tween-20、bsa、mgcl2和甲酰胺组成；其中，所述tris的摩尔浓度为40mm；所述tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述bsa的质量体积百分比浓度为0.2％；所述mgcl2的摩尔浓度为4mm；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述洗涤液的ph值为8.5-9.2。本发明的第三个目的是提供了一种rna流式荧光原位杂交方法，所述杂交方法应用了权利要求1所述的荧光原位杂交缓冲液；所述杂交方法包括如下步骤：(1)细胞的固定和通透：取待检测的细胞至ep管中，先用质量体积百分比浓度为4％的多聚甲醛固定，再用体积百分比浓度为1％的tritox-100对所述细胞进行通透；(2)预杂交：在步骤(1)中的ep管中加入预杂交液，离心，去上清。然后再加入50μl预杂交液重悬步骤(1)中所述的细胞；(3)杂交：在步骤(2)中的ep管中加入筛选后的rna探针和50μl所述荧光原位杂交缓冲液，涡旋混匀，放入恒温培养箱中，65-70℃孵育30min；(4)检测：将步骤(3)中的ep管室温放置1小时，用37℃洗涤液洗涤所述细胞，用流式细胞仪检测。优选的，所述步骤(2)中的预杂交液由tris、tween-20、bsa、mgcl2、nacl和甲酰胺组成；其中，所述tris的摩尔浓度为40mm；所述tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述bsa的质量体积百分比浓度为0.2％；所述mgcl2的摩尔浓度为4mm；所述nacl的摩尔浓度为0.3m；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述预杂交液的ph值为8.5-9.2。所述步骤(3)中的rna探针为用上述筛选rna探针的方法筛选后的fam标记的荧光探针。优选的，所述步骤(4)中的洗涤液由tris、tween-20、bsa、mgcl2和甲酰胺组成；其中，所述tris的摩尔浓度为40mm；所述tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述bsa的质量体积百分比浓度为0.2％；所述mgcl2的摩尔浓度为4mm；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述洗涤液的ph值为8.5-9.2。本发明的第四个目的是提供了一种rna探针筛选试剂盒，所述筛选试剂盒包括链霉亲和素标记的微球、无rna酶的ep管、预杂交液、荧光原位杂交缓冲液和洗涤液。其中，所述预杂交液由tris、tween-20、bsa、mgcl2、nacl和甲酰胺组成；其中，所述tris的摩尔浓度为40mm；所述tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述bsa的质量体积百分比浓度为0.2％；所述mgcl2的摩尔浓度为4mm；所述nacl的摩尔浓度为0.3m；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述预杂交液的ph值为8.5-9.2。所述荧光原位杂交缓冲液由硫酸葡聚糖、tris、tween-20、bsa、mgcl2、nacl和甲酰胺组成；其中，所述硫酸葡聚糖的质量体积百分比浓度为20％；所述tris的摩尔浓度为40mm；所述tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述bsa的质量体积百分比浓度为0.2％；所述mgcl2的摩尔浓度为4mm；所述nacl的摩尔浓度为0.3m；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述荧光原位杂交缓冲液的ph值为8.5-9.2。所述洗涤液由tris、tween-20、bsa、mgcl2和甲酰胺组成；其中，所述tris的摩尔浓度为40mm；所述tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述bsa的质量体积百分比浓度为0.2％；所述mgcl2的摩尔浓度为4mm；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述洗涤液的ph值为8.5-9.2。本发明的第五个目的是提供了一种rna流式荧光原位杂交试剂盒，所述试剂盒包括质量体积百分比浓度为4％的多聚甲醛、体积百分比浓度为1％的tritox-100、预杂交液、荧光原位杂交缓冲液和洗涤液；其中，所述预杂交液由tris、tween-20、bsa、mgcl2、nacl和甲酰胺组成；其中，所述tris的摩尔浓度为40mm；所述tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述bsa的质量体积百分比浓度为0.2％；所述mgcl2的摩尔浓度为4mm；所述nacl的摩尔浓度为0.3m；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述预杂交液的ph值为8.5-9.2；所述荧光原位杂交缓冲液由硫酸葡聚糖、tris、tween-20、bsa、mgcl2、nacl和甲酰胺组成；其中，所述硫酸葡聚糖的质量体积百分比浓度为20％；所述tris的摩尔浓度为40mm；所述tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述bsa的质量体积百分比浓度为0.2％；所述mgcl2的摩尔浓度为4mm；所述nacl的摩尔浓度为0.3m；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述荧光原位杂交缓冲液的ph值为8.5-9.2。所述洗涤液由tris、tween-20、bsa、mgcl2和甲酰胺组成；其中，所述tris的摩尔浓度为40mm；所述tween-20的体积百分比浓度为0.2％；所述bsa的质量体积百分比浓度为0.2％；所述mgcl2的摩尔浓度为4mm；所述甲酰胺的体积百分比浓度为10％；所述洗涤液的ph值为8.5-9.2。利用本发明的杂交液建立的rna探针筛选方法快速简捷，能精确的评价探针与靶基因结合能力的强弱，筛选出与靶基因结合能力强的探针，剔除劣势探针，定量分析探针之间的优劣。利用本发明的杂交液和rna探针筛选方法建立的rna流式荧光原位杂交体系，能实现更高的检测灵敏性。附图说明图1为本发明的杂交体系检测293t细胞cmv基因表达的流式柱状图；其中，图1a、图1b、图1c为三次重复实验的结果图；图2为本发明的杂交体系检测cmv质粒转染293t细胞的cmv基因表达的流式柱状图；其中，图2a、图2b、图2c为三次重复实验的结果图；图3为传统杂交体系检测293t细胞cmv基因表达的流式柱状图；其中，图3a、图3b、图3c为三次重复实验的结果图；图4为传统杂交体系检测cmv质粒转染293t细胞的cmv基因表达的流式柱状图；其中，图4a、图4b、图4c为三次重复实验的结果图。具体实施方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照本领域中常规实验方法进行。实施例1：本发明中的荧光原位杂交缓冲液配制的一个优选实施例本实施例按以下组分配制一份100ml的荧光原位杂交缓冲液：硫酸葡聚糖、tris、tween-20、bsa、mgcl2、nacl和甲酰胺。具体配制方法如下：称量20克硫酸葡聚糖、0.48克的tris、0.2克的bsa、0.08克的mgcl2.6h2o、1.75克的nacl用50ml纯净水溶解，再加入0.2ml的tween-20和10ml的甲酰胺，最后补充纯净水到100ml。用乙酸调节ph值到8.5。在另两个优选实施例里，可以用乙酸调节ph值分别到9.2和8.9。在本实施例中，配制后的荧光原位杂交缓冲液的各组分浓度为：硫酸葡聚糖的质量体积百分比浓度为20％，tris的摩尔浓度为40mm，tween-20的体积百分比浓度为0.2％，bsa的质量体积百分比浓度为0.2％，mgcl2的摩尔浓度为4mm，nacl的摩尔浓度为0.3m，甲酰胺的体积百分比浓度为10％；ph值为8.5。实施例2：rna探针筛选试剂盒的一个优选实施例本实施例的rna探针筛选试剂盒包括链霉亲和素标记的聚苯乙烯微球、无rna酶的ep管、预杂交液、荧光原位杂交缓冲液和洗涤液。链霉亲和素标记的聚苯乙烯微球中的链霉亲和素与生物素的结合率≥950pmol/mg,与生物素标记的igg结合率高达10μg/mg。其中，所述预杂交液由tris、tween-20、bsa、mgcl2、nacl和甲酰胺组成；配制方法如下：称量4.85克tris，2克bsa，0.81克mgcl2·6h2o，17.53克nacl，用800ml纯净水溶解，再加入2ml的tween-20和100ml的甲酰胺，用乙酸调节ph值到8.5-9.2，最后补充纯净水到1000ml。配制后的预杂交液中，tris的摩尔浓度为40mm、tween-20的体积百分比浓度为0.2％、bsa的质量体积百分比浓度为0.2％、mgcl2的摩尔浓度为4mm、nacl的摩尔浓度为0.3m、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、预杂交液的ph值为8.5。在另两个优选实施例里，配制后的预交杂液可以用乙酸调节ph值分别到9.2和8.9。所述荧光原位杂交缓冲液由硫酸葡聚糖、tris、tween-20、bsa、mgcl2、nacl和甲酰胺组成；配制方法按实施例1中所述的方法进行。配制后的荧光原位杂交缓冲液中的硫酸葡聚糖的质量体积百分比浓度为20％、tris的摩尔浓度为40mm、tween-20的体积百分比浓度为0.2％、bsa的质量体积百分比浓度为0.2％、mgcl2的摩尔浓度为4mm、nacl的摩尔浓度为0.3m、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、荧光原位杂交缓冲液的ph值为8.5。所述洗涤液由tris、tween-20、bsa、mgcl2和甲酰胺组成；配制方法如下：称量4.85克tris，2克bsa，0.81克mgcl2·6h2o，用800ml纯净水溶解，再加入2ml的tween-20,和100ml的甲酰胺，用乙酸调ph值到8.5-9.2，最后补充纯净水到1000ml。配制后的洗涤液中，tris的摩尔浓度为40mm、tween-20的体积百分比浓度为0.2％、bsa的质量体积百分比浓度为0.2％、mgcl2的摩尔浓度为4mm、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、洗涤液的ph值为8.5。在另两个优选实施例里，配制后的洗涤液可以用乙酸调节ph值分别到9.2和8.9。实施例3：rna流式荧光原位杂交试剂盒的一个优选实施例本实施例的rna流式荧光原位杂交试剂盒包括质量体积百分比浓度为4％的多聚甲醛、体积百分比浓度为1％的tritox-100、预杂交液、荧光原位杂交缓冲液和洗涤液。其中，所述预杂交液由tris、tween-20、bsa、mgcl2、nacl和甲酰胺组成；配制方法如下：称量4.85克tris，2克bsa，0.81克mgcl2·6h2o，17.53克nacl，用800ml纯净水溶解，再加入2ml的tween-20,和100ml的甲酰胺，用乙酸调ph值到9.2，最后补充纯净水到1000ml。配制后的预杂交液中，tris的摩尔浓度为40mm、tween-20的体积百分比浓度为0.2％、bsa的质量体积百分比浓度为0.2％、mgcl2的摩尔浓度为4mm、nacl的摩尔浓度为0.3m、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、预杂交液的ph值为8.5。荧光原位杂交缓冲液由硫酸葡聚糖、tris、tween-20、bsa、mgcl2、nacl和甲酰胺组成；配制方法按实施例1中所述的方法进行。配制后的荧光原位杂交缓冲液中，硫酸葡聚糖的质量体积百分比浓度为20％、tris的摩尔浓度为40mm、tween-20的体积百分比浓度为0.2％、bsa的质量体积百分比浓度为0.2％、mgcl2的摩尔浓度为4mm、nacl的摩尔浓度为0.3m、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、荧光原位杂交缓冲液的ph值范围可以为8.5-9.2。洗涤液由tris、tween-20、bsa、mgcl2和甲酰胺组成；配制方法如下：称量4.85克tris，2克bsa，0.81克mgcl2·6h2o，用800ml纯净水溶解，再加入2ml的tween-20和100ml的甲酰胺，用乙酸调ph值到8.5-9.2，最后补充纯净水到1000ml。配制后的荧光原位杂交缓冲液中，tris的摩尔浓度为40mm、tween-20的体积百分比浓度为0.2％、bsa的质量体积百分比浓度为0.2％、mgcl2的摩尔浓度为4mm、甲酰胺的体积百分比浓度为10％、洗涤液的ph值调整范围可以为8.5-9.2。实施例4：利用实施例2中的rna探针筛选试剂盒对cmv探针进行筛选的一个优选实施例本实施例为利用实施例2中的rna探针筛选试剂盒对cmv探针进行筛选的一个优选实施例，操作按如下步骤进行：(1)第一步：探针设计根据cmvmrna序列设计探针，每条探针5’端均用fam标记。cmvmrna序列信息如seqidno：1所示，具体如下：5’-atggagtcgcgcggtcgccgttgtcccgaaatgatatccgtactgggtcccatttcggggcacgtgctgaaagccgtgtttagtcgcggcgatacgccggtgctgccgcacgagacgcgactcctgcagacgggtatccacgtacgcgtgagccagccctcgctgatcctggtgtcgcagtacacgcccgactcgacgccatgccaccgcggcgacaatcagctgcaggtgcagcacacgtactttacgggcagcgaggtggagaacgtgtcggtcaacgtgcacaaccccacgggccgaagcatctgccccagccaagagcccatgtcgatctatgtgtacgcgctgccgctcaagatgctgaacatccccagcatcaacgtgcaccactacccgtcggcggccgagcgcaaacaccgacacctgcccgtagccgacgctgttattcacgcgtcgggcaagcagatgtggcaggcgcgtctcacggtctcgggactggcctggacgcgtcagcagaaccagtggaaagagcccgacgtctactacacgtcagcgttcgtgtttcccaccaaggacgtggcactgcggcacgtggtgtgcgcgcacgagctggtttgctccatggagaacacgcgcgcaaccaagatgcaggtgataggtgaccagtacgtcaaggtgtacctggagtccttctgcgaggacgtgccctccggcaagctctttatgcacgtcacgctgggctctgacgtggaagaggacctaacgatgacccgcaacccgcaacccttcatgcgcccccacgagcgcaacggctttacggtgttgtgtcccaaaaatatgataatcaaaccgggcaagatctcgcacatcatgctggatgtggcttttacctcacacgagcattttgggctgctgtgtcccaagagcatcccgggcctgagcatctcaggtaacctgttgatgaacgggcagcaaatcttcctggaggtacaagcgatacgcgagaccgtggaactgcgtcagtacgatcccgtggctgcgctcttctttttcgatatcgacttgttgctgcagcgcgggcctcagtacagcgagcaccccaccttcaccagccagtatcgcatccagggcaagcttgagtaccgacacacctgggaccggcacgacgagggtgccgcccagggcgacgacgacgtctggaccagcggatcggactccgacgaagaactcgtaaccaccgagcgtaagacgccccgcgtcaccggcggcggcgccatggcgggcgcctccacttccgcgggccgcaaacgcaaatcagcatcctcggcgacggcgtgcacggcgggcgttatgacacgcggccgccttaaggccgagtccaccgtcgcgcccgaagaggacaccgacgaggattccgacaacgaaatccacaatccggccgtgttcacctggccgccctggcaggccggcatcctggcccgcaacctggtgcccatggtggctacggttcagggtcagaatctgaagtaccaggagttcttctgggacgccaacgacatctaccgcatcttcgccgaattggaaggcgtatggcagcccgctgcgcaacccaaacgtcgccgccaccggcaagacgccttgcccgggccatgcatcgcctcgacgcccaaaaagcaccgaggttga-3’设计探针序列如seqidno：2-34所示，具体如下：cmv-1:5’-catttcgggacaacggcgac-3’cmv-2:5’-cgaaatgggacccagtacgg-3’cmv-3:5’-actaaacacggctttcagca-3’cmv-4:5’-tactgcgacaccaggatcag-3’cmv-5:5’-ttgtgcacgttgaccgacac-3’cmv-6:5’-cgcgtacacatagatcgaca-3’cmv-7:5’-gatgttcagcatcttgagcg-3’cmv-8:5’-ggtagtggtgcacgttgatg-3’cmv-9:5’-gacgcgtgaataacagcgtc-3’cmv-10:5’-tttccactggttctgctgac-3’cmv-11:5’-ctgacgtgtagtagacgtcg-3’cmv-12:5’-acgtccttggtgggaaacac-3’cmv-13:5’-gtgttctccatggagcaaac-3’cmv-14:5’-tatcacctgcatcttggttg-3’cmv-15:5’-cagaaggactccaggtacac-3’cmv-16:5’-cgtgacgtgcataaagagct-3’cmv-17:5’-agcatgatgtgcgagatctt-3’cmv-18:5’-tcgtgtgaggtaaaagccac-3’cmv-19:5’-atgctcttgggacacagcag-3’cmv-20:5’-gttcatcaacaggttacctg-3’cmv-21:5’-tgtacctccaggaagatttg-3’cmv-22:5’-tcgtactgacgcagttccac-3’cmv-23:5’-aaaaagaagagcgcagccac-3’cmv-24:5’-cgctgcagcaacaagtcgat-3’cmv-25:5’-gatactggctggtgaaggtg-3’cmv-26:5’-tgtgtcggtactcaagcttg-3’cmv-27:5’-ttacgagttcttcgtcggag-3’cmv-28:5’-aggatgctgatttgcgtttg-3’cmv-29:5’-tttcgttgtcggaatcctcg-3’cmv-30:5’-aggtgaacacggccggattg-3’cmv-31:5’-attctgaccctgaaccgtag-3’cmv-32:5’-ccagaagaactcctggtact-3’cmv-33:5’-cttccaattcggcgaagatg-3’(2)第二步：体外转录cmvmrna按下列体系配制反应液：37℃反应2小时，纯化rna。以上cmv线性模板为pcr扩增的含t7序列的线性模板。pcr扩增为本行业常规技能。rna的纯化为本行业的常规技能。(3)第三步：探针筛选取适量链霉亲和素标记的微球，用实施例2的试剂盒中的预杂交液洗涤后，加入100ngcmvmrna，5μl浓度为0.5μmcmv探针，用预杂交液补足至10μl，混匀。再加入10μl实施例2的试剂盒中的荧光原位杂交缓冲液，涡旋混匀。置于恒温混匀仪上，设置温度65℃，转速1000rpm，时间30min。然后在同台恒温混匀仪上自然降温至室温。加入1ml实施例2的试剂盒中的洗涤液洗涤一次，1000g室温离心5min，去除上清液。加入100μl洗涤液，混匀微球，用流式细胞仪进行检测。结果如表1所示，表1为用本发明的杂交体系进行cmv探针筛选的结果。表1在本实施例中，同时采用传统杂交体系进行了探针筛选的对照实验，具体实验过程如下：取适量链霉亲和素标记的微球，用传统杂交洗液洗涤后，加入100ngcmvmrna，5μl浓度为0.5umcmv探针，用传统杂交洗液补足至10μl，混匀。再加入10μl传统杂交液，涡旋混匀。置于恒温混匀仪上，设置温度65℃，转速1000rpm，时间30min。然后在同台恒温混匀仪上自然降温至室温。加入1ml传统杂交洗液洗涤一次，1000g室温离心5min，去除上清液。加入100μl传统杂交洗液，混匀微球，用流式细胞仪进行检测。上述传统杂交洗液配方如下：2×柠檬酸钠缓冲液(含0.3mnacl，0.03m柠檬酸钠)，10％甲酰胺，0.2mg/mlbsa。结果如表2所示，表2为用传统杂交体系进行cmv探针筛选的结果。表2以上结果显示，用本发明杂交体系进行探针筛选后的p/n的值在3.5-23.73之间，大多都大于5,；而对照方法的进行探针筛选后的p/n的值在1-2之间，因此，由此可见，本发明杂交体系较对照杂交体系灵敏度更高，更能区分各探针之间的优劣。根据表1中探针筛选的结果，以及探针筛选的标准，即选择p/n>5的探针，因此，去除cmv—2、9、11号探针，其余探针用te配制成浓度为100nm的混合探针母液，可用于rna流式荧光原位杂交实验。因此，本实施例的对cmv探针进行筛选的方法能精确的评价探针与靶基因结合能力的强弱，筛选出与靶基因结合能力强的探针，剔除劣势探针，并且通过p/n值能定量分析探针之间的优劣。实施例5：利用实施例3中的流式荧光原位杂交试剂盒进行cmv流式荧光原位杂交检测的一个优选实施例利用实施例3中的流式荧光原位杂交试剂盒和实施例4中已筛选出来的cmv探针，针对cmv建立rna流式荧光原位杂交体系。将待测细胞通过固定、通透之后，利用实施例3中的流式荧光原位杂交试剂盒和用实施例4中筛选出来的混合探针与待测的细胞中的rna结合，并用流式细胞仪进行检测，具体方法如下：取适量cmv质粒转染的293t细胞至ep管中，用pbs洗涤后，加实施例3中的流式荧光原位杂交试剂盒中的1ml4％多聚甲醛固定液混匀细胞，室温固定30imin后，1000g室温离心5min，弃上清液。用实施例3中的流式荧光原位杂交试剂盒中的1ml1％tritonx-100通透液混匀细胞，室温通透30min后，1000g，室温离心5min，弃上清液。用实施例3中的流式荧光原位杂交试剂盒中的1ml预杂交液混匀细胞，1000g，室温离心5min，弃上清液。用50μl预杂交液重悬细胞，加入2μlcmv探针，再加入50μl实施例3中的流式荧光原位杂交试剂盒中的杂交缓冲液，涡旋混匀。ep管连同ep管架放入恒温培养箱，65-70℃孵育30min。然后连同ep管架，室温放置1小时。加入37℃预热的实施例3中的流式荧光原位杂交试剂盒中的洗涤液，震荡混匀，置37℃温浴5min后，1000g室温离心5min，弃上清液。加入100μl洗涤液重悬细胞，流式细胞仪检测。结果如图1、图2、表3所示。图1为本发明的杂交体系检测293t细胞cmv基因表达的流式柱状图；其中，图1a、图1b、图1c为三次重复实验的结果图；与图2互为阴性对照。图2为本发明的杂交体系检测cmv质粒转染293t细胞的cmv基因表达的流式柱状图；其中，图2a、图2b、图2c为三次重复实验的结果图；表3为本发明杂交体系的检测结果。表3样本m2％parente1meanfitc-h293t(1)0.01％9105293t-cmv(1)40.57％43619293t(2)0.01％10330293t-cmv(2)40.19％53730293t(3)0.01％11644293t-cmv(3)39.08％64369在本实施例中，同时采用了传统杂交体系进行了对照检测实验：取适量cmv质粒转染的293t细胞至ep管中，用pbs洗涤后，加1ml4％多聚甲醛固定液混匀细胞，室温固定30imin后，1000g室温离心5min，弃上清液。用1ml1％tritonx-100通透液混匀细胞，室温通透30min后，1000g，室温离心5min，弃上清液。用1ml传统杂交洗液混匀细胞，1000g，室温离心5min，弃上清液。用50μl传统杂交洗液重悬细胞，加入2μlcmv探针，再加入50μl传统杂交液，涡旋混匀。ep管连同ep管架放入恒温培养箱，65-70℃孵育30min。然后连同ep管架，室温放置1小时。加入1ml传统杂交洗液，1000g室温离心5min，弃上清液。加入100μl传统杂交洗液重悬细胞，流式细胞仪检测。结果如图3、图4、表4所示。图3为传统杂交体系检测293t细胞cmv基因表达的流式柱状图；其中，图3a、图3b、图3c为三次重复实验的结果图；与图4互为阴性对照。图4为传统杂交体系检测cmv质粒转染293t细胞的cmv基因表达的流式柱状图；其中，图4a、图4b、图4c为三次重复实验的结果图。表4为传统杂交体系的检测结果。表4样本m2％parente1meanfitc-h293t(4)0.01％16143293t-cmv(4)28.61％79495293t(5)0.01％14540293t-cmv(5)28.28％78027293t(6)0.01％16174293t-cmv(6)29.07％81484由图1、图2、表3可见，利用本发明杂交系统进行检测的结果显示，细胞阳性比例接近40％；由图3、图4、表4可见，而利用传统杂交系统进行检测的结果显示，细胞阳性比例接近30％。因此，相对于传统杂交系统，本发明杂交系统的检测方法更加灵敏。而且，利用本发明杂交系统进行检测的实验重复3次，cmv质粒转染的293t细胞，每次检测阳性比例分别为40.57％、40.19％、39.08％，表达较为稳定。因此，该结果说明了本发明的杂交缓冲液和基于此建立的杂交体系可用于流式荧光原位杂交检测，且稳定性良好。利用本发明的杂交液和rna探针筛选方法建立的rna流式荧光原位杂交体系，灵敏性更高。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12