对微生物的数量进行计数的方法与流程

本发明涉及一种对分析物中的微生物的数量进行简单计数的方法，且具体来说，涉及一种可应用于透析用水等中的包含碳酸根离子或碳酸氢根离子的分析物的方法。

背景技术：

在饮用水、软饮料、工业用水、制药用水、透析用水等中，被微生物污染的程度要求很小，且已知所存在的微生物的数量通常为显著小的。特别地，标准被规定为对于饮用水来说活菌数为100cfu/ml或小于100cfu/ml且对于透析用水来说活菌数为10cfu/ml或小于10cfu/ml，并且在控制上述标准时定期监测以理解微生物的准确数量是重要的(非专利文献第1号)。

在检测食品等中的微生物时，通常应用其中对约1毫升的量的少量分析物悬浮液等进行倾注平板培养(pourplateculture)。然而，对于所存在的微生物量显著少的分析物(例如饮用水等)，根据上述方法，微生物的数量在若干情况下不能准确地计数。例如，当在100毫升分析物中存在10cfu或小于10cfu的细菌时，如果只对其提供1毫升分析物作为所述分析物，则在若干情况下无法检测微生物，且无法准确理解污染状态。

为了简单且准确地对液体分析物中的微生物的数量，特别是如上所述存在于大体积液体分析物中的少量微生物的数量进行计数，迄今为止本发明人已提出了一种通过使用胶凝剂(例如聚丙烯酸钠)的培养基进行的方法(专利申请jp2016-189545)。更具体来说，所述方法包括其中通过将作为构成培养基的溶剂的流体分析物直接添加到胶凝剂中，以通过在所述培养基中对分析物中的微生物进行培养来形成菌落，并使微生物可见，从而简化操作的方法(稍后阐述的参考例1)。

引文列表

非专利文献

非专利文献(nonpatentliterature，npl)1：日本药典(thejapanesepharmacopoeia)，第17版，一般信息中的g8水(g8wateringeneralinformation)

npl2：人工肾用粉状透析流体的制备，附件雷姆派克(lympack)ta3(尼普罗公司(niprocorporation))

技术实现要素：

技术问题

然而，当上述方法应用于应用透析流体作为分析物的情况时，培养基变得混浊，且出现了微生物的菌落的可见性降低的新问题。本发明人已经发现，通常包含在透析流体(非专利文献第2号)中的大量碳酸钠或碳酸氢钠与聚丙烯酸钠反应而产生二氧化碳气体，从而在培养基中产生不可计数的气泡。

在这种情况下，本发明的目的是提供一种其中通过抑制来自透析流体的二氧化碳气体的产生，在透析流体等中简单且精确地对存在于包含碳酸根离子或碳酸氢根离子的分析物中的少量微生物计数进行计数的方法。

问题的解决方案

本发明人已努力地继续进行研究，以解决上述问题。结果，本发明人发现，如果添加碱土金属的氢氧化物(例如氢氧化钙)作为包含聚丙烯酸钠的培养基的组分，则可抑制二氧化碳气体的产生，且可确保在对微生物的数量进行计数时的可见性，并且完成了本发明。

更具体来说，本发明包括以下阐述的各项。

项1.一种对微生物的数量进行计数的组合物的用途，其中所述组合物包含(a)聚丙烯酸和/或其盐、(b)碱土金属的氢氧化物及(c)营养成分。

项2.根据项1所述的用途，其中所述组合物还包含(d)着色试剂。

项3.根据项1或2所述的用途，其中(b)所述碱土金属的氢氧化物选自氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化钡、氢氧化锶、氢氧化镭及氢氧化铍的群组。

项4.一种对微生物的数量进行计数的培养设备的用途，其中所述培养设备包括(a)聚丙烯酸和/或其盐、(b)碱土金属的氢氧化物、(c)营养成分及培养容器。

项5.一种用于制备对微生物的数量进行计数的培养基的组合物，包含(a)聚丙烯酸和/或其盐、(b)碱土金属的氢氧化物及(c)营养成分。

项6.根据项5所述的组合物，还包含(d)着色试剂。

项7.根据项5或6所述的组合物，其中(b)所述碱土金属的氢氧化物选自氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化钡、氢氧化锶、氢氧化镭及氢氧化铍的群组。

项8.一种对微生物的数量进行计数的培养设备，包括根据项5到7中任一项所述的组合物以及培养容器。

项9.一种微生物的数量的计数方法，包括：向根据项5到7中任一项所述的组合物中添加分析物并混合所得混合物的工序；培养包含在分析物中的微生物的工序；以及对微生物的菌落的数量进行计数的工序。

项10.根据项9所述的计数方法，其中所述分析物包含0.005mol/100ml或大于0.005mol/100ml的碳酸根离子或碳酸氢根离子。

项11.根据项9或10所述的计数方法，其中所述分析物中的微生物的所述数量为0.1cfu/ml或小于0.1cfu/ml。

项12.根据项9到11中任一项所述的计数方法，其中所述分析物的重量是所述组合物中的(a)所述聚丙烯酸和/或其盐的重量的10倍到10,000倍。

本发明的有利效果

根据本发明，即使对于包含碳酸根离子或碳酸氢根离子的分析物，也可抑制二氧化碳气体的产生，且可简单且准确地对分析物中的微生物的数量进行计数。特别是，即使对于大量分析物中存在的少量微生物计数，也可实现定量检测。

附图说明

图1是参考例1中的100毫升凝胶形式的培养基中的红色菌落的照片。

图2是比较例1中的100毫升凝胶形式的培养基的照片。

图3是实例1中的100毫升凝胶形式的培养基的照片。

具体实施方式

本发明的组合物实质上包含(a)聚丙烯酸和/或其盐、(b)碱土金属的氢氧化物及(c)营养成分。

本发明的组合物是用于制备对微生物的数量进行计数的培养基的材料。所述制备通常通过添加包含要计数的微生物的液体分析物并将所述分析物混合到所述组合物中作为直接构成培养基的凝胶的溶剂来执行。在这种用途方面，本发明的组合物及使用所述组合物制备的培养基不同于微生物的现有培养基。

然后，(a)聚丙烯酸和/或其盐起胶凝剂的作用，所述胶凝剂构成对目标微生物进行培养及计数的培养基。聚丙烯酸和/或其盐通过与液体分析物混合来形成均匀的凝胶。这种凝胶的形成通常需要通过加热来溶解或需要冷却，且因此操作简单，并且目标微生物的生长不受阻碍。

所形成的凝胶通常没有流动性，且因此可准确地对所存在的微生物的数量进行计数。此外，凝胶通常不会引起脱水收缩，且因此可准确地对所存在的微生物的菌落的数量进行计数。

此外，由聚丙烯酸和/或其盐形成的凝胶通常是透明的。因此，微生物的菌落可通过视觉观察被准确地检测到。

例如琼脂、卡拉胶及刺槐豆胶等胶凝剂通常用于微生物的培养基等，但上述胶凝剂在凝固液体溶剂时需要加热，且因此不适合直接凝固包含微生物的液体分析物。此外，由于透明度低，通过使用上述胶凝剂来凝固而制备的凝胶也不适合于此。

此外，聚乙烯醇难以与液体溶剂均质混合，且还存在容易引起脱水收缩的问题。此外，黄原胶也很难与液体溶剂均质混合而容易形成块状物，其中凝固的凝胶也容易变得不透明。

羧甲基纤维素不能凝固液体分析物从而形成可流动的凝胶，且因此不适于微生物的定量检测。

当使用聚丙烯酸钠作为聚丙烯酸和/或其盐时，从凝固能力的观点来说，聚合程度为10,000或大于10,000的材料是优选的，且聚合程度为22,000或大于22,000的材料是更优选的。此外，所述材料可交联或不需要交联。

根据本发明，使用时聚丙烯酸钠的浓度不受特别限制，但优选为0.01g/100ml到10g/100ml，且更优选为0.5g/100ml到5g/100ml。

此外，当使用(a)任何其他聚丙烯酸和/或其盐时，使用时的浓度只需要处于形成凝固的凝胶的范围内，只要本发明的有利效果不受到不利影响即可。

然后，(b)碱土金属的氢氧化物是通过聚丙烯酸等与分析物中的碳酸根离子或碳酸氢根离子的反应来抑制二氧化碳气体的产生的材料。

碱土金属的氢氧化物不受特别限制，且其具体实例优选地包括氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化钡、氢氧化锶、氢氧化镭及氢氧化铍，且考虑到处理及对微生物的生长的影响，氢氧化钙是特别优选的。

此外，即使当向其中添加上述材料时，由聚丙烯酸等形成的凝胶的透明度及凝胶化也不受阻碍。

根据本发明，使用时(b)碱土金属的氢氧化物的浓度不受特别限制，但优选为等于或小于包含在分析物中的碳酸根离子及碳酸氢根离子的摩尔数的浓度。例如，当应用一般透析流体作为分析物，且使用氢氧化钙作为(b)碱土金属的氢氧化物时，使用时其浓度优选为0.01g/100ml到10g/100ml且更优选为0.1g/100ml到0.5g/100ml。

然后，(c)营养成分用于使目标微生物生长。

营养成分不受特别限制，且其具体实例优选地包括蛋白胨、动物肉提取物、酵母提取物及鱼肉提取物。

如非专利文献第1号中所述，在测试饮用水时，推荐使用标准琼脂培养基，且在测试制药用水或透析用水时，推荐使用r2a琼脂培养基。因此，从上述琼脂培养基中排除琼脂的肉汤培养基或与其等效的成分优选地用作根据本发明的组合物的组分。

然后，本发明的组合物更优选地包含(d)着色试剂。原因是微生物的菌落，即通过培养产生的菌落容易被检测到并被计数为经着色菌落。

着色试剂的具体实例包括氧化还原指示剂，其包括2,3,5-三苯基四唑鎓氯化物(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride，ttc)及四唑鎓紫。当期望对分析物中存在的所有种类的微生物进行计数时，可优选地使用上述指示剂。当使用ttc时，使用时的浓度优选为1mg/l到100mg/l，且更优选为10mg/l到50mg/l。

此外，作为着色试剂，这种材料可用作只由特定微生物物种拥有的酶的底物(下文中，称为“酶底物”)以及可通过分解释放颜料化合物的化合物。当期望对特定微生物进行计数时，可优选地使用上述材料。

此处，颜料化合物可为在可见光下着色的化合物及荧光着色的化合物中的任何一种。在可见光下可被释放作为经着色化合物的官能基的具体实例包括5-溴-4-氯-3-吲哚酚基，且所释放的5-溴-4-氯-3-吲哚被氧化并融合成5,5'-二溴-4,4'-二氯-靛蓝及经着色蓝色。可释放作为荧光着色的化合物的官能基的具体实例包括4-甲基伞形酮基(4-methylumbelliferrylgroup)，且所释放的4-甲基伞形酮在紫外光照射下发射荧光。

以酶底物为例，分别来说，当目标微生物是大肠菌群时，可优选地使用5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-d-吡喃半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indoxlyl-beta-d-galactopyranoside，x-gal)或5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-d-葡糖醛酸(5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-d-glucuronicacid)，在金黄色葡萄球菌的情况下，可优选地使用5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indoxylphosphate，x-phos)，在肠球菌的情况下，可优选地使用5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-d-吡喃葡萄糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indoxlyl-beta-d-glucopyranoside，x-gluc)，且在真菌的情况下，可优选地使用x-phos、5-溴-4-氯-3-吲哚酚乙酸酯或5-溴-4-氯-3-吲哚酚丁酸酯。此外，当期望检测到所有微生物物种时，可组合及使用上述所有物质。

使用时酶底物的浓度优选为0.01g/l到1.0g/l，且更优选为0.2g/l到1.0g/l。

本发明的组合物还可包含选择性物质、抗菌物质、无机盐、糖类、增稠剂、ph调节剂等，只要所述成分不会不利地影响本发明的有利效果即可。

选择性物质的具体实例包括抗生素，例如多粘菌素b及万古霉素；以及表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠(sodiumlaurylsulfate，sds)、吐温(tween)80；及胆盐(例如胆酸钠)。

抗菌物质的具体实例包括聚赖氨酸、硫酸鱼精蛋白、甘氨酸及山梨酸。

无机盐的具体实例包括无机酸金属盐，例如氯化钠及硫代硫酸钠；以及有机酸金属盐，例如丙酮酸钠、柠檬酸铁铵及柠檬酸钠。

糖类的具体实例包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、纤维二糖及麦芽糖。

粘度改进剂的具体实例包括淀粉及其衍生物、透明质酸、丙烯酸衍生物、聚醚及胶原。

ph调节剂的具体实例包括碳酸钠、碳酸氢钠及柠檬酸。此外，从目标微生物生长的观点来说，根据本发明的组合物是这种组合物，当使用时，其ph优选为6.0到8.0且更优选为6.5到7.5。

本发明的组合物结合培养容器可被提供作为对微生物的数量进行计数的培养设备。

这种培养容器是以下容器：用于直接将液体分析物容纳在其中且通常不对其施加处理(例如浓缩及稀释)，并将液体分析物与根据本发明的组合物在其中混合，以使包含在组合物中的聚合物化合物凝胶化从而形成培养基，并培养微生物。

培养容器的形式不受特别限制，且可为容器，只要能够足够容纳所需量的流体分析物即可。例如，为了通过摇动本发明的组合物及液体分析物来混合本发明的组合物及液体分析物，优选为具有圆柱形形状等且由难以引起变形的材料制成的容器。此外，例如，为了通过与容器摩擦及按压在一起来混合本发明的组合物及液体分析物，优选的是由容易变形及柔性的材料制成的容器。容器的具体实例优选地包括由聚合物(例如聚乙烯基系及聚乙烯系)制成的袋状容器，且更优选为具有密封装置(例如顶盖及紧固件)的容器。此外，考虑到易于从容器外部对微生物的菌落进行计数，培养容器优选是透明的。能够容纳在其中的剂量不受特别限制，但其具体实例优选地包括100毫升到1,000毫升，这适于将容器应用于包含少量微生物的大体积分析物。

尽管分析物截至目前已与包含预先形成的培养基的培养设备接触，以对微生物进行培养及计数，但根据本发明的对微生物的数量进行计数的培养设备与现有的培养设备的不同之处在于，所述设备在使用方面是优选的，其中通过在培养容器中使用液体分析物本身作为溶剂来使聚合物化合物胶凝，且分析物中的微生物在凝胶内部培养，并且提供所得材料来对微生物进行计数。

此外，培养容器可被形成为板(片)形式，且这种培养容器适合于通过使用少量的分析物(例如约1毫升分析物)来检测微生物。

其具体实例包括通过堆叠一般陪替氏培养皿(petridish)或凹的碟状片及板状片或凸片制备的容纳容器的形式。通过将容器形成为板状形式，可更容易地对微生物的菌落进行计数。此外，小尺寸容器的使用有利于同时并行处理多种分析物。

在这种小尺寸及板状培养容器的情况下，培养容器也可用于稀释的分析物，且因此，例如当分析物中的微生物数量为300cfu/ml或小于300cfu/ml时，这种容器也变为优选的。

根据本发明的上述用于制备对微生物的数量进行计数的培养基的组合物可优选地用于本发明的计数方法中。

本发明的计数方法包括向本发明的组合物中添加分析物并混合所得混合物的工序、培养包含在分析物中的微生物的工序及对微生物的菌落的数量进行计数的工序。

本发明的组合物与液体分析物的混合可通过任意方法执行，且例如，混合可通过与容器一起摇动或摩擦或者通过用无菌装置搅拌来执行。

微生物的培养条件不受特别限制，且根据目标微生物的种类来适当选择，但优选地例如在35±2℃下进行24小时到48小时。

通过目标微生物生长而形成的菌落在培养后出现在培养基中，且可通过视觉观察等来确认菌落，并且很难产生二氧化碳气体的气泡，因此可准确地对菌落的数量进行计数。

本发明的计数方法可优选地用于其中所存在的微生物的量少、更具体来说清洁度高的分析物。例如，当分析物中的微生物的数量为0.1cfu/ml或少于0.1cfu/ml且在微生物不能通过使用1毫升的普通检查来检测的水平下时，所述计数方法是优选的。

一般来说，如果分析物中存在大量的微生物，则可通过适当稀释分析物以适合于检测方法而对菌落进行计数，但当所存在的微生物的量少时，浓缩在若干情况下是复杂的或困难的。即使在这种情况下，本发明的计数方法也是有用的，因为微生物的数量可被简单及准确地检测。

此外，考虑到无需对分析物施加预处理就能直接提供用于计数的分析物，本发明的计数方法甚至对于大量液体分析物也是有用的。例如，当分析物重量相对于根据本发明的组合物中的(a)聚丙烯酸钠的水合能力高，例如是分析物的重量的10倍到10,000倍时，所述计数方法是优选的。或者，当分析物为大量、例如为100毫升或大于100毫升时，所述计数方法是优选的。

可应用根据本发明的计数方法的分析物不受特别限制，且其具体实例通常包括包含0.005mol/100ml或大于0.005mol/100ml的量的碳酸根离子或碳酸氢根离子的液体分析物。这种液体分析物的具体实例优选地包括透析用水。此外，分析物可为通过在胰蛋白酶大豆肉汤等中对这种分析物进行预培养而制备的培养液。

实例

接下来，将通过实例更详细地阐述本发明。本发明不受所述实例的限制。

参考例1

(1)制备用于制备对微生物进行计数的培养基的组合物

通过将具有表1所示配方的材料在具有圆柱形形状及150ml体积的透明且无色塑料容器中混合来制备组合物。

[表1]

表1

*作为聚丙烯酸钠，使用了艾可里克(aqualic)ca(日本触媒有限公司(nipponshokubaico.,ltd.))。

(2)制备接种的菌株

作为样本菌株，使用枯草杆菌nbrc3134。将样本菌株在胰蛋白酶大豆琼脂培养基中预培养24小时，然后使用无菌拭子悬浮在无菌生理盐水中，以达到与麦克法兰浊度标准第1号(mcfarlandturbiditystandardno.1)对应的浓度(约3.0×10⁸cfu/ml)，并用作细菌原液。然后，通过重复用无菌生理盐水将细菌原液稀释10倍到10^-8cfu/ml的工序，制备了具有若干cfu/ml浓度的细菌稀释溶液。然后，将1ml细菌稀释溶液添加到99ml无菌水中，且将所得材料用作其中只存在显著少量的微生物，即只有若干cfu/100ml微生物的样品溶液。然后，将100ml样品溶液添加到上述(1)中制备的组合物中，且将所得材料垂直摇动并混合几分钟，以在室温下凝固所述材料。使凝固的培养基静置后，将所得材料在35℃下培养24小时，然后确认存在还是不存在生长。

(3)结果

图1示出枯草芽孢杆菌的菌落。

通过使用参考例1中的组合物来快速凝固样本菌株的样品溶液，且培养后，如图1所示，红色菌落能够在透明凝胶中确认出，且其数量能够容易地计数。

实例1及比较例1

(1)制备用于制备对微生物进行计数的培养基的组合物

将具有表2所示配方的材料在体积为100ml的透明且无色塑料喷口袋中混合，以制备比较例1中的组合物。

此外，还向具有表2所示配方的材料中添加了0.3g/100ml氢氧化钙，然后将所得材料在体积为100ml的透明且无色塑料喷口袋中混合，以制备实例1中的组合物。此外，使用时实例1中的组合物中的氢氧化钙的浓度对应于将在下述的部分(2)中添加的100ml透析流体雷姆派克(lympack)ta3(由尼普罗公司制成)中的碳酸氢钠含量的25mol％。

[表2]

表2

*作为聚丙烯酸钠，使用了艾可里克ca(日本触媒有限公司)。

(2)制备透析流体

将根据附件使用雷姆派克ta3(由尼普罗公司制成)制备的透析流体以100ml的量添加到容纳有实例1或比较例1中的组合物的每个容器中，且通过将容器摩擦几分钟使所得材料充分混合，以在室温下凝固所得材料。然后，使容器在35℃下静置24小时，然后观察培养基的一个方面。

(3)结果

如图2所示，在使用比较例1中的组合物制备的培养基中，产生了可推测为二氧化碳气体的不可计数的气泡，且所述培养基呈现白色混浊。

相比之下，如图3所示，在使用实例1中的组合物制备的培养基中，抑制了可推测为二氧化碳气体的气泡的产生，且在对微生物进行计数时的可见性得到改善。此外，即使当使用实例1中的组合物时，凝胶化速度仍不同于比较例1中的速度。

工业适用性

根据本发明，即使在包含碳酸根离子或碳酸氢根离子的分析物中，仍可简单且准确地对所述分析物中的微生物的数量进行计数。特别是，即使对于存在于大体积分析物中的少量微生物计数仍可实现定量检测，且因此对于清洁度高的分析物，其中存在的痕量微生物计数的数量可以高可见性进行彻底计数。