本发明涉及抑藻剂领域，具体地说是一种海藻内生真菌来源的双环环橙花烷型倍半萜衍生物及其制备方法和在抑藻方面的应用。
背景技术：
世界范围内，近海赤潮灾害日益加剧，严重阻碍海洋渔业、近岸旅游和海洋经济的发展。2000年以后我国进入赤潮高发期，赤潮发生频率和危害程度明显增加。赤潮的主要危害形式有四种，一是破坏海洋生态平衡；二是破坏海洋渔业资源；三是危害人类健康；四是影响海洋旅游业的发展。据统计，每年由赤潮造成的经济损失高达10亿元以上。海洋中可引发赤潮的微藻约有300种，其中有毒赤潮藻约80种。科学有效地预防和治理赤潮是当今世界性难题之一。
目前，赤潮的防治对策除了防止海水富营养化外，还要遏制赤潮生物即赤潮藻的发展，而遏制赤潮藻发展的方法主要为化学药剂治理。虽然化学药剂如硫酸铜、氯气等快速、有效地杀死或抑制有害藻类或抑制其生长繁殖，但存在对非赤潮生物的危害、药物残留以及对环境的二次污染等问题。
与治理赤潮中使用的传统的化学药剂相比，海洋生物源天然药物具有针对性强、安全性高、活性显著且对环境友好的优点，为解决目前由赤潮藻引发的赤潮的防治问题提供了新的思路
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种双环环橙花烷型倍半萜衍生物及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种双环环橙花烷型倍半萜衍生物，双环环橙花烷型倍半萜衍生物的结构如式(i)所示
一种双环环橙花烷型倍半萜衍生物的制备方法，将棘孢木霉(trichodermaasperellum)a-ymd-9-2接种于真菌培养基中发酵培养，发酵产物经纯化后，即为式(i)所示的双环环橙花烷型倍半萜衍生物；所述的棘孢木霉(trichodermaasperellum)a-ymd-9-2于2018年6月27日保存于中国典型培养物保藏中心cctcc，保藏编号为cctccm2018405。
具体为：
1)将棘孢木霉(trichodermaasperellum)a-ymd-9-2接种于真菌培养基中发酵10-60天，而后经有机溶剂提取并浓缩，即为粗提物；
2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析，经洗脱组分进行梯度洗脱，收集洗脱组分，洗脱组分经薄层层析检测；
3)收集步骤2)中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析和制备薄层层析分离纯化，即得如式(i)所示的双环环橙花烷型倍半萜衍生物。
步骤1)中真菌培养基为大米固体培养基、菊芋葡萄糖液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基。
有机溶剂为乙酸乙酯、石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇中一种或几种。
步骤2)中的有机溶剂为体积比50-0:1的石油醚-乙酸乙酯、石油醚-乙醇、石油醚-丙醇、石油醚-异丙醇、二氯甲烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、二氯甲烷-乙醇、二氯甲烷-丙醇、二氯甲烷-异丙醇中的一组或几组。
步骤3)所述反相硅胶柱层析洗脱液为体积比5-0:1的水-甲醇或水-乙醇；制备薄层层析展开剂为体积比为30-0:1的二氯甲烷-甲醇或石油醚-乙醇。
一种双环环橙花烷型倍半萜衍生物的应用，所述的双环环橙花烷型倍半萜衍生物用于制备微藻的抑藻剂。
所述微藻为引起赤潮危害的赤潮异弯藻。
本发明具有以下优点：本发明通过分离于海洋红藻江蓠的棘孢木霉(trichodermaasperellum)a-ymd-9-2发酵经提取、分离获得的双环环橙花烷型倍半萜衍生物，经抑制微藻活性实验得出化合物对能引起赤潮的赤潮异弯藻的半数抑制浓度为0.63微克/毫升。
具体实施方式：
下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。
实施例1
海藻内生真菌来源的双环环橙花烷型倍半萜衍生物的结构如式(i)所示。
该化合物具有以下理化和波谱特性：
无色油状；比旋光度[α]20d-30(c0.32,meoh)；核磁共振氢谱(溶剂为氘代氯仿)δh1.02d(6.6),1.71m,1.61m,1.50m,1.80m,1.50m,1.75m,1.70m,1.45ddd(12.1,3.3,3.3),1.67m,3.87ddd(11.5,9.9,4.1),1.16s,1.24s,1.19s,1.19s,5.62brs,2.35brt(5.7),3.79brt(5.7),2.16brs,5.24brd(9.8)；核磁共振碳谱(溶剂为氘代氯仿)δc15.1(ch3),44.0(ch),81.6(c),40.6(ch2),25.1(ch2),56.6(ch),75.8(c),31.7(ch2),23.6(ch2),53.3(ch),73.9(c),30.3(ch3),26.2(ch3),25.5(ch3),22.9(ch3),166.3(c),120.7(ch),150.4(c),43.7(ch2),60.2(ch2),18.3(ch3)；高分辨质谱[m]+m/z367.2725，计算值367.2723。
实施例2
如式(i)所示的双环环橙花烷型倍半萜衍生物的制备方法：
取平板上生长良好的棘孢木霉(trichodermaasperellum)a-ymd-9-2菌种，切成小块并接种于大米固体培养基中，每1升三角瓶中放50克大米固体培养基，共200瓶，室温静止发酵40天，而后用乙酸乙酯提取三次，减压浓缩，浓缩后得粗提物212.4克。
所述大米固体培养基组成为每升含500克大米，蛋白胨6克，蒸馏水500毫升，陈海水500毫升。
棘孢木霉(trichodermaasperellum)a-ymd-9-2菌种于2018年6月27日保存于中国典型培养物保藏中心cctcc，地址：中国武汉大学，保藏编号为cctccm2018405,分类命名为trichodermaasperellum，株号为a-ymd-9-2。
将粗提物经100-200目的硅胶柱层析，依次用体积比50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1到0:1的石油醚-乙酸乙酯和10:1、5:1、2:1、1:1到0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，收集的各组分再用薄层层析(tlc)检测(体积比50-1:1的二氯甲烷-甲醇展开，茴香醛-硫酸显色或254nm紫外光检测)，根据rf值来判断、合并相同或类似部分，获得8个组分(1-8)。
将rf值为0.6-0.7(体积比10:1的二氯甲烷-甲醇展开，254nm紫外光检测)的组分5，即以体积比0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱下的组分再依次经反相c18硅胶柱和制备薄层层析分离。反相c18硅胶柱层析洗脱液为体积比2:3的水-甲醇，tlc检测(体积比10:1的二氯甲烷-甲醇展开，254nm紫外光检测，茴香醛-硫酸显色)，收集254nm紫外光下有荧光，茴香醛-硫酸显红色的组分；收集组分再经制备薄层层析，用体积比10:1的二氯甲烷-甲醇为展开剂，收集254nm紫外光下有荧光且rf值为0.6－0.7的组分即为式(i)所示化合物(7.4毫克)。经薄层层析检测(体积比10:1二氯甲烷-甲醇展开，254nm紫外光检测，茴香醛-硫酸显色)，呈单个、均匀荧光、显红色斑点，确定为纯化合物。经波谱分析，其结构鉴定为一种双环环橙花烷型倍半萜衍生物，结构式如(i)所示。
实施例3
与实施例2不同之处在于
取平板上生长良好的棘孢木霉(trichodermaasperellum)a-ymd-9-2菌种，切成小块并接种于菊芋葡萄糖液体培养基中，每1升三角瓶中放300毫升培养基，共200瓶，室温静止发酵40天，而后用二氯甲烷提取三次，减压浓缩，浓缩后得粗提物200克。
所述菊芋葡萄糖液体培养基组成为每升含200克菊芋块茎的煮汁500毫升，葡萄糖20克，蛋白胨5克，陈海水500毫升。
将粗提物经200-300目的硅胶柱层析，依次用体积比50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1到0:1的石油醚-乙醇进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析检测(体积比50-0：1的石油醚-乙醇展开，茴香醛-硫酸显色或254nm紫外光检测)，根据rf值来判断、合并相同或类似部分，获得8个组分(1-8)。
将rf值为0.6-0.7(体积比5:1的石油醚-乙醇展开，254nm紫外光检测,茴香醛-硫酸显色)的组分5，即以体积比10:1的石油醚-乙醇梯度洗脱下的组分再依次经反相c18硅胶柱和制备薄层层析分离。反相c18硅胶柱层析洗脱液为体积比1:1的水-乙醇，tlc检测(体积比5:1的石油醚-乙醇展开，254nm紫外光检测,茴香醛-硫酸显色)，收集254nm紫外光下有荧光且茴香醛-硫酸显红色的组分；收集组分经制备薄层层析，体积比5:1的石油醚-乙醇为展开剂，收集rf值为0.6-0.7的组分，得式(i)所示双环环橙花烷型倍半萜衍生物。
实施例4
抑微藻活性实验：
具体为:活化供试微藻，取对数生长期的微藻，用已灭菌的f/2培养基，稀释至一定的藻细胞浓度(约5×104个/毫升)，取96孔板，每孔加195微升藻液为测试培养板。样品组和对照组各设三个平行，样品组加5微升浓度为4毫克/毫升的化合物溶液，溶剂为二甲基亚砜(dmso)，空白对照组加5微升溶剂，阳性对照组加5微升浓度为4毫克/毫升的k2cr2o7溶液。培养温度20℃，光照强度2000lux，光暗比14:10(小时)条件下，培养24小时。其中供试微藻为赤潮异弯藻。
利用血球计数板，在显微镜下对各实验组中微藻进行计数。对抑制率大于50％的实验组，进一步计算其半数抑制浓度ic50值。将配置好的终浓度为4毫克/毫升的化合物溶液依次进行稀释，最终得到15组浓度依次降低的组分(1000、500、200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125微克/毫升)。观察并计算各浓度梯度下化合物的微藻抑制率，取抑制率在0-100之间至少5个浓度梯度，计算ic50值。
实验结果：上述获得的双环环橙花烷型倍半萜衍生物对赤潮异弯藻的半数抑制浓度为0.63微克/毫升，具有抑制赤潮异弯藻的作用。