一种猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合毒株及其应用的制作方法

本发明涉及一种新的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合毒株，还涉及该嵌合毒株株的构建方法及在制备预防猪繁殖与呼吸综合征流行毒株的候选疫苗中的应用。

背景技术：

猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，prrs)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，prrsv)引起的一种严重危害养猪业的病毒性疫病，其临床症状复杂多样，特征为母猪繁殖障碍或各日龄猪群的呼吸道疾病。1996年该病毒在我国首次被分离到，后逐渐遍及全国。2006年夏秋季节更是暴发高致病性prrsv(hp-prrsv)，其主要临床特征为高热、高发病率和死亡率，对养猪业造成了巨大的经济损失。hp-prrsv毒株相比经典prrsv会引发仔猪更严重的临床症状，造成更高的发病率和死亡率。prrsv基因组容易发生变异及重组，给该病防控带来更大的困难。

近年来，国内陆续分离到与美国prrsvnadc30毒株同源性较高的病毒株，称为类nadc30毒株。分子流行病学调查研究显示，类nadc30毒株在我国已呈现流行态势。美国nadc30毒株对仔猪致病性较弱，但与hp-prrsv发生基因重组后的类nadc30毒株致病性明显增强。prrsv为单股正链rna病毒，属于动脉炎病毒科，动脉炎病毒属。该病毒基因组全长约15kb，包含至少11个开放阅读框(orfs)，其中orf1a和orf1b编码非结构蛋白，基因组3’端8个orfs主要编码病毒的结构蛋白。其中gp2，gp3，gp4和m蛋白形成的寡聚物对诱导中和抗体有一定作用。这些蛋白存在t细胞表位，可以诱导t细胞免疫。gp5由orf5编码，为病毒囊膜糖蛋白，又是prrsv主要的宿主保护性抗原，包含诱导中和抗体密切相关的中和表位，gp5氨基酸序列的变异将直接降低prrs疫苗株的交叉保护率。m蛋白是由orf6编码的非糖基化膜蛋白，能够介导病毒的吸附和诱导细胞免疫。gp5和m蛋白能够以异源二聚体的形式存在，且这种异源二聚体可以促进gp5蛋白从内质网向高尔基体转运，从而进一步增强gp5蛋白所诱导的免疫反应。n蛋白则是一种高度保守的核衣壳蛋白，具有极强的免疫原性，但其诱导的抗体不具备中和病毒的能力。由于病毒基因组rna突变、重组等导致毒株呈现变异多样性及遗传多样化趋势，为prrs防控带来了严峻挑战。当前，prrsv商品化弱毒疫苗对同源毒株基因较好免疫保护作用，但对异型毒株的交叉保护作用较低。目前，prrs的商品化疫苗主要有弱毒活疫苗及灭活疫苗，弱毒疫苗比灭活疫苗免疫效力较好，但对不同亚型毒株交叉保护性较差。例如tjm-f92，hun4-f112，jxa1-r和r98等弱毒疫苗可有效缓解hp-prrsv造成的临床症状，降低仔猪死亡率，但对类nadc30毒株免疫保护作用有限，因此研究新型广谱疫苗十分必要。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合毒株。该新型嵌合毒株毒力低，具有良好的免疫原性，可对高致病性prrsv毒株以及prrsv类nadc30毒株感染提供有效的交叉免疫保护，为该病新型疫苗研制奠定了重要基础。

本发明分离获得了prrsv类nadc30毒株fj1402(简称类nadc30毒株fj1402)与高致病性prrsv毒株bb0907(简称hp-prrsvbb0907)，类nadc30毒株fj1402与hp-prrsvbb0907致病性相近。

本发明提供的prrsv嵌合毒株是将高致病性prrsv疫苗毒株的nsp2基因上的表达第323-433位氨基酸(aa)的基因片段删除、同时将其orf5-6(开放式阅读框5和6)替换为prrsv类nadc30毒株的orf5-6构建而获得的。

本发明选择的prrsv疫苗毒株为高致病性prrsvtjm-f92疫苗弱毒株，选择的prrsv类nadc30毒株为类nadc30毒株fj1402。

本发明在构建prrsv嵌合毒株时，在高致病性prrsvtjm-f92疫苗弱毒株的全长感染性cdna克隆和类nadc30毒株fj1402的基础上，利用反向遗传技术，将tjm-f92的nsp2基因缺失表达第323-433位aa(共缺失111个aa)的基因片段，并将nsp2基因缺失表达第323-433位aa后的高致病性prrsvtjm-f92毒株的结构蛋白基因orf2-7(orf2、orf3、orf4、orf5、orf6和orf7)和orf5-6(orf5和orf6)区域分别替换成类nadc30亚型毒株fj1402相应的编码区域(orf2-7和orf5-6)，构建了三个感染性克隆，将含这三个感染性克隆的重组质粒分别转染mare-145细胞，拯救获得了三个重组嵌合毒株，命名为rtd111(tjm-f92毒株nsp2缺失111个aa)，rtd111/f2-7(rtd111毒株orf2-7置换为fj1402毒株orf2-7)和rtd111/f5-6(rtd111毒株orf5-6置换为fj1402毒株orf5-6)。

本发明prrsv嵌合毒株的构建思路具体为：

(1)构建高致病性prrsvtjm-f92疫苗弱毒株的感染性cdna克隆，命名为pcmv-tjm；

(2)将pcmv-tjm的nsp2基因上表达第323-433位aa(共111个aa)的片段删除，构建得到感染性cdna克隆，命名为ptd111；

(3)以ptd111为骨架，将其orf2-7和orf5-6分别替换为猪繁殖与呼吸综合征类nadc30毒株fj1402的orf2-7和orf5-6，构建得到感染性cdna克隆，命名为ptd111/f2-7、ptd111/f5-6；

(4)将ptd111、ptd111/f2-7、ptd111/f5-6分别进行病毒拯救，得到三种嵌合毒株，命名为rtd111、rtd111/f2-7和rtd111/f5-6。

将rtd111、rtd111/f2-7和rtd111/f5-6分别传代5次，基因遗传性均稳定。进一步对rtd111、rtd111/f2-7和rtd111/f5-6嵌合毒株进行试验验证，结果显示：rtd111/f2-7和rtd111/f5-6嵌合毒株在marc-145细胞上的生长速度及病毒滴度略低于其原始tjm-f92毒株，但在pam细胞上的生长速度及病毒滴度与原始tjm-f92毒株相似。感染pams细胞后，rtd111/f5-6诱导的炎性细胞因子水平与td111相似，略高于tjm-f92，但rtd111/f2-7诱导的炎性细胞因子水平明显高于td111、rtd111/f5-6和tjm-f92。将rtd111、rtd111/f2-7、rtd111/f5-6、tjm-f92和fj1402分别接种30～35日龄仔猪，经对猪体临床症状、抗体检测、剖检病变以及病理学观察，结果表明，rtd111/f5-6毒力与tjm-f92相似，明显低于fj1402，而rtd111/f2-7毒力高于rtd111/f5-6，说明rtd111/f5-6具有作为疫苗候选株的潜力。选取30-35日龄健康仔猪，进一步研究嵌合疫苗候选株rtd111/f5-6的仔猪免疫保护效力，免疫后28d分别利用hp-prrsv毒株bb0907和类nadc30毒株fj1402经肌肉注射攻毒，动物试验结果显示，rtd111/f5-6免疫组中bb0907及fj1402毒株感染水平明显降低，临床症状和病理变化明显减轻。表明该嵌合毒株具有良好的免疫原性，可对高致病性毒株以及类nadc30毒株感染提供有效的交叉免疫保护，为该病新型疫苗研制奠定了重要基础。

基于以上实验结果，本发明选择rtd111/f5-6作为本发明需要保护的prrsv嵌合毒株。本发明进一步将该rtd111/f5-6嵌合毒株的第五代进行了培养并进行了保藏，保藏编号为cgmccno.14762，保藏名称为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)rtd111/f5-6f5，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年5月25日。

进一步的，该猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)rtd111/f5-6f5cgmccno.14762毒株中，其orf5和6的核苷酸与类nadc30毒株fj1402的orf5-6相同，其他开放式阅读框与高致病性prrsvtjm-f92疫苗弱毒株相同，但nsp2基因上缺失表达111个aa(第323-433位)的片段。

进一步的，该猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)rtd111/f5-6f5cgmccno.14762毒株的核苷酸序列如seqidno.1所示，其orf5的核苷酸序列如seqidno.2所示，其orf6的核苷酸序列如seqidno.3所示。

进一步的，本发明构建的嵌合毒株对hp-prrsv毒株bb0907及类nadc30毒株fj1402均有较好免疫保护作用，因此其作为猪繁殖与呼吸综合征流行毒株的候选疫苗的应用也在本发明保护范围之内，优选的，该prrsv嵌合毒株为rtd111/f5-6f5cgmccno.14762或rtd111/f5-6。

进一步的，本发明还提供了猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合毒株在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应用，优选的，该猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合毒株为rtd111/f5-6f5cgmccno.14762或rtd111/f5-6。

进一步的，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗有效成分包括免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合毒株，该嵌合毒株为rtd111/f5-6f5cgmccno.14762或rtd111/f5-6。优选的，疫苗中嵌合毒株的免疫量为：10^5.0tcid50/ml病毒液。

进一步的，本发明还提供了上述疫苗在制备预防猪繁殖与呼吸综合征的药物中的应用。进一步的，所述猪繁殖与呼吸综合征是由经典猪繁殖与呼吸综合征毒株感染引起，或是由高致病性prrsv毒株感染引起，或是由prrsv类nadc30毒株感染引起，或是由上述三种毒株交叉感染引起。

本发明以高致病性prrsvtjm-f92疫苗弱毒株(即高致病性猪繁殖与呼吸综合征毒株tjm-f92疫苗弱毒株)的全长感染性cdna克隆和类nadc30亚型毒株fj1402为基础，利用反向遗传技术，构建得到了猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合毒株。该嵌合毒株经试验验证，在marc-145细胞上病毒生长速度及病毒滴度低于其原始毒株tjm-f92，毒力低，对hp-prrsv毒株bb0907及类nadc30毒株fj1402均有较好的免疫保护作用，可对高致病性毒株以及类nadc30毒株感染提供有效的交叉免疫保护，为该病新型广谱疫苗的研制奠定了重要基础。

保藏信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒rtd111/f5-6f5，已于2018年5月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.14762。

附图说明

图1prrsv嵌合毒株感染性克隆构建示意图，(a).以pcmv-tjm为骨架，缺失nsp2表达111个aa的片段，获得ptd111，该图基因上标注的是相应表达323-433位氨基酸的位置；(b).以ptd111为骨架，分别构建嵌合cdna克隆ptd111/f2-7及ptd111/f5-6。

图2prrsv嵌合毒株在marc-145细胞上的空斑形态(a)和生长曲线(b)。

图3prrsv嵌合毒株在pams细胞上的病变(a)和生长曲线(b)。

图4病毒感染pams细胞炎性细胞因子荧光定量pcr测定结果。

图5病毒接种后仔猪体温(a)及平均日增重(b)测定结果。

图6prrsv嵌合毒株接种后仔猪病毒血症(a)及肺脏组织中病毒载量(b)测定结果。

图7接种后14天仔猪肺脏组织病理学观察结果(200×)。

图8仔猪免疫后prrsv特异性抗体检测结果。

图9hp-prrsvbb0907毒株攻毒后仔猪体温变化(a)及生存曲线(b)。

图10hp-prrsvbb0907毒株攻毒后仔猪病毒血症(a)及肺脏和淋巴结组织中病毒载量(b)测定结果。

图11hp-prrsvbb0907毒株攻毒后仔猪肺脏肉眼病理变化和组织病理学变化。

图12prrsv类nadc30毒株fj1402攻毒后仔猪体温变化(a)及生存曲线(b)。

图13prrsv类nadc30毒株fj1402攻毒后仔猪病毒血症(a)及肺脏和淋巴结组织中病毒载量(b)测定结果。

图14prrsv类nadc30毒株fj1402攻毒后仔猪肺脏肉眼病理变化和组织病理学变化。

具体实施方式

本发明采用高致病性猪繁殖与呼吸综合征毒株(简称高致病性prrsv或hp-prrsv)tjm-f92疫苗弱毒株感染性cdna克隆pcmv-tjm，按猪繁殖与呼吸综合征类nadc30毒株(简称类nadc30毒株)nsp2基因特征，在该疫苗毒株的nsp2基因上删除表达第323-433位aa(共111个aa)的片段，构建了感染性cdna克隆ptd111，再以此为骨架，将其orf2-7(orf2、orf3、orf4、orf5、orf6和orf7)及orf5-6(orf5和orf6)分别替换为类nadc30毒株fj1402的相应orfs(开放式阅读框)，构建了感染性cdna克隆ptd111/f2-7和ptd111/f5-6，拯救获得重组病毒rtd111(tjm-f92毒株nsp2缺失111个aa)、嵌合毒株rtd111/f2-7(rtd111毒株orf2-7置换为fj1402毒株orf2-7)和rtd111/f5-6(rtd111毒株orf5-6置换为fj1402毒株orf5-6)，分别传代5次，基因遗传性稳定。rtd111/f2-7和rtd111/f5-6嵌合毒株在marc-145细胞上生长速度及病毒滴度低于其原始tjm-f92毒株，感染pams细胞rtd111/f5-6诱导的先天性免疫细胞因子表达水平与其原始疫苗毒株tjm-f92相似，rtd111/f2-7诱导的先天性免疫细胞因子表达水平明显高于其原始疫苗毒株tjm-f92。将rtd111、rtd111/f2-7、rtd111/f5-6、tjm-f92和fj1402分别接种30～35日龄仔猪，经对猪体临床症状、抗体检测、剖检病变以及病理学观察，结果表明，rtd111/f5-6毒力与tjm-f92相似，明显低于fj1402，而rtd111/f2-7毒力高于rtd111/f5-6。为进一步研究嵌合疫苗候选株rtd111/f5-6的仔猪免疫保护效力，选取30-35日龄健康仔猪，免疫后28d分别利用hp-prrsv毒株bb0907和类nadc30毒株fj1402经肌肉注射攻毒。动物试验结果显示，rtd111/f5-6实验组中bb0907及fj1402毒株感染水平明显降低。上述结果表明，该嵌合毒株具有良好的免疫原性，可对高致病性毒株以及类nadc30毒株感染提供有效的交叉免疫保护，为该病新型疫苗研制奠定了重要基础。

下面，具体列举本发明嵌合毒株的获取方法，以便本领域技术人员对本发明更详细的了解。下述方法中，除非另有说明，否则所用的科学和技术名词具有本领域技术人员通常理解的含义。并且，本文中所用的感染性cdna克隆、细胞培养、细胞转化、病毒转染、病毒拯救、免疫学实验、重组质粒、重组病毒等技术都是本领域已经有报道的技术，其步骤可以采用现有技术中公开的常规步骤进行。

实施例

1材料和方法

1.1病毒、细胞与质粒

prrsv高致病性毒株bb0907及类nadc30毒株fj1402均由本实验室分离鉴定并保存，prrsv疫苗(tjm-f92株)由华威特(泰州)生物工程有限公司武华惠赠，tjm-f92疫苗毒株的感染性cdna克隆质粒pcmv-tjm，由本实验室构建并保存。猪原代肺泡巨噬细胞(pams)参照文献方法制备；marc-145细胞由本实验室液氮冻存,从美国atcc购置。

1.2其他试剂及试验用动物

rna提取试剂盒totalrnakiti购自omega；superscript^tmiiireversetranscriptase购自invitrogen；限制性内切酶asci及spei购自neb；dmem/f12培养基购自维森特；低熔点琼脂(agarose)购自sigma；idexxherdchekprrsx3elisakit购自idexx。30-35日龄prrsv、pcv2、prv和csfv抗体及抗原阴性仔猪，购自江苏省南通市养殖户。

1.3嵌合毒株感染性cdna克隆的构建

1.3.1引物设计

根据tjm-f92毒株及fj1402毒株的基因序列设计引物，引物序列见表1。引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成，纯化方式为rpc。

表1感染性cdna克隆构建引物

上表中，斜体并加下划线的序列表示酶切位点，加粗的序列为fj1402毒株的序列。

上表中，各引物作用如下：

t-a-f和td111aa-r是扩增tjm株a片段111aa缺失位点前段的引物；

td111aa-f和t-a-r是扩增tjm株a片段111aa缺失位点后段的引物；

t-a-f和t-a-r是将tjm株a片段111aa缺失位点前后两段进行融合pcr的引物；

t-d-f和t-1b-r是扩增tjm株d片段orf2前段的引物；

fj-2-f和fj-7-r是扩增fj1402毒株orf2-orf7的引物；

t-3'utr-f，t-d-swai和t-d-spei是扩增tjm株d片段orf7后段的引物；

t-d-f和t-4-r是扩增tjm株d片段orf5前段的引物；

fj-5-f和fj-6-r是扩增fj1402毒株orf5-orf6的引物；

t-7-f，t-d-swai和t-d-spei是扩增tjm株d片段orf6后段的引物。

1.3.2嵌合毒株感染性cdna克隆质粒的构建

prrsvtjm-f92疫苗毒株感染性cdna克隆pcmv-tjm实验室构建的具体步骤参照文献《表达猪圆环病毒2型orf2基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建与鉴定》(张挺杰等，《病毒学报》2015年第1期)。

以实验室构建的prrsvtjm-f92疫苗毒株感染性cdna克隆pcmv-tjm为骨架，按prrsv类nadc30毒株nsp2基因特征，在pcmv-tjm的nsp2基因上删除了表达第323-433位共111个aa的基因片段，构建得到感染性cdna克隆ptd111(图1-a)。具体实验步骤如下：

以pcmv-tjm为模板，分别用t-a-f、td111aa-r和td111aa-f、t-a-r扩增tjm株a片段111aa缺失位点前、后段。随后，以扩片段为模板，用t-a-f和t-a-r为引物，通过soepcr将前、后两段进行融合，得到缺失111aa的a(d111)。用paci和xhoi分别对片段a(d111)和pcmv-tjm进行双酶切，对酶切后的片段和载体进行回收纯化并连接，最终将缺失111aa后的a(111aa)成功替换入pcmv-tjm，获得nsp2缺失了111aa的ptd111。

通过soepcr将ptd111相应片段与fj1402毒株的相应片段融合到一起，分别得到嵌合fj1402毒株orf2-7的重组d片段(td111/f2-7)和嵌合fj1402毒株orf5-6的重组d片段(td111/f5-6)，最终通过双酶切(asci和spei)将改造好的d片段分别替换入ptd111，获得感染性cdna克隆ptd111/f2-7及ptd111/f5-6(图1-b)。具体实验步骤如下：

ptd111/f2-7构建：以ptd111为模板分别扩增d片段中orf2前段及orf7后段，以fj1402毒株的cdna为模板扩增orf2-orf7段，通过融合pcr将三段融合到一起，获得嵌合fj1402毒株orf2-7的d(td111/f2-7)；将d(td111/f2-7)和ptd111分别用asci和spei进行双酶切，将酶切后的片段和载体进行连接，获得ptd111/f2-7。

ptd111/f5-6构建：以ptd111为模板分别扩增d片段中orf5前段及orf6后段，以fj1402毒株的cdna为模板扩增orf5-orf6段，通过融合pcr将三段融合到一起，获得嵌合fj1402毒株orf5-6的d(td111/f5-6)；将d(td111/f5-6)和ptd111分别用asci和spei进行双酶切，将酶切后的片段和载体进行连接，获得ptd111/f5-6。

1.3.3嵌合毒株感染性克隆质粒的鉴定与序列分析

用endo-freeplasmiddnaminikiti提取感染性cdna克隆质粒ptd111，ptd111/f2-7及ptd111/f5-6，并测定嵌合处核苷酸序列，经bioedit软件分析是否存在缺失及突变。

1.4嵌合毒株的拯救及生物学特性分析

1.4.1嵌合毒株的拯救

按照lipofectamine3000说明书的方法，分别将感染性cdna克隆质粒ptd111、ptd111/f2-7和ptd111/f5-6转染于细胞生长密度达70～90％的marc-145细胞，置于37℃、5％co2培养箱中观察培养。待孔内细胞病变cpe达到80％左右时，收获转染细胞，反复冻融、离心，取病毒上清液接入培养48h的单层marc-145细胞连续传代培养。对传代至第5代(f5)的病毒提取rna，以反转录后的cdna为模板扩增orf5基因及nsp2基因送至金斯瑞生物技术有限公司进行测序验证。分别将测序正确的重组病毒命名为rtd111，rtd111/f2-7和rtd111/f5-6。

1.4.2病毒空斑实验及生长曲线测定

收取产生80％cpe的marc-145细胞产物反复冻融3次，用dmem稀释至10^-2至10^-4稀释度。分别取100μl/孔接种至铺满单层marc-145细胞的12孔板，按常规方法进行空斑筛选试验。待出现空斑，挑取空斑接于新的长满单层细胞孔内，纯化病毒3～4次，即可得到稳定和纯化的重组病毒。

将tjm-f92疫苗毒株及拯救的3种嵌合毒株分别以moi＝0.1的剂量接种marc-145细胞，在感染后12h，24h，36h，48h和72h分别收取细胞上清液测定tcid50，根据不同时间点的病毒滴度绘制病毒一步生长曲线(每种病毒每个时间点设置3个平行孔)。

1.5嵌合毒株对原代pams先天性免疫细胞因子的诱导作用

为了解猪肺泡巨噬细胞pams感染嵌合毒株后产生主要细胞因子的变化，进一步阐明嵌合毒株的感染机制。选取prrsv、pcv2和prv抗原和抗体均为阴性的普通断奶仔猪，分离和培养pams，将各病毒(tjm-f92，rtd111，rtd111/f2-7和rtd111/f5-6)分别以moi＝0.1的剂量接种细胞(每种病毒每个时间点设置3个平行孔)，同时设置不接毒mock对照孔。在病毒接种后不同时间点(6h、12h、24h、36h、48h和72h)分别收取细胞上清，用real-timepcr检测各种细胞因子mrna水平并测定病毒的滴度，绘制病毒一步生长曲线。

1.6嵌合毒株疫苗候选株对仔猪的致病性试验

将30头prrsv阴性仔猪随机均分为六组(n＝5)。第1-5组分别注射rtd111、rtd111/f2-7、rtd111/f5-6、tjm-f92、fj1402的病毒液，注射量为：每头猪肌肉注射3ml10⁵tcid50/ml病毒液，第6组注射等体积的pbs，14d内观察仔猪体温及临床症状。并在免疫后7d、14d采血，血清用于测定病毒血症。免疫后14d，对所有仔猪进行扑杀剖检，对肺脏进行大体病理变化观察，取肺脏组织冻存用于病毒载量测定；另取部分肺脏组织用4％多聚甲醛固定进行病理学观察。

1.7嵌合毒株疫苗候选株的免疫保护性试验

将30头prrsv阴性仔猪随机均分为3组(n＝10)，隔离饲养。其中一组每头猪肌肉注射3mltjm-f92(10⁵tcid50/ml)，另一组每头猪肌肉注射3mlrtd111/f5-6(10⁵tcid50/ml)，最后一组每头猪肌肉注射3mlpbs，每天观察猪体的临床症状。免疫后7d、14d、21d和28d采血进行免疫原性试验。免疫后28d，每组5头采用prrsv高致病性毒株bb0907攻击、5头采用类nadc30亚型毒株fj1402攻击，4ml/头。攻毒后，每天观察猪体状态，测定直肠温度，分别在攻毒后的7d、14d和21d采血测定病毒血症。攻毒后21d，对所有仔猪进行扑杀剖检，对肺脏进行大体病理变化观察，取肺脏组织及扁桃体用于病毒载量的测定及组织病理学观察。

2结果

2.1嵌合毒株的生物学特性鉴定

如图2所示，三种重组病毒rtd111，rtd111/f2-7和rtd111/f5-6的空斑形态及大小相似，与亲本毒株tjm-f92无明显差异。生长曲线结果显示，rtd111的生长特性与亲本毒株相比基本一致，仅在个别时间点有差异。但嵌合毒株rtd111/f2-7和rtd111/f5-6在marc-145细胞中的生长滴度峰值位于感染后48h，均低于亲本毒株tjm-f92及重组病毒rtd111的病毒感染滴度。

2.2嵌合毒株感染pams特性

pams接种tjm-f92、rtd111、rtd111/f2-7及rtd111/f5-6毒株后均出现明显病变，表现为细胞边缘粗糙，有局部聚堆(图3-a)。一步生长曲线结果显示，重组病毒rtd111、rtd111/f2-7及rtd111/f5-6与亲本株tjm-f92在pams细胞的生长特性也基本一致(图3-b)。

接毒后6h、12h、24h，采用荧光定量real-timepcr方法检测il-6、tnf-α、ifn-β及ifn-γ的mrna表达水平，结果显示，重组毒株rtd111诱导炎性因子的水平与tjm-f92毒株无明显差异(p＞0.05)，而rtd111/f2-7对炎性因子mrna水平的上调作用最为显著(p＜0.05)，rtd111/f5-6对细胞因子的诱导水平则介于rtd111与rtd111/f2-7之间(图4)。

2.3嵌合病毒疫苗候选株对仔猪的致病性试验

2.3.1临床变化

仔猪接种3ml(10⁵tcid50/ml)rtd111、rtd111/f2-7、rtd111/f5-6、tjm-f92、fj1402病毒液后，试验组仔猪均未出现明显临床异常症状，平均体温维持在39.5～40℃左右之间。进一步对免疫后仔猪第0d和14d体重数据进行统计，结果显示嵌合病毒免疫组及pbs组仔猪的平均日增重亦无明显差异(p＞0.05)，见图5。

2.3.2病毒血症及病毒载量测定

用荧光定量pcr方法检测各病毒接种后血清中prrsv载量，结果如图6-a，rtd111/f5-6、rtd111和tjm-f92免疫组仔猪prrsv病毒血症水平相似(p>0.05)，而rtd111/f2-7免疫组略高于上述三种病毒引起的病毒血症水平。肺脏组织中病毒载量检测结果如图6-b，rtd111/f2-7、rtd111/f5-6、rtd111和tjm-f92各免疫组仔猪肺脏中病毒载量与fj1402攻毒对照组相比明显降低(p<0.05)。

2.3.3组织病理学观察

接种后14d扑杀所有仔猪，采集肺脏组织，制备组织切片，观察组织病理学变化，结果为：rtd111/f5-6、rtd111及tjm-f92组只表现轻度病变，肺泡结构完整，肺泡间隔略有增厚，而rtd111/f2-7与fj1402组均明显表现出间质性肺炎病变，炎性细胞增多或红细胞浸润，肺泡壁增厚较为明显(图7)。表明rtd111/f5-6致病性很低，而rtd111/f2-7有一定致病性。

2.4嵌合疫苗候选株的免疫保护效力

2.4.1免疫抗体测定

对采集的不同时间点免疫猪血清用idexxprrsx3elisa试剂盒进行抗体检测。结果表明，嵌合毒株rtd111/f5-6与亲本疫苗株tjm-f92的免疫效果相当(p>0.05)，均能有效激发仔猪的抗体免疫应答。pbs组仔猪血清prrsv抗体则始终为阴性(s/p＜0.4)(图8)。

2.4.2hp-prrsvbb0907毒株攻毒试验结果

2.4.2.1临床症状

hp-prrsvbb0907毒株攻毒后，未免疫仔猪出现明显高热症状(≥40℃)，持续时间较久，精神萎靡，食欲不振，并最终死亡2头。嵌合毒株rtd111/f5-6和亲本疫苗株tjm-f92免疫后仔猪体温无明显升高和临床症状，全部健活(图9)。评价结果表明：嵌合毒株rtd111/f5-6对prrsv强毒株bb0907的攻击有良好的保护作用。

2.4.2.2病毒血症及组织病毒载量

荧光定量pcr方法检测攻毒后prrsv载量，结果如图10-a，rtd111/f5-6免疫组和亲本疫苗株tjm-f92免疫组仔猪prrsv病毒血症水平相近(p>0.05)，均显著低于未免疫组(p<0.05)。

肺脏组织与淋巴结中病毒载量检测结果如图10-b，rtd111/f5-6免疫组仔猪肺脏及淋巴结中病毒载量与亲本疫苗株tjm-f92相似(p>0.05)，均显著低于未免疫对照组(p<0.05)，表明rtd111/f5-6免疫能够降低hp-prrsvbb0907毒株的感染水平。

2.4.2.3肺脏病理学观察

攻毒后21d扑杀仔猪，肺脏肉眼病理变化见图11，与未免疫攻毒对照组相比，rtd111/f5-6和tjm-f92免疫组仔猪肺脏无明显肉眼病变。肺脏组织学观察结果显示，rtd111/f5-6和tjm-f92免疫组肺泡结构完整，肺泡间隔增厚不明显。上述结果表明，rtd111/f5-6免疫仔猪能够有效降低hp-prrsvbb0907毒株引起的临床症状和病理变化。

2.4.3prrsv类nadc30毒株fj1402攻毒试验结果

2.4.3.1临床症状

fj1402毒株攻毒后，未免疫组仔猪体温明显升高(≥40℃)，死亡1头，tjm-f92免疫仔猪也出现发热(≥40℃)，无死亡现象，rtd111/f5-6免疫仔猪无明显临床症状(图12)，表明rtd111/f5-6免疫能够有效抵抗类nadc30毒株fj1402的攻击。

2.4.3.2病毒血症及组织病毒载量

荧光定量pcr方法检测攻毒后prrsv载量，结果如图13-a，tjm-f92免疫组和未免疫组仔猪prrsv病毒血症水平相似(p>0.05)，rtd111/f5-6免疫组病毒血症则显著低于未免疫组(p<0.05)。

肺脏组织与淋巴结中病毒载量检测结果显示，tjm-f92免疫组仔猪肺脏中病毒载量与未免疫攻毒对照组差异不显著(p>0.05)，而rtd111/f5-6免疫组病毒载量显著低于未免疫对照组(p<0.05)(图13-b)，说明rtd111/f5-6免疫能够降低fj1402毒株的感染水平，而tjm-f92疫苗株的保护效果相对较差。

2.4.3.3肺脏病理学观察

如图14所示，攻毒后21d扑杀仔猪，tjm-f92免疫组和未免疫攻毒对照组仔猪肺脏均出现明显肿大，弥漫性和局灶样实变，肺脏色泽暗红。组织学检查表现间质性肺炎，肺泡壁增厚，炎性细胞增多，或红细胞浸润。rtd111/f5-6免疫组仔猪肺脏无明显肉眼病变，组织学检查表现轻度病变，肺泡结构完整，肺泡间隔稍有增厚。

上述结果表明，rtd111/f5-6免疫仔猪能够有效降低prrsv类nadc30毒株fj1402的攻击，而tjm-f92则不能完全提供对fj1402毒株感染的临床保护作用。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合毒株及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>14631

<212>dna

<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusrtd111/f5-6f5cgmccno.14762)

<400>1

atgacgtataggtgttggctctatgccacggcatttgtattgtcaggagctgtgaccata60

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