一种自给式双功能生物催化剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种自给式双功能生物催化剂及其制备方法和应用。

背景技术：

(r)-3-奎宁醇(分子式c7h13no，分子量为127.18，cas号：25333-42-0)是合成阿地溴铵、瑞伐托酯、索利那新和戊乙奎醚等上市药物的关键中间体。目前工业上主要是利用手性催化剂不对称氢化3-奎宁酮合成(r)-3-奎宁醇，如：xylskewphos/pica-ruthenium(ii)复合物或binap/iphan-ru(ii)复合物等。化学合成方法的主要缺陷：(1).所用的过渡金属价格昂贵、毒性较大、难以从产物中去除；(2).需耗时筛选、合成手性配体；(3).制备的产物光学纯度较低，需进一步纯化。另一种方法是拆分外消旋体(dl)-3-奎宁醇酯，但拆分法的最大理论产率只有50％。

生物合成法具有立体选择性高、环境友好、反应条件温和、催化活性高等独特优势。生物合成(r)-3-奎宁醇的方法主要包括底物偶联和酶偶联两种。酶偶联方法就是羰基还原酶借助还原型辅酶(nadh或nadph)将3-奎宁酮还原为(r)-3-奎宁醇，同时产生氧化型辅酶(nad⁺或nadp⁺)。由于需要使用昂贵的辅酶，因此，须再利用辅酶再生酶将氧化型辅酶转化为还原型辅酶，实现辅酶循环利用，以降低生产成本。酶偶联不对称合成(r)-3-奎宁醇的生物催化过程如图1所示，酶偶联是在两个独立菌体中分别完成羰基还原和辅酶再生两个过程，辅酶必须在两个不同菌体之间转运，但受菌体自身结构限制和自由扩散影响，辅酶在两个菌体间转运受阻，传质阻力导致生物转化时间长，催化效率低，生产周期长，成本增加，不利于工业化。

技术实现要素：

为了解决现有技术中的问题，根据本发明的第一方面，本发明的目的在于提供一种生物催化剂，该生物催化剂在单个细胞中同时完成羰基还原和辅酶再生两个过程，生物转化时间短，催化效率高。

本发明的目的是这样实现的：

一种自给式双功能生物催化剂，其特征在于：包含nadh依赖的3-奎宁酮还原酶(mlqr)、葡萄糖脱氢酶(gdh)和柔性连接子，其中柔性连接子的两端分别连接nadh依赖的3-奎宁酮还原酶(mlqr)和葡萄糖脱氢酶(gdh)；所述柔性连接子为(ggggs)n，其中n为1-5。

本发明柔性连接子为(ggggs)n，其中n为1-5。当n＝1时，本发明自给式双功能酶生物催化剂的氨基酸序列如seqidno：1所示。

本发明自给式双功能生物催化剂为同时具有羰基还原和辅酶原位再生能力的高表达一单链融合酶的大肠杆菌全细胞。

本发明自给式双功能酶在大肠杆菌中高表达，并直接以此全细胞作为生物催化剂，在单个细胞中同时完成羰基还原和辅酶再生两个过程(如图2所示)，本发明生物催化剂再生辅酶，为羰基还原过程提供所需辅酶，完成自给式辅酶供给，实现辅酶循环利用以降低生产成本。本发明有利于降低辅酶的传质阻力、减少参加生物转化所需酶的数量和降低酶纯化成本。发明人还意外发现，本发明生物催化剂稳定性好，催化活性高，羰基还原酶活性为3678u/g，辅酶再生酶的活性为5070u/g，催化转化底物的浓度最大可达486g/l，相应的时空产率为1505.5g·l^-1d^-1；同时长期储存稳定性也好，生物催化剂-20℃保持4个月，其催化活性无明显变化。

根据本发明的第二方面，本发明的另一目的在于提供上述自给式双功能生物催化剂的制备方法。

根据本发明的一个实施方案，上述自给式双功能生物催化剂的制备方法，其特征在于，采用如下步骤：

步骤(1)

用基因重组技术，将编码羰基还原酶(mlqr)的全长基因mlqr和编码葡萄糖脱氢酶(gdh)的全长基因gdh通过柔性连接子连接，形成编码自给式双功能融合酶(mlg)的融合基因mlg；

步骤(2)

将步骤(1)制备的融合基因mlg连接到表达载体pet28a上，形成表达质粒pet28a-mlg；

步骤(3)

将步骤(2)形成的表达质粒pet28a-mlg转入感受态细胞e.colibl21(de3)，于含卡拉霉素的luria-bertani(lb)液体培养基中诱导表达融合酶mlg，离心收集菌体，用缓冲溶液洗涤，既得。

本发明所述的lb液体培养基含1％蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化钠；所述的lb液体培养基的ph为7.0-8.0；所述的卡拉霉素的浓度为50-200mg/l；所述的诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷的浓度为0.1-0.8mm；所述的培养时间为12-48小时；所述的培养温度为18-40℃；所述的缓冲溶液为10mm磷酸缓冲盐溶液(pbs)，含nacl137mm，kcl2.7mm，na2hpo410mm，kh2po42mm。

根据本发明的第三方面，本发明的另一目的在于提供上述自给式双功能生物催化剂在合成(r)-3-奎宁醇中的应用。

根据本发明的第四方面，本发明的另一目的在于提供一种(r)-3-奎宁醇的合成方法，该方法使用上述自给式双功能生物催化剂，催化不对称合成(r)-3-奎宁醇。

根据本发明的一个实施方案，一种(r)-3-奎宁醇的合成方法，其特征在于：将自给式双功能生物催化剂分散在缓冲溶液中，加入3-奎宁酮，葡萄糖和nad⁺，在20-40℃条件下，ph为7.0-8.0，以50～150rpm转速振荡，生物转化时间为1-12h；所述缓冲溶液的ph值为7.2-7.4。

根据本发明的一个实施方案，所述缓冲溶液为10mm磷酸缓冲盐溶液(pbs)，含nacl137mm，kcl2.7mm，na2hpo410mm，kh2po42mm。

具体的，一种(r)-3-奎宁醇的生物催化合成方法，包括如下步骤：

步骤(1)

用基因重组技术，将编码羰基还原酶的全长基因mlqr和编码葡萄糖脱氢酶的全长基因gdh通过柔性连接子连接，形成编码自给式双功能酶的全长融合基因mlg；

步骤(2)

将步骤(1)制备的融合基因mlg连接到载体pet28a上，形成表达质粒pet28a-mlg；

步骤(3)

将步骤(2)形成的表达质粒pet28a-mlg转入感受态细胞e.colibl21(de3)，于含卡拉霉素的luria-bertani液体培养基中诱导e.colibl21(de3)过表达融合酶mlg，离心收集菌体，用缓冲溶液洗涤，制得自给式双功能生物催化剂；

步骤(4)

将自给式双功能生物催化剂分散在缓冲溶液中，加入3-奎宁酮，葡萄糖和nad⁺，在20-40℃条件下，ph为7.0-8.0，以50～150rpm转速振荡，生物转化时间为1-12h；所述缓冲溶液为10mm磷酸缓冲盐溶液(pbs)，含nacl137mm，kcl2.7mm，na2hpo410mm，kh2po42mm，ph值为7.2-7.4。

有益效果：

1、本发明基于基因重组技术将羰基还原酶和辅酶再生酶通过柔性连接子连接，形成新的单链双功能融合酶，具有羰基还原和辅酶原位再生能力。

2、使用本发明生物催化剂作为自给式双功能酶催化剂，用于(r)-3-奎宁醇的生物催化合成，可同时实现羰基还原和辅酶原位再生，可实现辅酶循环再利用，无需按照化学反应计量添加昂贵的辅酶nadh。同时本发明的自给式双功能酶生物催化剂具有长期储存稳定性。

3、本发明的自给式双功能酶生物催化剂，催化活性高，催化转化底物的浓度为81-486g/l，时空产率为2760.2-1505.5g·l^-1d^-1。工艺条件温和，成本低。

4、使用本发明自给式双功能酶生物催化剂不对称合成(r)-3-奎宁醇，收率高达80-95％，转化率为100％，对映体值为100％，经济效益大。本发明生物催化不对称合成(r)-3-奎宁醇所用介质为水，革除使用有机溶剂，环境友好，符合绿色化学的要求，可以节约资源，适合工业化。

附图说明

图1是酶偶联不对称合成(r)-3-奎宁醇的生物催化过程；

图2是自给式双功能全细胞催化不对称合成(r)-3-奎宁醇的生物转化过程；

图3是自给式双功能酶生物催化剂的sds-page分析；

图4是温度对自给式双功能酶生物催化剂的催化活性的影响；

图5是ph值对自给式双功能酶生物催化剂的催化活性的影响；

图6是葡萄糖/底物摩尔比对自给式双功能酶生物催化剂催化活性的影响；

图7是辅酶浓度对自给式双功能酶生物催化剂的催化活性的的影响；

图8是自给式双功能酶生物催化剂的长期储存稳定性分析。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。本发明所有原料及试剂均为市售产品。本发明所用羰基还原酶为nadh依赖的特异性的3-奎宁酮还原酶(mlqr,accessionno:ab733448)，辅酶再生酶为葡萄糖脱氢酶(gdh,accessionno:ay930464)。

实施例1酶活性测定

自给式双功能融合酶中羰基还原酶活性的测定：

标准反应混合体系：缓冲溶液(pbs，ph7.2-7.4)，3μmol3-奎宁酮，0.3μmolnadh，适量的自给式双功能生物催化剂，总体积1ml。在λ＝340nm处测定吸光度值变化。酶活性单位定义：25℃，1min内转化1μmolnadh所需的酶量。

自给式双功能融合酶中辅酶再生酶活性的测定：

标准反应混合体系：缓冲溶液(pbs，ph7.2-7.4)，10μmol葡萄糖，1μmolnad⁺，适量的自给式双功能生物催化剂，总体积1ml。在λ＝340nm处测定吸光度值变化。酶活性单位定义：25℃，1min内转化1μmolnad⁺所需的酶量。

实施例2

自给式双功能融合酶的表达

取表达质粒pet28a-mlg转化感受态大肠杆菌e.colibl21(de3)，接种含100μg/ml卡拉霉素的lb固体培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠和1.5％琼脂糖)，37℃过夜培养。挑选单克隆菌落接种lb液体培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化钠)，37℃，转速150rpm，过夜培养。将培养液按1:50接种lb液体培养基，37℃，转速150rpm，培养至od600约为0.6-1.0。加入0.2mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导自给式双功能融合酶表达，培养温度为25℃，转速150rpm，培养时间36小时。4℃，10000rpm离心收集菌体，用缓冲溶液洗涤，得自给式双功能酶全细胞生物催化剂。本发明柔性连接子为(ggggs)n，其中n为1-5。当n＝1时，本发明自给式双功能酶生物催化剂的氨基酸序列如seqidno：1所示，具体如下：

对实施例2制备的自给式双功能酶生物催化剂进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析

sds-page分析结果见附图3。图中m为标准蛋白质分子量；l1为表达自给式双功能融合酶mlg的重组大肠杆菌；l2为重组大肠杆菌的细胞裂解混合上清液；l3为亲和色谱纯化流穿液；l4和l5为亲和色谱纯化用250mm和500mm咪唑的洗脱液。在分子量55-70kda之间，出现明显的蛋白质条带，即为双功能融合酶，目标蛋白纯度90％以上，可用于酶固定。

参照实施例2的制备方法，考察温度、ph值、葡萄糖/底物摩尔比和辅酶浓度对自给式双功能酶生物催化剂的催化活性的影响。

温度对自给式双功能酶生物催化剂的催化活性的影响结果见附图4。当转化温度从20℃上升到30℃时，生物催化剂的催化活性增大。当转化温度超过30℃时，生物催化剂的催化活性明显减低，表明自给式双功能酶生物催化剂适宜的稳定为30℃。

ph对自给式双功能酶生物催化剂的催化活性的影响结果见附图5。转化温度30℃，当ph值从5.0上升到6.0时，生物催化剂的活性增大。当ph值从6.0上升到8.0时，生物催化剂活性稳定，并达到最大值。当ph值超过8.0时，生物催化剂的活性降低。表明，自给式双功能酶生物催化剂适宜的ph为7.0-8.0。

葡萄糖/底物摩尔比对自给式双功能酶生物催化剂的催化活性的影响结果见附图6。当摩尔比从0.5增加到1.5时，生物催化剂的活性增大。当超过1.5时，催化剂活性无明显变化。表明，自给式双功能酶生物催化剂适宜的葡萄糖/底物摩尔比为1.5。

辅酶浓度对自给式双功能酶生物催化剂的催化活性的影响结果见附图7。当辅酶浓度从0.1mm增加到0.2mm时，生物催化剂的活性增大。当超过0.2mm时，催化剂活性无明显变化。表明，自给式双功能酶生物催化剂适宜的辅酶浓度为0.2mm。

对实施例2制备的自给式双功能酶生物催化剂进行长期储存稳定性分析

自给式双功能酶生物催化剂长期储存稳定性分析结果见附图8。生物催化剂-20℃保持4个月，其催化活性无明显变化，表明，自给式双功能酶生物催化剂具有良好的长期储存稳定性。

实施例3

生物催化剂催化不对称合成(r)-3-奎宁醇：

反应体系：80mg生物催化剂，5mm3-奎宁酮，9mm葡萄糖,0.2mmnad⁺，缓冲溶液a(10mm磷酸缓冲盐溶液，pbs，含nacl137mm，kcl2.7mm，na2hpo410mm，kh2po42mm，ph值为7.2-7.4)，总体积10ml。反应温度30℃，以100rpm连续搅拌，反应过程中ph控制在7.5-8.0.用tlc监控反应，流动相为v二氯甲烷/v甲醇＝9/1。生物转化完成后，加入0.1g三氟乙酸除蛋白，将反应混合物离心。上清液用高浓度naoh调节至ph值大于12，然后在80℃减压浓缩至总体积的1/4。加入等体积的正丁醇抽提3次，收集有机相，减压浓缩蒸干。在90℃，用甲苯溶解固体，难溶物趁热过滤，滤液冷却，有白色针状晶体出现，过滤，得白色固体。

¹h-nmr(600mhz，cdcl3)分析：δ4.81(s,1h)，3.78(m,1h)，3.10(m,1h)，2.90(m,1h)，2.66(m,4h)，1.95(m,1h)，1.78(m,1h)，1.69(m,1h)，1.46(m,1h)，1.34(m,1h)。

¹³cnmr分析：δ67.1(ch)，57.9(ch2)，47.3(ch2)，46.3(ch2)，28.3(ch),24.7(ch2)，18.9(ch2)。

产物的理论分子量为：127.18，质谱测定为：127。

参照实施例3，考察底物和催化剂的用量对转化时间、转化率和对映体值的影响，具体见下表1。

当生物催化剂用量为8g/l，随底物量增大，生物转化时间从0.5h增加到8.0h，转化率和对映体值均为100％。当底物用量为243g/l时，不用辅酶，转化时间为24h，转化率只有61％，对映体值为100％。当底物用量为486g/l时，转化时间为5.5h，转化率100％，对映体值为100％；当辅酶减半时，转化时间为8.5h，转化率100％，对映体值为100％。表明底物用量影响生物催化剂的活性，转化时间延长，但不影响其立体选择性。

在进一步的研究中，本发明柔性连接子为(ggggs)n，其中n为2-5时，本发明作为生物催化剂稳定性，也具有较强的羰基还原和辅酶原位再生能力，用于(r)-3-奎宁醇的生物催化合成，可同时实现羰基还原和辅酶原位再生，可实现辅酶循环再利用，无需按照化学计量反应添加昂贵的辅酶nadh。同时本发明的自给式双功能酶生物催化剂具有长期储存稳定性，且工艺条件温和，生物催化不对称合成(r)-3-奎宁醇所用介质为水，革除使用有机溶剂，环境友好，符合绿色化学的要求，可以节约资源，同时成本低，适合工业化。

说明书序列表

<110>重庆医科大学

<120>一种自给式双功能生物催化剂及其制备方法和应用

<160>1

<210>1

<211>524

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸序列

<400>1

hishishishishishismetargleugluasnlyslysalaileval

151015

thrglyglyalaglyglyileglyargalathrserilealaleuala

202530

alagluglyalaalavalalavalvalaspleuasnvalglualaala

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